許艷紅，閔 軍，周洪磊，張 怡，劉 衛(wèi)，胡曉珂,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所， 海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點實驗室，山東 煙臺 264003；3.福建省洋澤海洋生物科技有限公司，福建 福州 350600）

抗菌肽是動物、植物、真菌、細菌等生物產(chǎn)生的一類具有生物學(xué)活性的物質(zhì)總稱，包括陽離子抗菌肽、陰離子抗菌肽和其他類型抗菌肽。抗菌肽不僅具有抗菌、抗病毒、抗真菌等多種生物活性，還具有廣泛的免疫和非免疫功能[1]，是抗生素的天然替代品之一。在臨床、醫(yī)藥、禽畜養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品等行業(yè)都有良好的應(yīng)用前景。

防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，廣泛存在于植物、動物、真菌等多細胞真核生物中[2]。大防御素作為防御素的超家族成員，目前主要發(fā)現(xiàn)于海洋無脊椎動物中[3]。大防御素最早從節(jié)肢動物鱟（Tachypleus tridentatus）的顆粒血細胞中分離出來[4]，隨后在雙殼貝類、頭索動物文昌魚中相繼被鑒定[5-8]。大防御素成熟肽含有兩個串聯(lián)的結(jié)構(gòu)域，分別為高度疏水性N端結(jié)構(gòu)域和陽離子類β-防御素C端結(jié)構(gòu)域[3-4]。其中，N端結(jié)構(gòu)域與其他防御素沒有任何同源性，被認為是大防御素的標(biāo)志[9]， 而C端結(jié)構(gòu)域與脊椎動物β-防御素在結(jié)構(gòu)和功能上相似，因此普遍認為β-防御素是大防御素進化而來的[3,10]。大防御素的兩個功能域抗菌活性不同，N端結(jié)構(gòu)域主要抗革蘭氏陽性菌，C端結(jié)構(gòu)域主要抗革蘭氏陰性菌[4]，在菌存在的條件下，牡蠣（Crassostrea gigas）大防御素Cg-BigDef1的N端結(jié)構(gòu)域驅(qū)動大防御素組裝納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)誘捕病原菌的能力可為新型藥物的開發(fā)提供參考[3]。目前，大防御素在生物體內(nèi)合成量少，化學(xué)合成成本高，導(dǎo)致大防御素的應(yīng)用開發(fā)緩慢。本文將從來源與分布、分子結(jié)構(gòu)與遺傳進化、組織表達與調(diào)控、作用機理等方面對大防御素的研究進展進行闡述，并展望大防御素在水產(chǎn)養(yǎng)殖和育種、水產(chǎn)源食品安全、基因工程和抗菌藥物研發(fā)等方面的應(yīng)用潛力，以期為大防御素的應(yīng)用提供參考。

1 大防御素的來源與分布

目前大防御素蛋白主要發(fā)現(xiàn)于軟體動物、節(jié)肢動物鱟、頭索動物文昌魚中，都屬于兩側(cè)對稱動物。根據(jù)兩側(cè)對稱動物的分類，對大防御素的分布進行了動物門、綱上的定位（圖1）。根據(jù)18S rRNA序列比對結(jié)果將兩側(cè)對稱動物進行遺傳學(xué)分類，分為原口動物和后口動物，原口動物按照“蛻皮假說”包括冠輪動物總門和蛻皮動物總門[11-12]，由圖1可知，大防御素在蛻皮動物總門中的分布十分狹窄，僅在節(jié)肢動物鱟中發(fā)現(xiàn)有大防御素。 盡管節(jié)肢動物昆蟲綱、蛛形綱、甲殼綱中動物數(shù)量龐大，但仍未發(fā)現(xiàn)有大防御素的蹤跡。

圖1 大防御素在動物類群中的分布[9]Fig.1 Distribution of big defensins in animal groups[9]

