鄧坤，易蔚，賴海艷，龍娟，任夢瑤，李偉偉

1廣西中醫(yī)藥大學研究生院，廣西南寧530001；2廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科

哮喘（BA）是兒童最常見的慢性呼吸道疾?。?］，主要特征是氣道慢性炎癥、氣道重塑及氣道高反應(yīng)性。文獻［2］報道，14歲以下兒童哮喘患病率約3.3%，并且發(fā)病率呈明顯上升趨勢。哮喘病因、發(fā)病的分子機制尚未明確，加之哮喘的反復(fù)發(fā)作嚴重影響生活質(zhì)量，對患兒家庭及社會造成巨大的精神及經(jīng)濟負擔。miRNA小分子與哮喘氣道重塑、支氣管炎癥及氣道高反應(yīng)性的發(fā)生密切相關(guān)，miRNA-182-5p的上調(diào)能抑制氣道平滑肌細胞的增殖和遷移［3］，miRNA-620下調(diào)能抑制氣道平滑肌的增殖和凋亡［4］，miR-223的過表達能夠減輕氣道炎癥、NLRP3水平及IL-β的釋放［5］，miR-140-3P的上調(diào)表達可增加CD38蛋白質(zhì)的表達，導致氣道平滑肌收縮的增加［6］。越來越多的研究表明，miRNA在哮喘兒童的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本課題組利用生物信息學技術(shù)獲取高通量基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO）哮喘兒童差異表達miRNA、mRNA，并進一步挖掘重要轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵生物學途徑以及構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終篩選與兒童哮喘發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵微小核糖核酸（miRNA）、信使核糖核酸（mRNA），為兒童哮喘發(fā)病機制和潛在治療藥物提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 差異表達miRNA篩選、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測、靶基因預(yù)測 ①篩選：從GEO數(shù)據(jù)庫檢索Child asth?ma、miRNA等關(guān)鍵詞，限制研究類型為長鏈非編碼RNA，物種為Homo sapiens，下載哮喘兒童芯片數(shù)據(jù)集GSE25230，其中包含14例支氣管上皮組織樣本，選取其中7例哮喘患兒的支氣管上皮組織作為此次研究的哮喘樣本組，7例正常支氣管上皮組織作為對照組，同時利用GEO2R對數(shù)據(jù)集GSE64913進行差異表達分析，限制條件為P<0.05及l(fā)ogFC>0.5。②轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測：FunRich是一個可以對通路、生物過程、分子功能及蛋白互作進行分析的獨立軟件工具，因此我們將差異表達miRNA導入FunRich，并利用FunRich對數(shù)據(jù)進行分別對上下調(diào)差異miRNA進行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測，進而獲得上下調(diào)差異miRNA中前10個較為重要的預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子。③靶基因預(yù)測：miRNet（https：//www.mirnet.ca/）是一個以miRNA為中心的可視化網(wǎng)絡(luò)平臺，是一個集合了多個數(shù)據(jù)庫來預(yù)測miRNA—靶基因互作的在線工具，因此我們選取logFC排名前20的差異表達miRNA，并通過miRNet在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測其下游靶基因，為篩選目標基因作準備。

1.2 差異表達mRNA篩選、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路、基因本體（GO）功能富集分析 ①篩選：從GEO數(shù)據(jù)庫檢索child asthma、mRNA等關(guān)鍵詞，物種為Homo sapiens，下載哮喘兒童芯片數(shù)據(jù)集GSE63142，其中包含128例支氣管上皮組織樣本，27例健康的支氣管上皮組織樣本，將128例哮喘患者支氣管上皮組織作為此次研究的哮喘樣本組，27例正常支氣管上皮組織作為對照組。同時利用GEO2R對數(shù)據(jù)集GSE63142進行差異表達分析，限制條件為P<0.05及l(fā)ogFC>0.5。②KEGG通路、GO功能富集分析：利用R軟件中“Bioconductor”包對哮喘差異表達基因進行GO功能、KEGG通路富集分析，篩選條件為P<0.05（表明差異具有顯著意義），GO、KEGG能更好的揭示差異表達基因參與的生物學功能及信號通路等途徑，有助于明確哮喘的潛在發(fā)病機制。

1.3 關(guān)鍵miRNA、mRNA篩選 從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取哮喘兒童上調(diào)差異表達mRNA與下調(diào)差異表達mRNA，利用VEEN圖把上調(diào)的差異表達mRNA和下調(diào)的差異表達miRNA預(yù)測的靶基因取交集；下調(diào)的差異表達mRNA和上調(diào)的差異表達miRNA預(yù)測的靶基因取交集。根據(jù)miRNA預(yù)測的下游靶基因與差異表達mRNA的交集結(jié)果，反向篩選出目標基因上游的miRNA，構(gòu)建哮喘兒童發(fā)病的潛在miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，并進一步篩選出關(guān)鍵miRNA、mRNA。

