鄺杰華，陳剛,2*，馬騫,2*，毛非凡，周啟苓，黃建盛,2，施鋼，張健東,2

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524025；2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室(湛江)，廣東 湛江 524025)

1 引言

軍曹魚（Rachycentron canadum）隸屬鱸形目（Perciformes）、 軍 曹 魚 科 （Rachycentridae）、軍 曹 魚 屬（Rachycentron），為廣鹽暖水性海水魚類，俗稱海鱺、海龍魚，廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域（東太平洋除外）[1]，在南海部分海域亦有少量分布。由于軍曹魚具有生長速率快、易于馴化、抗病力強、肉厚、肉質(zhì)細膩等特點[2]，近年來，其在我國南方沿海地區(qū)的養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，隨著人工繁殖和大規(guī)模育苗技術(shù)的突破，已成為我國極具前景的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類之一。

性腺發(fā)育是魚類繁殖的前提條件，對魚類種群的繁衍發(fā)展至關(guān)重要。硬骨魚類性腺發(fā)育需經(jīng)歷發(fā)生、分化及成熟3個階段，原始生殖細胞（PrimordialGerm Cells，PGCs）遷移至生殖嵴后與體細胞構(gòu)成性腺原基，隨著性腺原基內(nèi)的PGCs和體細胞進一步分裂增殖，逐漸發(fā)育為原始性腺[3]。隨后，原始性腺分化出兩性特征，而性腺從分化結(jié)束到形成成熟精巢或卵巢的整個過程均會表現(xiàn)出明顯的階段性特征，絕大部分還會表現(xiàn)出周期性變化。目前，國內(nèi)外學(xué)者[4-5]主要根據(jù)解剖學(xué)和細胞學(xué)上的特征將魚類性腺的發(fā)育劃分為不同分期。軍曹魚為多次產(chǎn)卵類型魚類，在外觀上缺乏性別二態(tài)性，難以通過體表特征準確判斷其雌雄。近年來，國外學(xué)者[6-7]已對部分水域野生軍曹魚種群的繁殖習(xí)性和性腺發(fā)育特征開展了相關(guān)基礎(chǔ)研究；許樂樂等[8]通過對性成熟軍曹魚精巢的組織學(xué)觀察，分析精巢生殖上皮的動態(tài)變化，以評估軍曹魚精巢發(fā)育狀況的周年性變化；Dhanasekar等[9]利用透射電鏡技術(shù)對軍曹魚精巢中的生精細胞進行觀察分析，首次記錄了軍曹魚精子超微結(jié)構(gòu)，并詳細描述其發(fā)育過程；Dutney等[10]發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)的干擾可導(dǎo)致軍曹魚性激素分泌失衡，部分個體甚至出現(xiàn)雌雄同體的現(xiàn)象。然而，有關(guān)軍曹魚原始生殖細胞的起源、遷移和分化及配子發(fā)生等方面的研究尚未見報道。

本研究以1～360孵化日齡(days post hatching，dph)的不同發(fā)育階段軍曹魚為研究對象，采用石蠟組織切片和蘇木精-伊紅（Haematoxylin-Eosin，H.E.）染色法，系統(tǒng)觀察并描述了軍曹魚原始性腺的形成、分化特征及精巢和卵巢首周年發(fā)育的組織結(jié)構(gòu)變化，相關(guān)結(jié)果將進一步豐富軍曹魚的繁殖生物學(xué)研究內(nèi)容，有助于闡明其性腺發(fā)育規(guī)律，為海水魚的繁育生產(chǎn)提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 實驗材料及處理

2019年4 月，在廣東省湛江市東海島養(yǎng)殖科技園通過人工繁殖獲得軍曹魚初孵仔魚，從海上網(wǎng)箱中挑選自養(yǎng)的3齡以上成魚作為親魚，在室外水泥池（100 m3）中強化培育，注射 LRH-A3和 HCG 催產(chǎn)，雌魚注射劑量分別為 LRH-A38 μg/kg，HCG 1 200 IU/kg，雄魚的注射量為雌魚的1/2，效應(yīng)時間為10～12 h。孵化后的仔魚培育于室內(nèi)水泥池（5 m×3.5 m×1.5 m）中，于55 dph時將其轉(zhuǎn)移至廣東省茂名市電白縣某室內(nèi)養(yǎng)殖基地，飼養(yǎng)于直徑為9 m，水深為2.5 m的金屬圓形水池內(nèi)，流水充氣，養(yǎng)殖鹽度為27.0～30.5，溫度為25.0～30.0℃。