大防御素在冠輪動物中分布廣泛，軟體動物中幾乎所有的雙殼綱貝類均發(fā)現(xiàn)有大防御素，包括牡蠣[6]、貽貝[5]、 扇貝[7,13-15]、蛤[16]、魁蚶[17]等海洋無脊椎動物，特別地，還包括淡水生物三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）[18]。目前，盡管大防御素主要在軟體動物門的雙殼綱中被報道，但Gerdol等[9]從后生動物的進化過程出發(fā)，根據(jù)目前大防御素的物種分布，發(fā)現(xiàn)大防御素在軟體動物中的分布并不局限于雙殼綱類，預(yù)測在腹足綱（Gastropoda）、頭足綱（Cephalopoda）動物，以及冠輪動物總門中的環(huán)節(jié)動物門（Annelida）、帚蟲動物門（Phoronida）、苔蘚動物門（Bryozoa）動物中也含有大防御素基因。目前，在頭足綱動物章魚、魷魚以及腕足動物門舌形貝（Lingula unguis）的基因組中識別出了大防御素蛋白的基因序列，但基因是否能表達還有待進一步的鑒定。此外，大防御素在后口動物中也存在，但是其分布非常狹窄，僅限于頭索動物亞門文昌魚屬（Branchiostoma）[8]。 綜上，大防御素在物種中的分布是分散的，可能是由于某些物種中存在大防御素基因的丟失，而在另外一些物種中得以選擇性地保留。

2 大防御素的分子結(jié)構(gòu)、基本性質(zhì)與進化關(guān)系

根據(jù)脊椎動物防御素的結(jié)構(gòu)和6 個保守的半胱氨酸的配對模式可將其分為α-防御素、β-防御素、θ-防御素。α-防御素是最早被報道的防御素，最先分離于兔巨噬細胞[19]，目前在人、馬、兔、鼠等少數(shù)哺乳動物的中性粒細胞和腸壁細胞中發(fā)現(xiàn)[2]。α-防御素通常由29～35 個氨基酸殘基組成，6 個保守的半胱氨酸的配對方式為Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5。研究發(fā)現(xiàn)α-防御素的基因起源于β-防御素基因[20]。β-防御素是最古老的脊椎動物防御素類型，分布極其廣泛，從魚類這種低等脊椎動物到鳥類再到哺乳類動物中均有大量的β-防御素發(fā)現(xiàn)。β-防御素通常由36～45 個氨基酸組成，6 個保守的半胱氨酸的配對方式為Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6[10]。β-防御素的功能廣泛，除具有廣譜抗菌活性外，在動物體內(nèi)還可作為先天免疫和獲得性免疫的溝通橋梁，作為免疫調(diào)節(jié)劑提高機體的免疫能力[21]。θ-防御素存在于恒河猴、狒狒等非人靈長類動物中，分布極其窄[22]。θ-防御素是由兩個截短的α-防御素組成的環(huán)狀二聚體多肽，含有18 個氨基酸殘基[23-24]，6 個保守的半胱氨酸的配對方式為Cys1-Cys6、Cys2-Cys5、Cys3-Cys4[2]。θ-防御素基因是由α-防御素基因進化而來的[25]。雖然無脊椎動物大防御素分子中也同樣含有3 個保守的二硫鍵，而且其二硫鍵的連接方式與脊椎動物β-防御素相同，然而，大防御素從防御素中獨立分支出來，其結(jié)構(gòu)特點有別于脊椎動物防御素。動物防御素的分布、大小、結(jié)構(gòu)特點以及進化關(guān)系見表1。

表1 動物防御素的分布、氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特點以及進化關(guān)系Table 1 Distribution, amino acid sequences, structural characteristics and evolutionary relationships of animal defensins

2.1 大防御素的基因結(jié)構(gòu)

根據(jù)序列和物種的不同，大防御素基因結(jié)構(gòu)也有所區(qū)別，但是大多數(shù)貝類和文昌魚的大防御素基因都含有3 個外顯子[9]。牡蠣大防御素是一個多序列家族，包含Cg-BigDef1、Cg-BigDef2、Cg-BigDef3基因簇。Cg-BigDef3具有一個典型大防御素基因結(jié)構(gòu)，含有3 個外顯子和2 個內(nèi)含子，第一個外顯子轉(zhuǎn)錄部分5′非編碼區(qū)序列，第2個外顯子編碼部分5′非編碼區(qū)序列、信號肽、前肽序列以及成熟肽的N端結(jié)構(gòu)域，第3個外顯子編碼富含半胱氨酸的C端類β-防御素結(jié)構(gòu)域和部分3′非編碼區(qū)序列（圖2）。大防御素基因結(jié)構(gòu)也有一些特殊性，如Cg-BigDef1和Cg-BigDef2的基因組結(jié)構(gòu)相似，只含有兩個外顯子和一個內(nèi)含子，這與三者的表達類型相一致，即Cg-BigDef3為組成型表達，Cg-BigDef1和Cg-BigDef2為誘導(dǎo)型表達，說明Cg-BigDef3僅編碼部分5′非編碼區(qū)序列的外顯子對于蛋白的表達具有重要作用[6]，同時也說明含有3 個外顯子的大防御素基因結(jié)構(gòu)更原始。蝦夷扇貝My-BigDef基因是由4 個外顯子和3 個內(nèi)含子組成，也含有一個僅編碼5′非編碼區(qū)的外顯子[13]，并且其成熟肽N端的編碼在第2個和第3個外顯子之間隔開。顯示出大防御素基因結(jié)構(gòu)具有多樣性，暗示了大防御素在不同物種中的遺傳機制不同[9]。然而，從圖2中可以看出這些大防御素基因結(jié)構(gòu)雖然存在差異，但是C端結(jié)構(gòu)域均是由單一的外顯子編碼，顯示出保守區(qū)域的保守表達。

