劉巖，胡志飛，黃帶發(fā)，李斯琪，劉兵，李紅帥，劉艷霞

1.國(guó)家老年疾病臨床研究中心 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心干二科，沈陽(yáng) 110016;2.杭州佰辰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司

胰島素靶器官或組織對(duì)內(nèi)源性或外源性胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低就會(huì)發(fā)生全身或局部的胰島素抵抗(IR)[1]。臨床研究[2]發(fā)現(xiàn)，約25%的正常人群存在IR，糖耐量減低人群75%存在IR，2型糖尿病(T2DM)患者IR的發(fā)生率為85%左右。IR受多種因素影響，有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)胰島素的分子結(jié)構(gòu)功能異常、胰島素的拮抗激素分泌過多、胰島素受體的數(shù)量下降及結(jié)構(gòu)功能受損等因素，都會(huì)影響胰島素的生物活性以及與受體的結(jié)合從而導(dǎo)致IR的發(fā)生[3-4]。此外，如Glut4基因突變、葡萄糖激酶基因突變、某些微量元素缺乏如鉻和釩缺乏、腫瘤壞死因子α(TNF-α)增多等也均易導(dǎo)致IR[5]。如何對(duì)IR進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)和治療，是IR預(yù)防與治療面臨的主要難題。

兒茶酚胺(CAs)是由腎上腺髓質(zhì)和一些交感神經(jīng)元嗜鉻細(xì)胞分泌的一類重要的神經(jīng)遞質(zhì)或激素物質(zhì)，主要包括腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)等。應(yīng)激狀態(tài)下、長(zhǎng)時(shí)間和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，交感神經(jīng)興奮，機(jī)體血漿CAs的濃度會(huì)顯著升高[6]。目前有研究[7]發(fā)現(xiàn)在與IR相關(guān)的疾病患者體內(nèi)CAs類物質(zhì)的含量顯著高于健康人群，但是這些研究都存在著不少缺陷，臨床樣本數(shù)較少，且關(guān)于CAs檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、靈敏度和特異性還有待于進(jìn)一步提高。本研究基于UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)血漿中CAs及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定，并進(jìn)一步研究CAs及其代謝物與T2DM患者IR的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年10月至2020年10月在北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院就診的T2DM伴IR患者105例(IR組)，同期健康對(duì)照者95例(CO組)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)知情同意并能遵守研究方案要求；(2)年齡>18歲。IR組：符合2018年ADA中T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)≥2.69。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)注射胰島素或口服磺脲類藥物者；(2)有腎上腺疾病者；(3)近3個(gè)月服用過影響CAs檢測(cè)的藥物(三環(huán)類抗抑郁藥物、影響交感神經(jīng)類藥物、潑尼松、苯丙胺、單胺氧化酶抑制劑等)；(4)近3個(gè)月內(nèi)心絞痛發(fā)作、肺部感染、嚴(yán)重心力衰竭、嚴(yán)重腦血管疾病、惡性腫瘤；急性消化道潰瘍；酗酒者；(5)肝功能異常：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶均為正常值1.5倍以上；(6)腎功能異常：肌酐清除率<30 mL/min；(7)血白細(xì)胞計(jì)數(shù)<4.0×109/L，血小板計(jì)數(shù)<100×109/L，血紅蛋白<90 g/L或有其他血液系統(tǒng)疾病者；(8)未控制的高血壓(血壓達(dá)到140/90 mmHg)及嚴(yán)重急性高血糖者；(9)精神病患者。

1.3 研究方法 測(cè)定體質(zhì)指數(shù)(BMI)、收縮壓、舒張壓、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐清除率、血糖等基線資料。采用UPLC-MS/MS法檢測(cè)患者血漿中CAs及其代謝物[DA、E、NE、變腎上腺素(MN)、去甲變腎上腺素(NMN)、高香草酸(HVA)、香草扁桃酸(VMA)]的濃度范圍、精密度、回收率等。