實驗用魚均經(jīng)40 mg/L的丁香酚麻醉，測量形態(tài)學(xué)指標后進行取樣。（1）1～15 dph（5～35 mm）：整體取樣，每 2 d取 1次樣，每次取樣 20尾；（2）16～52 dph（40～150 mm）：對于性腺未形成的稚魚直接剪取腹部性腺所在位置，對于性腺已成形的稚幼魚則解剖取出性腺，每 3～4 d取 1 次樣，每次取樣 20尾；（3）60～360 dph（21.8～68.5 cm）：分別對60 dph、90 dph、120 dph、150 dph、185 dph、210 dph和360 dph體質(zhì)良好的軍曹魚進行取樣，解剖后迅速取出性腺，其中，實驗用雌魚共 26尾，體重為 165.0～5 050.0 g，體長為 22.4～68.5 cm；雄魚共21尾，體重為160.0～4 225.0 g，體長為21.8～64.5 cm。采集的所有樣品均經(jīng)4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）固定24 h，隨后轉(zhuǎn)至70%乙醇中保存。

2.2 實驗方法

將已固定好的組織樣品經(jīng)過50%、70%、80%、95%（第1次脫水）、95%（第2次脫水）、100%（第1次脫水）及100%（第2次脫水）乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸透和包埋。用Leica RM2125手動輪轉(zhuǎn)式切片機進行連續(xù)切片，切片厚度為 5～6 μm，采用蘇木精-伊紅染色，最后用中性樹膠封片保存，通過Nikon E80i顯微鏡進行觀察，并采集顯微圖像。參照劉筠[11]對魚類性腺分期的方法，對不同日齡軍曹魚精巢和卵巢進行發(fā)育分期的劃分。

3 結(jié)果

3.1 原始生殖細胞的特征變化及遷移

3 dph（平均全長為4.5 mm），在魚體腹部后方靠近生殖孔的位置，可觀察到游離的單個原始生殖細胞分布于腸管上方與中腎管側(cè)下方之間的空腔（圖1a）。原始生殖細胞呈橢圓形，其直徑（7～8 μm）明顯大于周圍的體細胞，細胞核（3～4 μm）占比大且邊界明顯，著色較淺，核仁清晰（圖1b）。5 dph（平均全長為6.1 mm），原始生殖細胞沿著腹腔背側(cè)的腸系膜遷移至中腎管的正下方，呈梨形，直徑增大（圖1c）。7 dph（平均全長為8.2 mm）和9 dph（平均全長為10.1 mm），原始生殖細胞均遷移到達貼近腎臟下方的位置，即生殖嵴處，細胞形態(tài)無明顯變化，仍為單個游離狀態(tài)（圖1d，圖1e）。11 dph（平均全長為 12.3 mm），腹膜上皮組織的體細胞開始聚集于生殖嵴處原始生殖細胞的周圍（圖1f）。15 dph（平均全長為 23.7 mm），原始生殖細胞已被數(shù)層體細胞包圍，在生殖嵴處形成兩個朝向體腔的芽狀突起，即原始性腺的雛形，標志著原始生殖細胞胚后遷移的結(jié)束（圖1g）。

圖1 軍曹魚原始生殖細胞的胚后遷移Fig.1 Migration of primordial germ cells of Rachycentron canadum during early development