圖2 幾種大防御素基因結(jié)構(gòu)示意圖[6,13,29]Fig.2 Gene architecture of big defensins[6,13,29]

2.2 大防御素的蛋白結(jié)構(gòu)

大防御素在生物體內(nèi)首先是以前體的形式存在，包括信號肽、前域、成熟肽3 個部分[13,18]（圖3）。在抗菌肽中，前域普遍存在，例如鱟素[32]、貽貝肽[33]、地中海貽貝類防御素肽[34]和貽貝素[35]等。前域的作用可能是將分子導(dǎo)向儲存在它們的特定顆粒中，阻斷對宿主細胞的毒性，亦或是穩(wěn)定蛋白水解過程中前體的構(gòu)象[36]。但前域與大防御素的儲存、成熟的相關(guān)性還不明確。大防御素是一種分泌肽，信號肽的存在有利于肽的分泌。大防御素成熟肽的獲得首先是信號肽酶切除信號肽，然后類KeΧ-2的蛋白酶識別Arg-Χ（n）-Arg/Lys-Ary位點并進行切割，酶切后，得到含有79～94 個氨基酸殘基的成熟肽[10]。這種情況在脊椎動物β-防御素中也有發(fā)現(xiàn)[21]。

圖3 大防御素氨基酸序列的多重比對[3,5]Fig.3 Multiple sequence alignment of big defensin peptides[3,5]

2.2.1 大防御素的初級結(jié)構(gòu)

大防御素的初級結(jié)構(gòu)分為結(jié)構(gòu)殘基和功能殘基。結(jié)構(gòu)殘基與高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及生物利用度緊密相關(guān)，這類氨基酸殘基高度保守。功能殘基則主要是指一些電荷性、疏水性氨基酸殘基[30]。大防御素的最典型結(jié)構(gòu)殘基是6 個保守的半胱氨酸殘基，參與形成3 個分子內(nèi)二硫鍵（圖3）。二硫鍵的存在使大防御的結(jié)構(gòu)更加緊密，保證高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，有利于更好地發(fā)揮抗菌活性。大防御素成熟肽N端含有大量的疏水性氨基酸殘基，使N端結(jié)構(gòu)域高度疏水，與大防御素鹽離子穩(wěn)定性 相關(guān)[3,37]。大防御素的C端含有陽離子氨基酸殘基，使C端具有功能性，對革蘭氏陰性菌有更強的抗性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，功能域中所帶的電荷與生物活性有很強的相關(guān)性，電荷的增加與活性的提高有關(guān)。且通常有一個最佳的活性電荷數(shù)，超過或低于這個值越多，活性越低[38]。鱟大防御素Tt-BigDef由于既有親水性又有疏水性的特點，是一種兩親性分子[39]。目前，研究已證明兩親性特征是多種抗菌肽殺菌活性所必需的結(jié)構(gòu)特征之一[38]。說明大防御素發(fā)揮抗菌作用時，2 個結(jié)構(gòu)域均有參與，Loth等[3]證明二者具有協(xié)同作用。然而，牡蠣大防御素Cg-BigDef1與鱟大防御素Tt-BigDef不同，其具有疏水性。Cg-BigDef1、Tt-BigDef中連接兩個結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)大小不同（圖3），進而導(dǎo)致兩結(jié)構(gòu)域在空間構(gòu)象中的方向不同，致使兩者存在理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的差異，而具體的原因有待進一步研究。