2 結(jié)果

2.1 差異表達miRNA篩選、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測、靶基因預(yù)測結(jié)果 ①篩選結(jié)果：利用GEO2R對數(shù)據(jù)集GSE25230進行差異分析，共獲得69個差異表

達miRNA，其中34個表達上調(diào)（logFC值排名前10位的分別是hsa-miR-335-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-576-3p、hsa-miR-487b-3p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-454-3p），35個表達下調(diào)（logFC值排名前10位的分別是hsa-miR-210-3p、hsa-miR-498-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-1268a、hsa-miR-602、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-877-5p、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-885-3p）。②轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測結(jié)果：分別對上下調(diào)miRNA進行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，34個上調(diào)差異表達miRNA中基因百分比排名前10的轉(zhuǎn)錄因子分別是EGR1、RREB1、SP1、CACD、FOXD3、SP4、TFAP4、ESR2、HENMT1、NHLH1，35個下調(diào)差異表達miRNA中基因百分比排名前10的轉(zhuǎn)錄因子分別是EGR1、RREB1、FOXD3、HNF4A、EBF1、YY1、MYF5、NR1H3、ZEB1、ETS1。其中EGR1、SP1較為重要。③靶基因預(yù)測結(jié)果：通過miRNet數(shù)據(jù)庫對logFC絕對值屬于前20的差異表達miRNA進行下游靶基因預(yù)測，其中包括15個上調(diào)的miRNA，分別是hsa-let-7f-5p、hsa-mir-30a-

5p、hsa-mir-129-5p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-181a-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-132-3p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-411-5p、hsa-mir-454-3p、hsa-mir-576-3p、hsa-mir-487b-5p、hsa-mir-886-3p；5個下調(diào)差異表達miRNA，分別是hsa-mir-193b-3p、hsa-mir-423-5p、hsa-mir-885-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-1225-5p。經(jīng)去重后，在數(shù)據(jù)庫中分別有5378和1436個獨立靶基因，分別建立哮喘兒童上調(diào)差異表達miRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)和下調(diào)差異表達miRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)并列出各個差異miRNA靶基因計數(shù)。

2.2 差異表達mRNA篩選、KEGG、GO富集分析結(jié)果 ①利用GEO2R對數(shù)據(jù)集GSE63142進行差異分析，得到68個上調(diào)差異表達mRNA（根據(jù)logFC值排名 前10位的分別是CLCA1、PRR4、CEACAM5、CPA3、TPSAB1、NOS2、CST1、TCN1、POSTN、TFF1）及48個下調(diào)差異表達mRNA（根據(jù)logFC值排名前10位的分別是LOC100132287、C7orf26、LYPD2、LTF、GPR156、TMEM45A、C20orf46、C3、CSH1、SCGB3A1）。②KEGG富集結(jié)果顯示，差異表達mRNA在白介素17信號通路、神經(jīng)活性配體—受體相互作用、趨化因子信號通路、腎素—血管緊張素系統(tǒng)富集顯著，GO富集結(jié)果顯示，差異表達mRNA GO功能主要富集在細胞外基質(zhì)、絲裂原激活蛋白激酶、細胞外間隙以及胞外區(qū)等生物學過程中。

2.3 關(guān)鍵miRNA、mRNA篩選結(jié)果 從GEO數(shù)據(jù)庫獲取哮喘差異表達基因，確定上調(diào)與下調(diào)的差異表達基因，利用VEEN圖把上調(diào)的差異表達基因與下調(diào)的差異表達miRNA預(yù)測的靶基因作交集，把下調(diào)的差異表達基因與上調(diào)的差異表達miRNA預(yù)測的靶基因取交集。獲得差異表達上調(diào)的miRNA靶向目標基因有NFAIP2、DUSP5、TMEM45A、NCOA7等12個，下調(diào)的差異表達miRNA靶向目標基因有TFF1、KIT、S100A14。通過篩選后的目標基因確定其對應(yīng)的miRNA，并進一步構(gòu)建哮喘兒童發(fā)病的潛在miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)（詳見圖1），最后利用“CytoHubba”插件篩選出Degree值排名前3的關(guān)鍵miRNA（hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p）和 關(guān) 鍵mRNA（CXCL2、KIT、MUC5B）。