3.2 原始性腺的分化

18 dph（平均全長為31.5 mm），體細胞與生殖細胞通過有絲分裂不斷增殖，體細胞的分裂速度相對更快，生殖細胞被多層體細胞完全包繞，原始性腺的橫切面呈瘤狀，并分布有血細胞（圖2a）。21 dph（平均全長為 37.5 mm）和 24 dph（平均全長為 53.0 mm），原始性腺逐漸延長，體積不斷增大，兩側(cè)性腺的一端與腹腔系膜相連，而另一端則游離于腹腔背側(cè)，每側(cè)性腺的橫切面呈細長的棒狀，面積約為 80 μm×15 μm（圖2b，圖2c）。27 dph（平均全長為 68.2 mm）和 30 dph（平均全長為79.3 mm），原始性腺的橫切面進一步增大，中部逐漸變寬而兩端較窄，生殖細胞分裂加快，數(shù)量顯著增加，但并未出現(xiàn)明顯的性腺分化特征（圖2d，圖2e）。

34 dph（平均全長為 90.6 mm），原始性腺開始出現(xiàn)分化，可觀察到部分性腺組織中排列著被體細胞包繞呈簇狀發(fā)育的生殖細胞群，部分生殖細胞的直徑為5 μm左右，呈卵圓形，胞質(zhì)較少，細胞核占比大，已顯現(xiàn)出卵原細胞的形態(tài)學(xué)特征，預(yù)示將向卵巢方向分化（圖2f）；仍有部分個體的原始性腺尚未出現(xiàn)分化特征，其橫切面相對較為狹長，生殖細胞數(shù)量較少，且在性腺靠近系膜的一端形成微血管，通過對比，推測為未發(fā)生分化的精巢（圖2g）。

40 dph（平均全長為 107.9 mm），在推定的精巢組織中，生殖細胞經(jīng)有絲分裂大量增殖并聚集形成精原細胞群（圖2h）。44 dph（平均全長為 118.4 mm），卵巢中的生殖細胞已基本分化為卵原細胞，血管發(fā)達，血細胞數(shù)量較多且散布于整個性腺組織內(nèi)，部分體細胞聚集于性腺組織的中央?yún)^(qū)域，形成一條著色較深的細胞帶；隨后這些聚集的性腺體細胞向兩側(cè)擴張遠離，在原來細胞帶的位置產(chǎn)生一條狹窄的裂隙，即為卵巢腔的雛形，標志著卵巢解剖學(xué)上分化的開始（圖2j）。48 dph（平均全長為 131.4 mm）和 52 dph（平均全長為147.7 mm），精巢組織內(nèi)的體細胞和精原細胞進一步分裂，橫切面明顯增大并散布有少量血細胞，精原細胞集中分布于精巢的腹側(cè)邊緣，被一層基底膜所包被形成囊狀的精原細胞團，細胞團之間由小裂縫隔開，為精母細胞囊的形成做準備，表明精巢已開始細胞學(xué)上的分化（圖2i）；卵巢組織中的裂隙不斷向兩側(cè)延伸和擴大，最終形成明顯的卵巢腔，卵原細胞通過分裂和聚集形成生殖細胞囊，細胞直徑也增大至15～20 μm，逐漸向初級卵母細胞過渡，嗜堿性較弱，被染成淺紫色（圖2k，圖2l）。

圖2 軍曹魚原始性腺的分化Fig.2 Differentiation of primary gonad of Rachycentron canadum

3.3 精巢的首周年發(fā)育特征

根據(jù)精巢中生殖細胞的種類、成熟度、數(shù)量占比及排列方式，可將60～360 dph軍曹魚的精巢樣品分為5個發(fā)育分期，分別為精原細胞增殖期（I期）、精母細胞生長期（II期）、精母細胞成熟期（III期）、精子細胞變態(tài)期（IV期）、精子成熟期（V期），尚未發(fā)現(xiàn)精子退化吸收期（VI期），各發(fā)育期精巢特征如下。

60 dph（體長為（22.6±1.4）cm），精巢發(fā)育至 I期，呈細線狀，橫切面積較小，精原細胞的數(shù)量較多，聚集于囊泡狀的結(jié)構(gòu)內(nèi)，分布于精巢的中部及腹側(cè)，同時也可觀察到少量由精原細胞轉(zhuǎn)化而成的初級精母細胞和次級精母細胞（圖3A，圖3a）。

