楊夢琳，周小青，伍大華，張運輝，鄭彩杏，童天昊

1重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)學(xué)院，重慶 404120；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)；32011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新，長沙 410208；4湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙 410006

隨著世界人口老齡化增加，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的發(fā)病率也逐年升高，到2050年估計會增至1.15億[1]，對老年人的健康和生活質(zhì)量造成重大威脅，給家庭和社會帶來巨大壓力。由于AD發(fā)病隱匿、病程長、臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制復(fù)雜，現(xiàn)代西藥對其治愈率極低，且易耐藥、副作用較多[2,3]。傳統(tǒng)中醫(yī)治療AD歷史悠久，其療效已獲得認(rèn)可[4]。

清代唐容川《血證論》言“血在上，則濁蔽而不明矣”，王清任《醫(yī)林改錯》云：“凡有瘀血也，令人善忘”。故瘀血是癡呆的重要致病因素，活血化瘀是治療AD的基本治法之一[5]。Yan等[6]研究中醫(yī)文獻(xiàn)中醫(yī)藥治療老年癡呆常用藥對發(fā)現(xiàn)，從活血化瘀立論治療老年癡呆90首基本方中丹參與川芎配伍頻率最高，推測丹參-川芎可能具有較好的治療AD的作用。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討丹參-川芎藥對治療AD的作用機制，以期為闡述活血化瘀法治療AD的臨床治療提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 丹參-川芎有效成分庫的建立

在TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)中篩選丹參-川芎兩味中藥的有效成分，根據(jù)口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-like，DL)≥0.18進(jìn)行篩選[7]。同時，通過文獻(xiàn)檢索補充丹參和川芎的其他有效成分。一些有效成分如川芎嗪、阿魏酸雖不滿足上述篩選條件，但通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)這類有效成分有明確治療AD的作用，因此這類有效成分也將作為本研究的候選有效成分。例如，川芎嗪能通過作用PI3K/Akt通路，調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)，從而拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]；阿魏酸可通過抗氧化作用降低AD小鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激效應(yīng)和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮對AD的治療作用[9]。

1.2 有效成分作用靶點庫的建立

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫、Drug Bank(https://www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫和STITCH(http://stitch.embl.de/)數(shù)據(jù)庫查詢有效成分的作用靶點。

1.3 AD疾病相關(guān)基因檢索

在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(https://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)和Drugbank數(shù)據(jù)庫中檢索AD的靶基因，去除三個數(shù)據(jù)庫重復(fù)項。

1.4 丹參-川芎有效成分與AD共同靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.2”和“1.3”項獲得的靶點進(jìn)行比對，找出共同靶點，將這些共同靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建靶點群蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 篩選PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶基因

借助Cytoscape 3.7.1的插件Centiscape 2.2算出PPI網(wǎng)絡(luò)的點度中心性(degree)、接近中心性(closeness)和中介中心性(betweenness)的中位數(shù)， 選擇degree、betweenness和closeness均在中位數(shù)之上的靶點為“關(guān)鍵靶基因”。

1.6 關(guān)鍵靶點的代謝通路與生物過程分析

丹參-川芎治療AD靶基因通過Metascape平臺進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。獲取丹參-川芎有效成分與AD相關(guān)性前20位的生物學(xué)過程和前10位的通路。

1.7 體外驗證實驗

1.7.1 細(xì)胞與試劑

PC12細(xì)胞(長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，批號2015032007)；Aβ25-35(美國Sigma公司，批號053M4804V)；Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒(KeyGEN BioTRCH，批號20201204)；ELISA測定試劑盒(南京建成生物研究所，IL-1β批號Y16036021，TNF-α批號Y17036022，IL-6批號Y14036607)；p38MAPK、NF-κBp65引物合成(由上海生工生物工程有限公司提供)；qRT-PCR試劑盒(中國北京康為世紀(jì)公司，批號50445)；總RNA抽提試劑(Trizol)(中國北京康為世紀(jì)公司，批號36320)。丹參100g購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；川芎100g購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，按1∶1稱取丹參、川芎，通過水提、蒸發(fā)、濃縮成不流動的浸膏，過濾膜滅菌后放至-20 ℃冰箱貯藏。