1.4 主要儀器與試劑 超高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters)；ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)，Waters)；CV100-DNA真空離心濃縮儀(中國(guó)，北京吉艾姆)，兒茶酚胺及兒茶酚胺代謝產(chǎn)物樣本釋放劑(中國(guó)，杭州佰勤醫(yī)療器械有限公司)，色譜甲醇(美國(guó)，Merck)，色譜乙腈(美國(guó)，Merck)，甲酸(中國(guó)，阿拉丁)，乙酸銨(中國(guó)，麥克林)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本制備 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品DA、NE、E、MN、NMN、HVA、VMA分別配制成1 mg/mL母液；混合并稀釋得到不同濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本，濃度范圍在1.1～326.49 nmol/L之間，然后各取25 μL溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本，對(duì)應(yīng)加入225 μL兒茶基質(zhì)液，得到一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本250 μL，測(cè)定濃度并繪制曲線，濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，根據(jù)線性方程式，獲得R值均大于0.99，結(jié)果呈良好的線性關(guān)系，且具有很寬的線性范圍，可以更好地滿足臨床應(yīng)用需求，見圖1。

1.6 LC-MS/MS條件 (1)色譜柱：BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；(2)流動(dòng)相：0.1%甲酸-10 mM乙酸銨溶液(A相)和0.1%甲酸-乙腈溶液(B相)；(3)梯度洗脫;(4)進(jìn)樣量及質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)：10 μL；柱溫：40 ℃；(5)質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管(Capillary)：3.2 kV，錐(Cone)：50 V，去溶劑溫度(Desolvation Temp)500 ℃，去溶劑(Desolvation)：900 L/Hr，各化合物的母離子、子離子、駐留時(shí)間、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，見表1。

表1 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

1.7 精密度與加標(biāo)回收率 本研究檢測(cè)指標(biāo)定量下限在0.11～0.15 nmol/L，批內(nèi)和批間精密度即變異系數(shù)(CV)均在15%以內(nèi)，加標(biāo)測(cè)試平均回收率在88%～105%，符合臨床檢測(cè)方法學(xué)準(zhǔn)確定量標(biāo)準(zhǔn)，見表2。檢測(cè)方法中無須使用固相萃取板，成本較低，可同時(shí)檢測(cè)包括CAs(DA、NE、E)和其中間產(chǎn)物(NMN、MN)以及代謝終產(chǎn)物(HVA、VMA)在內(nèi)共7個(gè)指標(biāo)，能充分滿足臨床實(shí)際應(yīng)用中需同時(shí)準(zhǔn)確定量?jī)翰璺影废嚓P(guān)指標(biāo)的要求。

表2 批內(nèi)、批間精密度和加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

注：VMA為香草扁桃酸；HVA為高香草酸；MN為變腎上腺素；NMN為去甲變腎上腺素；NE為去甲腎上腺素；E為腎上腺素；DA為多巴胺。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般情況比較 兩組平均收縮壓、舒張壓、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐清除率等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IR組BMI明顯高于CO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IR組血糖明顯高于CO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IR組平均血糖為(7.37±1.23)mmol/L，見表3。

表3 兩組一般臨床資料對(duì)比

2.2 兩組受試者CAs及代謝物水平比較 IR組E、NE、MN、NMN、HVA、VMA較CO組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IR組DA水平較CO組有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 兩組CAs及其代謝產(chǎn)物比較

3 討論

IR患者為維持正常血糖，反饋性刺激胰島素分泌增加，高胰島素血癥可使交感神經(jīng)活性增高[8]。若交感神經(jīng)興奮時(shí)間較長(zhǎng)，可促進(jìn)CAs及其代謝產(chǎn)物的合成[9]。近年來關(guān)于IR方面的研究主要基于糖尿病本身或側(cè)重于CAs的監(jiān)測(cè)[10-11]，CAs作為評(píng)價(jià)人體交感神經(jīng)功能的重要指標(biāo)，其檢測(cè)的準(zhǔn)確性尤為重要。目前臨床常規(guī)CAs檢測(cè)的方法主要是免疫法，包括放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)，均存在不同程度的缺點(diǎn)，如靈敏度低、重現(xiàn)性差、特異性差、要求樣本量多等。UPLC-MS/MS法靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、分析時(shí)間短、能同時(shí)分析多組分混合物，已逐漸成為國(guó)際上包括CAs在內(nèi)的小分子水平檢測(cè)的主流技術(shù)[12]。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用UPLC-MS/MS技術(shù)評(píng)估CAs水平的研究還多限于科學(xué)研究，真正用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)人體內(nèi)CAs與臨床疾病的相關(guān)性研究還相對(duì)較少。本研究應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)患者血漿中CAs(DA、E、NE)及其代謝產(chǎn)物(MN，NMN，HVA，VMA)濃度范圍在1.1～326.49 nmol/L之間，線性關(guān)系良好。各指標(biāo)定量下限在0.11～0.15 nmol/L，批內(nèi)和批間精密度測(cè)試結(jié)果CV均在15%以內(nèi)，加標(biāo)測(cè)試平均回收率在88%～105%內(nèi)，符合臨床檢測(cè)方法學(xué)準(zhǔn)確定量標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)方法中無須使用固相萃取板，成本較低，可同時(shí)檢測(cè)包括CAs(DA、NE、E)和其中間產(chǎn)物(NMN、MN)以及代謝終產(chǎn)物(HVA、VMA)在內(nèi)的7個(gè)指標(biāo)，能充分滿足臨床實(shí)際應(yīng)用中需同時(shí)準(zhǔn)確定量CAs相關(guān)指標(biāo)的要求，結(jié)果更為準(zhǔn)確，適合臨床推廣。