2.2.2 大防御素的高級結(jié)構(gòu)大防御素的高級結(jié)構(gòu)的研究包括二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)， 而三級結(jié)構(gòu)僅限于鱟大防御素Tt-BigDef和牡蠣大防御素Cg-BigDef1（圖4），鱟大防御素Tt-BigDef的二級結(jié)構(gòu)以及高級結(jié)構(gòu)為N端含有平行的兩股β-折疊片，與兩個α-1,2-螺旋連接形成β1-α1-α2-β2模式（圖3），形成核心具有疏水性的球形結(jié)構(gòu)（高度疏水性N端結(jié)構(gòu)域）； C-端含有4 條反向平行的β-折疊片，形成β3-β4-β5-α3-β6模式，3 個二硫鍵分別連接β3-β6、β4-α3、β4-β5環(huán)與β6，得到由二硫鍵穩(wěn)定的C端結(jié)構(gòu)（陽離子類β-防御素C端結(jié)構(gòu)域）（圖3）[37]。Loth等[3]采用自然化學(xué)連接法合成了牡蠣大防御素Cg-BigDef1以及兩個分離的功能域，完整的Cg-BigDef1具有與鱟大防御素相似的二級結(jié)構(gòu)，含有6 個β-折疊結(jié)構(gòu)和3 個α-螺旋結(jié)構(gòu)。如圖4所示的鱟大防御素和牡蠣大防御素的空間結(jié)構(gòu)，二者二級結(jié)構(gòu)相同，但空間構(gòu)象中兩功能域的方向不同，可能是連接區(qū)的柔性不同導(dǎo)致的。

圖4 鱟大防御素Tt- BigDef（A）和牡蠣大防御素Cg-BigDef1（B）的空間結(jié)構(gòu)[9,37]Fig.4 3D structures of Tt-BigDef (A) and Cg-BigDef1 (B)[9,37]

2.3 大防御素的基本性質(zhì)

大防御素作為防御素的超家族成員，具有保守的半胱氨酸序列，有良好的pH值和熱穩(wěn)定性[40]，且水溶性較好，能耐受飼料加工過程中的高溫高壓等劇烈條件[41]。哺乳動物β-防御素抗菌活性嚴重受到鹽離子濃度影響[42-43]， 大防御素由于具有兩種功能域，而具有鹽離子穩(wěn)定性。Loth等[3]比較大防御素與β-防御素時，發(fā)現(xiàn)大防御素較β-防御素多一個N端疏水性結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域?qū)Υ蠓烙氐柠}離子穩(wěn)定性具有重要作用。牡蠣大防御素Cg-BigDef1在300 mmol/L和400 mmol/L NaCl的高鹽濃度下仍能保持較強的抗菌活性，主要在于大防御素的兩個結(jié)構(gòu)域的共價結(jié)合[3]。

2.4 大防御素的進化分析

大防御素的系統(tǒng)進化樹（圖5）顯示大防御素在同一物種如貽貝（Mytilus galloprovincialis）中發(fā)生了變異，且這些變異都是單源的（氨基酸序列相似性為49.59%～81.03%），可能是串聯(lián)重復(fù)基因和同源基因置換后快速分子多樣化的結(jié)果[9]。貽貝大防御素與牡蠣大防御素（相似性為48.18%～59.95%）被歸為同一單源分支，二者的親緣關(guān)系較其他物種高，與扇貝屬的大防御素親緣關(guān)系（相似性為34.19%～38.05%）最遠。貽貝和扇貝屬大防御素種內(nèi)多樣性要大于種間多樣性。目前，大防御素的系統(tǒng)進化樹只能解釋部分大防御素的進化問題，更加詳細的信息還需要結(jié)合更多大防御素的 基因組結(jié)構(gòu)、基因變異以及物種分布鑒定知識才能了解。Gerdol等[9]將大防御素基因在物種中的分布與后生動物的物種進化樹結(jié)合進行分析，預(yù)測出大防御素基因出現(xiàn)在兩側(cè)對稱動物的祖先中，但是目前還并未在兩側(cè)對稱動物進化祖先中發(fā)現(xiàn)大防御素的同源物，對大防御素的鑒定仍需進一步展開。

圖5 大防御素的系統(tǒng)進化樹[5-6,9]Fig.5 Phylogenetic tree of big defensins[5-6,9]