1.7.2 儀器

Galaxy 170R型二氧化碳培養(yǎng)箱(上海百賽生物技術(shù)有限公司)；Eppendorf 5804R型低溫高速離心機(德國Eppendorf 5810R)；Primo Vert型倒置顯微鏡(德國 Carl Zeiss Jena)等。

1.7.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù)

PC12細(xì)胞于37 ℃、95% O2、5% CO2培養(yǎng)箱生長至對數(shù)生長期，分為5組。對照組：在不含F(xiàn)BS、PBS的DMEM中孵育24 h；模型組：用Aβ25-35(20 μmol/L)孵育24 h[10]；丹參-川芎低劑量組(10 μg/mL)、丹參-川芎中劑量組(20 μg/mL)、丹參-川芎高劑量組(40 μg/mL)孵育24 h。

1.7.4 丹參-川芎對PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率的影響

每個孔加入1×MTT溶液50 μL，在37 ℃、95% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，各孔加入DMSO 200 μL，置搖床上低速振蕩3 min。酶標(biāo)儀上測各孔在570 nm吸光度的OD值。

1.7.5 丹參-川芎對PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

采用ELISA法檢測各組PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量，測量步驟嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。

按Annexin V FITC/ PI 試劑盒說明操作,流式細(xì)胞儀上檢測PC12細(xì)胞凋亡率,每組試驗重復(fù)5次，用凋亡分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。

1.7.7 丹參-川芎對PC12細(xì)胞p38MAPK/NF-κB信號通路的影響

熒光定量法檢測PC12細(xì)胞上清p38MAPK、NF-κB p65mRNA表達(dá)，利用Trizol法提取PC細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行熒光實時定量PCR檢測。預(yù)變性引物見表 1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7.8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析，組間比較用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 丹參-川芎藥對活性成分的收集與篩選

本研究通過TCMSP平臺的OB和DL篩選，以及查找相關(guān)文獻(xiàn)對中藥中的特征化合物予以補充，獲得丹參-川芎的25個化合物包括丹參15(DS1～15)個，川芎10(CX1～10)個(見表 2)。

表2 丹參-川芎活性成分Table 2 Active ingredients of DS-CX

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.2 丹參-川芎藥對活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape 3.7.1獲得“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”(見圖1)。25個菱形代表丹參-川芎的有效成分，224個三角形代表有效成分靶標(biāo)，872條邊代表了有效成分和靶點兩者的互相作用，展現(xiàn)了丹參-川芎多成分、多靶點的特點。

圖1 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The target network of the active ingredients注：紅色菱形：丹參有效成分；黃色菱形：川芎有效成分；綠色三角形：靶點。Note:Red diamond:Active ingredients of DS;Yellow diamond:Active ingredients of CX;Green triangle:Target.

2.3 AD相關(guān)靶點

在DisGeNET、TTD和Drugbank數(shù)據(jù)庫查找AD的靶點，共獲得2 245個靶點。

第一，教育財政投入理論。馬克思主義財政體制思想在很早就表明教育財政投入和教育服務(wù)的價值、作用和意義。馬克思表示，“隨著社會科技進(jìn)步，知識、教育、計算和閱讀等方面的內(nèi)容，只會在我們的生活中更普遍、更容易、更快速地生產(chǎn)出來……在國民教育普及之后，生活條件較差的人或很少接受教育的人可以成功和容易地接受教育……雖然他們的勞動能力可能不如以前那么好，他們的工資水平還沒有達(dá)到原來的水平，但他們的勞動能力有了很大的提升，這就是依靠教育做出的貢獻(xiàn)……”[2]47。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