人體CAs水平會(huì)受到不同因素的影響，尤其是年齡、性別、血壓等[13]。在本研究中，兩組研究對(duì)象在年齡、性別、血壓控制等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，排除了混雜因素的影響。有研究[7]表明CAs參與急性期血糖的調(diào)節(jié)，包括刺激腎葡萄糖釋放、抑制胰島素分泌、刺激胰高糖素分泌增加、糖異生，底物供應(yīng)刺激脂解和降低組織葡萄糖攝取有關(guān)。本研究中IR組血糖較CO組明顯增高(P<0.05)，但I(xiàn)R組平均血糖為(7.96±1.04)mmol/L，未有嚴(yán)重急性期高血糖，排除了急性期高血糖對(duì)CAs的影響。有研究[14]表明BMI與IR抗之間存在密切相關(guān)性，肥胖人群更容易發(fā)生IR，本研究中IR組BMI明顯高于CO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與相關(guān)報(bào)道相符。

CAs主要來源于交感神經(jīng)末梢和腎上腺髓質(zhì)，這兩個(gè)部位均會(huì)產(chǎn)生NE，而E僅產(chǎn)生于腎上腺髓質(zhì)；糖尿病伴IR患者可能出現(xiàn)腎上腺髓質(zhì)交感神經(jīng)通路異常，伴隨著CAs水平的異常[15]，IR常伴隨著反調(diào)節(jié)胰島素激素(皮質(zhì)醇、生長(zhǎng)激素、CAs)分泌過多，而抑制體內(nèi)CAs水平，從而降低交感神經(jīng)活性，改善IR[16]。本研究中T2DM伴IR患者血漿CAs(NE和E)及CA s代謝產(chǎn)物(MN、NMN、HVA和VMA)水平明顯高于健康對(duì)照者，與相關(guān)報(bào)道[17]一致。

DA是腦內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，中腦黑質(zhì)致密部的DA神經(jīng)元投射至背側(cè)紋狀體調(diào)控軀體運(yùn)動(dòng)，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)DA神經(jīng)元投射至腹側(cè)紋狀體，參與情緒、動(dòng)機(jī)及獎(jiǎng)賞行為的調(diào)節(jié)[18]。IR使外周血胰島素水平升高，外周胰島素可通過其轉(zhuǎn)運(yùn)體穿過血腦屏障進(jìn)入中樞，接受胰島素刺激后DA分泌顯著增加[19]。但長(zhǎng)期的IR，神經(jīng)細(xì)胞也可對(duì)胰島素產(chǎn)生抵抗，中腦DA合成降低，導(dǎo)致DA釋放減少[20]。且DA的水平受多種因素影響，有報(bào)道[21]長(zhǎng)期高脂飲食可引起中腦DA合成降低，運(yùn)動(dòng)可提高DA的釋放，改善IR。本研究中IR組DA水平較CO組有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與入組患者體質(zhì)指數(shù)為(25.25±2.39)kg/m2，非嚴(yán)重肥胖，以及上述飲食、運(yùn)動(dòng)等多種因素的影響有關(guān)，有待于擴(kuò)大樣本數(shù)量，進(jìn)一步研究。

綜上所述，UPLC-MS/MS法檢測(cè)CAs及其代謝物具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、特異性高等優(yōu)點(diǎn)。T2DM伴IR患者中，血漿CAs及其代謝產(chǎn)物NE、E、MN、NMN、HVA和VMA含量較健康人顯著升高；可通過改善患者體內(nèi)NE和E水平，抑制交感神經(jīng)活性，起到改善IR的作用。