大防御素C端結(jié)構(gòu)域與β-防御素在拓撲結(jié)構(gòu)和功能上具有相似性。一般認為在系統(tǒng)發(fā)育上進化關(guān)系較遠的物種之間分子具有結(jié)構(gòu)相似性，分為兩種：一種是分子結(jié)構(gòu)和功能的趨同進化；另一種是兩種結(jié)構(gòu)和功能相近的分子具有遺傳進化的關(guān)系。目前，關(guān)于大防御素與哺乳動物β-防御素的關(guān)系，學(xué)者更傾向于后一種。大防御素在原口動物和后口動物（文昌魚）中均有存在（圖1），而后口動物中頭索動物、尾索動物和脊椎動物都是由古老的脊索動物進化而來的，頭索動物文昌魚是無脊椎動物進化為脊椎動物過程中的過渡生物，文昌魚中大防御素的發(fā)現(xiàn)讓學(xué)者更容易相信無脊椎動物大防御素與脊椎動物防御素之間在進化上具有一定的相關(guān)性。Zhu Shunyi等[10]基于基因水平上的分析，發(fā)現(xiàn)這兩種防御素基因高度保守區(qū)域均含有一個保守的相位1內(nèi)含子（處于密碼子內(nèi)的第一和第二核苷酸之間），均在C端結(jié)構(gòu)域的5′端，猜想脊椎動物β-防御素基因是由大防御素基因經(jīng)過外顯子重排或外顯子內(nèi)含子化進化而來的。進化關(guān)系較遠的基因在結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子相位上的保守，可以認為這些基因具有共同的起源[44]。Gerdol等[9]認為大防御與脊椎動物β-防御素具有共同的起源，并且大防御素在不同物種中是采用不同的遺傳機制進行進化的。

而對無脊椎動物大防御素和脊椎動物的α-防御素、β-防御素、θ-防御素（圖6）的系統(tǒng)發(fā)育分析并沒有表現(xiàn)出脊椎動物防御素是由大防御素進化的關(guān)系，其中的原因可能是大防御素在無脊椎動物物種的分布少且分散，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不夠全面，亦或是這種方法的可靠程度不足以說明問題。

圖6 動物防御素和大防御素的系統(tǒng)進化樹[5-6,29]Fig.6 Phylogenetic tree of big defensins and defensins[5-6,29]

3 大防御素的組織表達與調(diào)控

3.1 大防御素的組織表達多態(tài)性

大防御素作為無脊椎動物先天免疫系統(tǒng)中的重要效應(yīng)因子，在不同物種中的組織表達模式不同，呈現(xiàn)出多態(tài)性的特點（表2）。首先，大防御素在組織中的表達具有多樣性。在同一屬的物種中，大防御素在不同組織中的表達情況不同，如蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）大防御素基因My-BigDef在血液中的相對表達量最低，在外套膜中的相對表達量最高，消化腺肝胰臟和閉殼肌中相對表達量較高，外套膜可能是My-BigDef的重要合成器官[13]。海灣扇貝（Argopecten irradians）大防御素基因Ai-BigDef主要在血細胞中表達，在鰓中也有微量表達，但是在其他檢測組中幾乎不表達[14]。而同一物種中大防御素基因的變異型在組織中的表達情況也不相同，如貽貝中現(xiàn)已報道了6 種大防御素基因簇，其中My-BigDef1和My-BigDef3分別在消化腺和鰓中的相對表達量最高，在其余組織中均無法檢出，而My-BigDef2/6主要在外套膜中表達，但在消化腺和肌肉中也有少量表達[5]。另外，大防御素在不同物種中具有組織表達特異性，如牡蠣大防御素基因Cg-BigDef家族對血細胞具有特異性[6]，貽貝、魁蚶大防御素基因的主要表達組織為消化腺[5,17]，櫛孔扇貝（Mimachlamys nobili）、紫扇貝（Argopecten_purpuratus）大防御素基因Cn-BigDef、Ap-BigDef1主要 在外套膜中表達[7,15]。某些大防御素基因不在血細胞中表達而特異性地在組織中表達，說明該大防御素可能是在組織上皮細胞的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，也可能是與維持局部組織表面的菌群穩(wěn)態(tài)有關(guān)[45]。

表2 大防御素基因在軟體動物不同組織中的組成型表達Table 2 Constitutive expression profiles of big defensin genes in different tissues of bivalve mollusks