在DisGeNET、TTD和Drugbank數(shù)據(jù)庫查找AD的靶點與丹參-川芎作用的靶點有105個交集靶點，這105個靶標(biāo)可能是丹參-川芎治療AD的靶基因。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析尋找關(guān)鍵靶基因(見圖2)。

圖2 靶基因 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of target gene

2.5 關(guān)鍵靶基因篩選結(jié)果

利用Cytoscape 3.7.1的插件Centiscape 2.2算出了網(wǎng)絡(luò)closeness的中位數(shù)為0.53，degree的中位數(shù)為15.3，betweenness的中位數(shù)為3.48×10-2，closeness、degree和betweenness均在平均值以上的靶點為9個，按次序是MAPK1、MAPK10、APP、AKT1、GSK3β、Caspase-3、MAOB、TNF、MTOR，表示以上9個靶點很可能是丹參-川芎治療AD的關(guān)鍵靶基因。

2.6 GO功能分析和 KEGG通路分析結(jié)果

丹參-川芎治療AD的105個靶點GO分子功能富集分析結(jié)果如圖3所示，主要關(guān)聯(lián)炎癥反應(yīng)、凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)等方面。

圖3 生物過程Fig.3 Biological process

Metascape數(shù)據(jù)庫中的KEGG分析結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出包括MAPK信號通路、NF-κB信號通路、凋亡、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路等，提示丹參-川芎治療AD的主要作用過程是通過這些信號通路來完成的。

2.7 丹參-川芎對PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率影響

與對照組對比，模型組PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)；與模型組對比，丹參-川芎中、高劑量組的細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05，P<0.01)，提示丹參-川芎能保護(hù)PC12細(xì)胞(見表3)。

表3 丹參-川芎對PC12細(xì)胞存活率的影響Table 3 Effects of DS-CX on the survival rate of PC12 s，n=8)

2.8 丹參-川芎對PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

與對照組對比，模型組PC12細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-ɑ含量均明顯增高(P<0.01)；與模型組對比，隨著丹參-川芎濃度增加，PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，提示丹參-川芎能抑制PC12細(xì)胞的炎癥反應(yīng)(見表4)。

表4 丹參-川芎對PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響Table 4 Effect of DS-CX on the inflammation of PC12 s，n=8)

2.9 丹參-川芎對PC12細(xì)胞凋亡率的影響

結(jié)果見表5，與對照組對比，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與模型組對比，丹參-川芎中、高劑量組的PC12細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

表5 丹參-川芎對PC12細(xì)胞凋亡率的影響Table 5 Effect of DS-CX on the apoptosis rate of PC12 s，n=8)

2.10 丹參-川芎對PC12細(xì)胞p38MAPK/NF-κB信號通路主要基因表達(dá)的影響

與對照組對比，模型組p38MAPK、NF-κB mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與模型組對比，丹參-川芎各組均能明顯降低p38MAPK、NF-κB mRNA的表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)(見表6)。提示丹參-川芎可下調(diào)p38MAPK/NF-κB信號通路，抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡，減輕神經(jīng)元損傷。

表6 丹參-川芎對PC12細(xì)胞p38MAPK/NF-κB的影響Table 6 Effects of DS-CX on p38MAPK/NF-κB in PC12 s，n=8)