圖1 兒童哮喘潛在miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

3 討論

哮喘為兒童最常見的慢性呼吸道疾病，其發(fā)病率、病死率呈逐年上升趨勢，對世界帶來嚴重的健康和經(jīng)濟負擔，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［7-8］。哮喘病因尚不明確，認為與免疫、神經(jīng)、精神、內(nèi)分泌因素、遺傳學背景及信號通路密切相關(guān)［9］，因此對臨床治療造成嚴重困難，尋找其潛在發(fā)病分子機制具有重要意義。哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA通過調(diào)控mRNA從而影響基因表達起到了重要的作用，當這種調(diào)控機制發(fā)生紊亂時，更容易造成哮喘的發(fā)生，但其具體機制尚不明確。因此我們利用生物信息學技術(shù)，構(gòu)建了哮喘兒童miRNA-mRNA潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩選出關(guān)鍵miRNA、mRNA；同時預(yù)測出差異表達miRNA的潛在轉(zhuǎn)錄因子；篩選出差異表達mRNA并對其進行KEGG和GO富集分析。

通過對miRNA芯片GSE25230數(shù)據(jù)集進行分析，最終我們得到34個上調(diào)差異表達miRNA以及35個下調(diào)差異表達miRNA；并進一步預(yù)測了差異表達miRNA的轉(zhuǎn)錄因子、下游靶基因。利用GEO2R對數(shù)據(jù)集GSE63142進行差異分析，得到68個上調(diào)差異表達mRNA及48個下調(diào)差異表達mRNA。根據(jù)miRNA預(yù)測的下游靶基因與差異表達mRNA的交集結(jié)果，反向篩選出目標基因上游的miRNA，進一步構(gòu)建哮喘兒童發(fā)病的潛在miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，最終根據(jù)Degree值篩選出前3位關(guān)鍵mRNA（CX?CL2、KIT、MUC5B）及3個關(guān)鍵miRNA（hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p）；趨化性細胞因子2（CXCL2）屬于趨化因子家族成員之一，研究表明，CXCL2可以通過NF-kB信號通路途徑將中性粒細胞募集到炎癥部位，進而加重氣道炎癥反應(yīng)［10］；研究［11］證實，通過抑制CXCL2的表達，可以有效抑制哮喘氣道炎癥反應(yīng)。三葉因子1（TFF1）屬于TFF基因家族成員之一，TFF1的過度表達能夠?qū)е轮夤苌掀ぜ毎难装Y反應(yīng)以及呼吸道分泌物的產(chǎn)生，從而導致氣道慢性炎癥的發(fā)生［12］。粘液的堵塞是致命性哮喘死亡的主要原因，粘蛋白5B（MUC5B）屬于粘蛋白家族成員之一，研究表明，MUC5B的過度表達會導致氣道粘液的聚集，進而引發(fā)氣道的阻塞［13］。在哮喘兒童中，這些差異表達mRNA均受到差異表達miRNA的調(diào)控，其中以hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p較為重要，但是對于哮喘與上述差異表達miRNA的相關(guān)研究幾乎未見報道，這為我們以后的研究提供了新的分子靶標；轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控miRNA的表達，同時miRNA對轉(zhuǎn)錄因子也起到調(diào)控作用，二者共同作用于mRNA，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄與翻譯。因此，我們通過FunRich軟件預(yù)測哮喘兒童差異表達miRNA的轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)EGR1、SP1在調(diào)控哮喘兒童過程中比較重要；早期生長反應(yīng)蛋白1（EGR1）是具有鋅結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其介導的細胞凋亡是轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）誘導氣道纖維化及重塑的先決條件［14］；在EGR1缺乏時，導致TGF-β1誘導的哮喘小鼠氣道反應(yīng)性升高、氣道平滑肌細胞的增生及肺部的纖維化。特異性蛋白1（SP1）是一種鋅指蛋白，與真核細胞轉(zhuǎn)錄機制密切相關(guān)，SP1通過調(diào)控含有GC或GACCC啟動因子的表達在細胞生長、分化及凋亡過程發(fā)揮重要作用［15］；研究證明，TGF-β1/AKT1/SP1/WNT-5A信號轉(zhuǎn)導途徑在哮喘氣道重塑中發(fā)揮了重要作用［16］。以上結(jié)果表明，差異表達mRNA（CX?CL2、KIT、MUC5B）、差異表達miRNA（hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p）和轉(zhuǎn)錄因子（EGR1、SP1）在哮喘兒童的發(fā)病機制中可能起重要作用，有望成為治療哮喘兒童的新方向。