90 dph（體長為（30.1±1.6）cm），精巢發(fā)育已進入II期，生殖細胞的數(shù)量較少，結(jié)締組織及體細胞占整個精巢組織的絕大部分。精巢中已形成零星的精小葉，精小葉內(nèi)可觀察到精原細胞、初級精母細胞以及次級精母細胞（圖3B，圖3b）。

120 dph（體長為（36.8±1.4）cm），精巢發(fā)育由 II期向III期過渡，精小葉數(shù)量增多，集中分布于精巢的外緣。精小葉中形成精小囊，精小囊內(nèi)以初級精母細胞和次級精母細胞為主，同時也出現(xiàn)了少量的精細胞（圖3C，圖3c）。

150 dph（體長為（40.3±2.0）cm），精巢發(fā)育進入III期，精小葉數(shù)量進一步增多，隨著精母細胞的成熟分裂，精小囊逐漸向精小葉腔擴展。當精細胞成熟后，精小囊破裂，將其釋放至精小葉腔中，因此在精小葉內(nèi)可見大量的初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞以及少量的精原細胞（圖3D，圖3d）。

185 dph（體 長 為 （46.5±0.4）cm），精 巢 仍 處 于III期，精小葉散布于整個精巢組織中，精小囊內(nèi)初級精母細胞、次級精母細胞成堆出現(xiàn)，精小葉腔中精細胞的數(shù)量明顯增多（圖3E，圖3e）。

210 dph（體長為（49.5±1.2）cm），精巢已發(fā)育至IV期，精小葉的體積增大，形狀逐漸變得狹長，位于精巢邊緣的精小囊體積較大，以次級精母細胞為主，而精巢內(nèi)部的精小囊則基本破裂，精小葉腔中充斥精細胞，小部分精細胞已開始變態(tài)為精子（圖3F，圖3f）。

360 dph（體長為（63.4±1.3）cm），精巢處于 V 期，精小葉進一步擴大變得更為狹長，從精巢中央向邊緣呈輻射狀分布，精小囊分布于精小葉間的交界處，仍有少量的精母細胞，大部分精細胞已變態(tài)為精子，可觀察到密集的精細胞與成熟精子充滿整個精小葉腔（圖3G，圖3g）。

圖3 軍曹魚精巢首周年發(fā)育的組織學(xué)變化Fig.3 The histologic changes of first annual testicular development of Rachycentron canadum

3.4 卵巢的首周年發(fā)育特征

根據(jù)卵母細胞的發(fā)育特征及成熟度，可將60～360 dph軍曹魚的卵巢樣品劃分為卵原細胞增殖期（I期）、初級卵母細胞小生長期（II期）和初級卵母細胞大生長期（III期），卵巢尚未發(fā)育至成熟期，各發(fā)育期卵巢特征如下。

60 dph（體長為（23.2±1.7）cm），卵巢發(fā)育至 I期早期，卵巢腔占據(jù)整個卵巢的絕大部分，卵巢的橫切面呈環(huán)形，內(nèi)緣呈褶皺狀，部分凸起向卵巢腔中央延伸形成產(chǎn)卵板，產(chǎn)卵板內(nèi)以卵原細胞為主，細胞質(zhì)含量較少，具有明顯的細胞核，個別卵原細胞已向初級卵母細胞過渡，分裂為第I時相卵母細胞（圖4A，圖4a）。

90 dph（體長為（31.5±1.7）cm），卵巢仍處于 I期，具有明顯的卵巢腔，產(chǎn)卵板較短，以卵原細胞及其分裂分化而成的第I期時相卵母細胞為主，細胞核占比較大，核內(nèi)染色質(zhì)呈絲狀并組成稀疏的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖4B，圖4b）。

120 dph（體長為（37.1±2.0）cm），卵巢發(fā)育由 I期向II期過渡，產(chǎn)卵板逐漸延長，大部分為第Ⅱ時相卵母細胞，細胞直徑明顯增大，呈橢圓形或不規(guī)則形，細胞質(zhì)呈強嗜堿性，被染成紫藍色，卵母細胞間的間隔較寬，在產(chǎn)卵板的邊緣仍可觀察到少量卵原細胞和第I時相卵母細胞（圖4C，圖4c）。