3 討論

AD屬中醫(yī)學(xué)之“呆證”、“癡呆”等，老年人五臟功能漸衰，氣虛無力推動血行，血液運行不暢，易瘀滯脈絡(luò)，瘀血阻于腦竅，元神失養(yǎng)，神機失用，終成呆證。如《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》言：“腦絡(luò)瘀阻可直接損傷腦髓，使腦竅漸空，靈機記憶漸失，終成呆證。”故瘀血是AD重要致病因素，活血化瘀法是防治AD的重要治法之一。丹參具有活血祛瘀、安神之功效?！兜崮媳静荨吩唬骸把a心定志，安神寧心，治健忘怔忡，驚悸不寐”[11]。川芎具有活血行氣，祛風(fēng)止痛功效。《本草通玄》記載其可“除濕止瀉，行氣開郁，去瘀生新”?！把髣樱瑒t走而不能生；血不動，則止而不能生”，雖川芎辛散，其生血妙在動，不在散。行氣開郁，升清陽之氣，去頭之濕氣，善于疏通，可清神生新。二者配伍，可使血行流利，腦絡(luò)通暢，精得上乘而充髓，血得上行而養(yǎng)腦，以奏活血祛瘀，開竅醒神之效。

本研究通過TCMSP平臺的OB和DL篩選，以及查找相關(guān)文獻(xiàn)對中藥中的特征化合物予以補充，獲得丹參-川芎的25個化合物，其中丹參的有效成分中丹參酮IIA的活性最高，可以作用32個靶點，而在川芎中活性最高的是川芎嗪，作用靶點達(dá)到了27個。研究顯示[12,13]，丹參酮IIA可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增生，并進(jìn)一步降低IL-1β、TNF-α炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和抑制Tau蛋白過度磷酸化對抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮治療AD的作用。研究發(fā)現(xiàn)[8]，川芎嗪可通過作用PI3K/Akt通路,調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)，從而拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

GO富集分析結(jié)果表明，“丹參-川芎”藥對的作用靶點分布在多種細(xì)胞組分中，以胞質(zhì)為主，通過多種結(jié)合方式參與生物進(jìn)程，包括炎癥反應(yīng)、凋亡過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)、老化、記憶、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控、對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、積極調(diào)節(jié)白細(xì)胞激活、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等等。研究顯示[14]，腦內(nèi)炎性反應(yīng)是AD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。研究證實[15,16]，細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)在AD的發(fā)生和發(fā)展的過程中扮演著極其重要的角色。提示“丹參-川芎”藥對可能通過多靶點、多通路發(fā)揮治療AD的作用。為了驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，本研究選擇丹參-川芎對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率、炎癥反應(yīng)、凋亡率進(jìn)行了實驗驗證。結(jié)果表明丹參-川芎能顯著提高PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率和抑制PC12細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及降低PC12細(xì)胞的凋亡率，發(fā)揮治療AD的作用。

KEGG富集通路分析表明，居第一位的是MAPK信號通路，居第二位的是NF-κB信號通路。MAPK信號通路在哺乳動物類細(xì)胞主要由p38信號通路、ERK信號通路和JNK信號通路組成。研究發(fā)現(xiàn)[17]，p38在腦組織中表達(dá)水平的高低與癡呆的嚴(yán)重程度有極大的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)[18]，p38MAPK通路可通過促使Bax發(fā)生轉(zhuǎn)位及激活Caspase-3活性而參與到神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的進(jìn)程當(dāng)中。研究表明[19]，抑制p38MAPK通路可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。NF-κB信號通路可參與神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡、多種基因調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[20]。研究指出[21]，p38MAPK與NF-κB關(guān)系密切，活化的p38 MAPK能誘使炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)從而活化NF-κB，若抑制p38MAPK的表達(dá)，也會抑制NF-κB的活化。丹參-川芎可能通過調(diào)控p38MAPK/NF-κB信號通路，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而延緩AD的發(fā)生和發(fā)展。

本研究選擇丹參-川芎對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的p38MAPK/NF-κB信號通路的調(diào)控作用進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果的實驗驗證。實驗結(jié)果表明丹參-川芎可明顯下調(diào)p38MAPK/NF-κB信號通路，最終抑制AD的發(fā)展。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究丹參-川芎對AD的具體作用靶點及分子機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參-川芎治療AD是通過多成分、多靶點、多通路協(xié)同產(chǎn)生主要的治療作用，為臨床深入研究丹參-川芎治療AD作用機制提供重要的指導(dǎo)意義。