傳統(tǒng)的逐個分析基因的方法不足以滿足生物學研究在探究真實生物學方面的增長和需求；然而伴隨基因組測序、微陣列芯片等新技術(shù)而產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)，使得數(shù)據(jù)的分析和整合變得非常重要［17］。生物信息學是一門基于統(tǒng)計學、計算機科學和數(shù)學來進行分析轉(zhuǎn)錄組、蛋白組及代謝組等的理論工具，是生物研究的最新領(lǐng)域之一，被廣泛地用來處理和分析生物數(shù)據(jù)；GEO數(shù)據(jù)庫為現(xiàn)今最全面的基因表達數(shù)據(jù)庫，其中包含大量正常與患病個體的組織和細胞系基因表達譜芯片數(shù)據(jù)。因此我們通過生物信息學方法，挖掘GEO數(shù)據(jù)庫中有關(guān)哮喘兒童的芯片數(shù)據(jù)集GSE63142，篩選出68個上調(diào)差異表達mRNA及48個下調(diào)差異表達mRNA，并對差異表達mRNA進行了GO和KEGG富集分析，KEGG富集結(jié)果顯示差異表達mRNA在白介素17（IL-17）信號通路、趨化因子信號通路等途徑密切相關(guān)，GO富集結(jié)果顯示差異表達mRNA在細胞外基質(zhì)途徑、絲裂原激活蛋白激酶途徑富集顯著。IL-17是T輔助細胞17（Th17）細胞產(chǎn)生的標志性細胞因子，在抵抗微物入侵的宿主防御反應(yīng)以及自身免疫性疾病和過敏綜合癥的發(fā)病機理中起著關(guān)鍵作用；IL-17激活包括NF-kB、MAPK和C/EBPs在內(nèi)的多個下游信號轉(zhuǎn)導途徑，從而誘導抗菌肽、促炎性趨化因子、細胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的基因表達［18］。研究［19］表明，阻斷白介素17信號通路能夠有效減輕哮喘氣道炎癥。趨化因子信號通路是由趨化因子及其相應(yīng)的受體結(jié)合形成的信號轉(zhuǎn)導途徑，趨化因子主要由CXC、CC及CX3C家族構(gòu)成，其相應(yīng)的受體則稱之為CXCR、CCR等，細胞趨化因子是氣道高反應(yīng)性、免疫細胞浸潤及炎癥反應(yīng)的重要調(diào)劑［20］；CCL2屬于CC趨化細胞因子，研究表明，抑制趨化因子CCL2能夠有效減輕哮喘氣道炎癥反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性［21］。絲裂原激活蛋白激酶是一組在真核生物中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、p38絲裂原激活蛋白激酶三大類，其功能主要是將上游信號傳遞至下游效應(yīng)因子，以調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、及凋亡［22］；研究［23］表明，p38絲裂原激活蛋白激酶的激活，能夠上調(diào)多種促炎細胞因子和趨化因子的表達及某些纖維化因子的產(chǎn)生，p38絲裂原激活蛋白激酶能夠通過誘導支氣管氣道的炎癥和重塑，進而促進氣流受限的發(fā)展。細胞外基質(zhì)是水合大分子蛋白質(zhì)和糖的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，與結(jié)合的可溶性因子協(xié)同作用，構(gòu)成組織的無細胞基質(zhì)微環(huán)境，細胞外基質(zhì)不僅為細胞提供結(jié)構(gòu)信息，而且在發(fā)育中起指導作用，對于維持組織穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用［24］；膠原蛋白是最豐富的氣道細胞外基質(zhì)成分，是決定氣道機械性能的主要因素，氣道膠原蛋白異常沉積與氣道疾病的發(fā)病機理和進展密切相關(guān)［25］；研究表明，細胞外膠原蛋白的異常沉積會導致哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展及患者癥狀的加?。?6］。以上研究表明，白介素17信號通路、趨化因子信號通路、細胞外基質(zhì)以及絲裂原激活蛋白激酶途徑均可能是哮喘兒童潛在作用機制。

總之，篩選出3個與哮喘兒童密切相關(guān)的關(guān)鍵mRNA（CXCL2、KIT、MUC5B）和3個關(guān)鍵miRNA（hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p），并得出較為重要的2個轉(zhuǎn)錄因子（EGR1、SP1）和4條相關(guān)生物學途徑（IL-17信號通路、趨化因子信號通路、細胞外基質(zhì)、絲裂原激活蛋白激酶）。本研究對哮喘兒童的診斷、發(fā)病的分子機制及后續(xù)新藥的開發(fā)有重要指導意義，但是也存在一些局限性，比如選取數(shù)據(jù)集的樣本量還不夠，研究僅基于數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，后續(xù)仍需要在體內(nèi)和體外進行實驗驗證來進一步驗證我們的分析結(jié)果。