150 dph（體長為（42.9±1.5）cm），卵巢發(fā)育進入II期，卵母細胞基本進入第II時相，在大部分卵母細胞的細胞質(zhì)中可觀察到一個被染成深紫色的團塊狀卵黃核，這是早期階段第II時相卵母細胞的特征（圖4D，圖4d）。

185 dph（體長為（47.7±1.6）cm），卵巢處于 II期，產(chǎn)卵板內(nèi)的卵母細胞排列更為緊密，細胞核與細胞質(zhì)相應(yīng)增大，部分直徑較大的卵母細胞中核仁的數(shù)量增加至2～3個，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)數(shù)顆大小不一的油滴（圖4E，圖4e）。

210 dph（體 長為 （52.6±0.9）cm），卵 巢 仍 處 于II期，卵母細胞的核仁直徑明顯增大，并繼續(xù)分裂出多個較小的核仁，嗜堿性減弱，被染成淺紫色，而細胞質(zhì)中的油滴數(shù)量進一步增多（圖4F，圖4f）。

360 dph（體長為（67.17±1.3）cm），卵巢發(fā)育進入III期，以早期第III時相卵母細胞為主，細胞直徑增大至100～150 μm，核仁分布于核膜內(nèi)緣，油滴數(shù)量較多呈環(huán)帶狀分布，并向細胞質(zhì)外緣逐漸擴展，質(zhì)膜外已開始形成兩層濾泡膜，仍有少數(shù)卵母細胞處于第II時相（圖4G，圖4g）。

圖4 軍曹魚卵巢首周年發(fā)育的組織學(xué)變化Fig.4 The histologic changes of first annual ovarian development of Rachycentron canadum

4 討論

4.1 軍曹魚原始生殖細胞的遷移及性腺的分化特征

本研究通過連續(xù)的組織學(xué)觀察，詳細記錄了軍曹魚原始生殖細胞的形態(tài)特征變化、遷移方式，原始性腺的形成及分化規(guī)律。軍曹魚原始生殖細胞在遷移過程中保持單個游離的狀態(tài)且未發(fā)生有絲分裂，與大多數(shù)已報道硬骨魚類中的研究結(jié)果相同，如革胡子鯰（Clarias gariepinus）[12]、 大 菱 鲆 （Scophthalmus maximus）[13]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[14]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[15]等。軍曹魚原始生殖細胞遷移至生殖嵴后被體細胞完全包繞，于15 dph時形成芽狀的原始性腺，相似地，大黃魚（Larimichthys crocea）原始性腺的形成時間為 16 dph[16]；大菱鲆[13]和牙鲆[14]分別在 20 dph 和 22 dph 時形成原始性腺，而稀有鯽（Gobiocypris rarus）[17]的原始性腺則形成于 9 dph，表明硬骨魚類原始性腺在形成時間上存在明顯的種間差異。原始性腺發(fā)育早期體細胞有絲分裂速度加快，而生殖細胞的有絲分裂進程在后期才明顯加快。Yang等[14]在牙鲆中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，據(jù)此推測，在胚后遷移及原始性腺早期發(fā)育階段，生殖細胞可能處于分裂受阻的狀態(tài)。在34 dph軍曹魚稚魚中可發(fā)現(xiàn)兩類存在明顯特征差異的性腺，第1類性腺橫切面呈水滴形，生殖細胞數(shù)量較多，推測其將發(fā)育為卵巢，第2類性腺的橫切面較狹長，生殖細胞數(shù)量也較少，則推定為分化前的精巢；同樣地，在大菱鲆[13]、青鳉（Oryzias latipes）[18]、三刺魚（Gasterosteus aculeatus）[19]和藍鰓太陽魚（Lepomis macrochirus）[20]性腺分化的研究中，推定的卵巢組織中生殖細胞數(shù)量均顯著高于精巢。隨后，軍曹魚的第1類性腺在44 dph時形成卵巢腔，標志著卵巢分化開始。由此可見，原始性腺中生殖細胞數(shù)量的差異可作為判定軍曹魚性腺分化方向的標準之一。50 dph時，推定的精巢中精原細胞聚集于性腺腹側(cè)，并由基底膜包被形成精原細胞囊，預(yù)示著精巢分化的開始[21]，但此時尚未見輸精管和精小葉等精巢分化的主要標志出現(xiàn)。上述結(jié)果表明，軍曹魚的性腺分化屬于分化型雌雄異體型，且卵巢的分化時間要早于精巢。

4.2 軍曹魚性腺發(fā)育的首周年變化

360 dph軍曹魚精巢可發(fā)育至V期，而卵巢只發(fā)育至III期早期，由此推測雄魚的性成熟年齡約為1齡，而此時雌魚尚未達到性成熟。據(jù)報道，自然海區(qū)及網(wǎng)箱養(yǎng)殖軍曹魚的最小性成熟生物學(xué)年齡分別為：雄性1齡，雌性1.5～2齡[22-24]，由此可見，室內(nèi)水池養(yǎng)殖條件下，軍曹魚性腺發(fā)育規(guī)律與野生及網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境下無明顯差異。

通過對軍曹魚精巢的組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，精小葉的內(nèi)緣排列著不規(guī)則的精小囊，同一精小囊內(nèi)的生精細胞發(fā)育程度一致，當精小囊內(nèi)的生精細胞成熟后，囊膜便破裂，將精子釋放至精小葉腔中并最終匯集于輸精管，這與大部分硬骨魚類如四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）[25]、黃斑籃子魚（Siganus oramin）[26]、金錢魚（Scatophagus argus）[27]、松江鱸（Trachidermus fasciatus）[28]等的生精特點相一致。軍曹魚的精子形成過程與其他硬骨魚類相同，生殖細胞由最初的精原細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化后形成初級精母細胞，隨后通過減數(shù)第1次分裂形成次級精母細胞，再經(jīng)進一步的分裂產(chǎn)生精細胞，最后精細胞經(jīng)變態(tài)形成成熟精子[29]。精巢成熟后精小葉的形狀狹長且從精巢的中央向邊緣呈輻射狀分布，根據(jù)此結(jié)構(gòu)特征及生精細胞的發(fā)育特點可將其歸類為小葉型結(jié)構(gòu)中的輻射型精巢，如鲇形目與鱸形目中大多數(shù)種類的精巢均屬此類型[30]。

依據(jù)不同日齡軍曹魚卵巢的組織學(xué)特征可知，I期卵巢主要包含卵原細胞及向初級卵母細胞過渡的第I時相卵細胞，細胞體積相對較小，核內(nèi)染色質(zhì)呈明顯的細絲狀。目前，關(guān)于第I時相卵細胞的定義尚未趨于統(tǒng)一，部分學(xué)者將其歸類至卵原細胞[31-32]，還有部分學(xué)者將其歸類為卵母細胞[27,33]，基于細胞特征及有絲分裂的程度，本文將其定義為第I時相卵母細胞。軍曹魚II期卵巢中含有第I時相、第II時相卵母細胞，而III期卵巢中含有第I時相、第II時相、第III時相卵母細胞，卵巢內(nèi)卵母細胞的發(fā)育并不同步，這與黃斑籃子魚[26]、紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus）[31]、半滑舌鰨（Oplegnathus punctatus）[32]等魚類似，由此可判定軍曹魚屬于分批同步產(chǎn)卵型魚類，一年可多次產(chǎn)卵。當卵母細胞發(fā)育至第II時相中期時，細胞質(zhì)內(nèi)開始形成油滴，隨著進一步的發(fā)育，油滴的數(shù)量不斷增多并呈環(huán)帶狀分布于細胞核周緣，與銀鯧（Pampus argenteus）[34]、灰鯧（Pampus cinereus）[35]和許氏平鲉（Sebastes schlegeli）[36]的研究結(jié)果相一致，而金錢魚（Scatophagus argus）[27]、黑鱾（Girella leonina）[37]和美洲鰣魚（Alosa sapidissima）[38]中則發(fā)現(xiàn)卵母細胞發(fā)育至第III時相才開始形成油滴，由此推測，軍曹魚卵母細胞對脂質(zhì)的積累能力相對較強。