3.2 大防御素的表達調(diào)控

3.2.1 大防御素在菌刺激下的組織表達響應(yīng)多樣性

在同一物種中，根據(jù)菌刺激下做出的響應(yīng)不同，大防御素基因分為組成型和誘導(dǎo)型表達類型。如弧菌（Vibrio）刺激前，牡蠣的3 個大防御素基因簇中Cg-BigDef1、Cg-BigDef2表達量很低，而在弧菌刺激后，Cg-BigDef1、Cg-BigDef2的表達量顯著上調(diào)，其表達受到弧菌刺激的強烈誘導(dǎo)，屬于誘導(dǎo)型表達類型。而Cg-BigDef3在感染前后表達量無明顯變化，表達不受菌感染的影響，屬于組成型表達類型[6]。這說明牡蠣中存在一個基本的免疫因子儲存過程以及應(yīng)激反應(yīng)機制，機體受到菌感染時，免疫系統(tǒng)能及時發(fā)揮作用，抵制病原體的侵害。蝦夷扇貝大防御素基因My-BigDef在血細胞中組成型表達量最低，而鰻弧菌（Vibrio anguillarum）刺激24 h后，血液中大防御素的表達量急劇升高，達到組成型表達量的十幾倍，菌刺激強烈誘導(dǎo)了蝦夷扇貝血細胞中大防御素基因的表達[13]。然而，對于紫扇貝來說，血細胞中大防御素基因Ap-BigDef1不受菌刺激調(diào)控[7]。

在軟體動物中，菌刺激下，大防御素基因的表達量會有一個動態(tài)變化過程，菲律賓蛤蜊（Venerupis philippinarum）大防御素基因Vp-BigDef、紫扇貝大防御素基因Ap-BigDef1、魁蚶大防御素基因Sb-BigDef1、海灣扇貝大防御素基因Ai-BigDef表達量開始會隨著菌刺激時間的延長而逐漸上調(diào)，一定時間表達量達到峰值[7,14,16-17]，而櫛孔扇貝大防御素基因Cn-BigDef、三角帆蚌大防御素基因Hc-BigDef隨著菌刺激表達的時序變化而不同，在達到峰值之前，會有表達量顯著降低的情況，之后再顯著上調(diào)[15,18]，可能的解釋是：1）表達大防御素的細胞會向感染部位聚集，導(dǎo)致其他組織中細胞減少致使大防御素的表達量下降，而細胞減少誘導(dǎo)了細胞的增殖，進而引起后續(xù)大防御素表達量的增加；2）表達大防御素的細胞被激活后會先分泌出已合成的大防御素成熟肽，因此導(dǎo)致了大防御素基因轉(zhuǎn)錄的減少[46]。目前，關(guān)于環(huán)境刺激對大防御素的影響僅限于菌刺激，而其他環(huán)境刺激的影響也需要進行研究，以便有利于更好地理解大防御素在宿主中的功能。

3.2.2 大防御素的表達受NF-κB/Rel信號通路調(diào)控

大防御素表達不僅要受到外界環(huán)境因子的調(diào)控，而在宿主中的表達還受到宿主內(nèi)因子的影響。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，大防御素等抗菌肽基因的表達要受到核因子（nuclear facter，NF）-κB/Rel信號通路調(diào)控。NF-κB/Rel家族是由NF-κB1（p50和它的前體p105）、NF-κB2（p52和它的前體p100）、RelA（p65）、c-Rel和RelB組成。NF-κB抑制劑是與NF-κB/Rel家族相互作用的重要物質(zhì)之一，在很大程度上，NF-κB/Rel信號通路的激活依賴于NF-κB抑制劑蛋白的大量降解，因此，NF-κB抑制劑被作為NF-κB/Rel信號通路的主要控制成分，在脊椎動物和無脊椎動物抗菌肽基因表達調(diào)控中起到了關(guān)鍵作用[47]。Oyanedel等[48]在扇貝中發(fā)現(xiàn)了編碼NF-κB抑制劑的基因，采用RNA干擾技術(shù)抑制NF-κB的抑制劑表達，發(fā)現(xiàn)扇貝大防御素的表達顯著上調(diào)，且對照組中編碼NF-κB抑制劑基因在扇貝的所有組織中均能表達，而扇貝大防御素基因Ap-BigDef1在所有組織中也均有表達，說明大防御的表達受到NF-κB/Rel信號通路的調(diào)控。牡蠣中Rel基因的發(fā)現(xiàn)為大防御素受NF-κB/Rel信號通路調(diào)控提供了新的證據(jù)。Li Yinan等[49]對牡蠣進行菌刺激發(fā)現(xiàn)Rel基因的表達會增加，而通過干擾Rel基因的表達發(fā)現(xiàn)大防御素基因CgBigDef1的表達會減少。因此，通過對大防御素等抗菌肽基因表達調(diào)控的研究有利于更好地理解菌刺激下機體產(chǎn)生的不同免疫響應(yīng)的分子機制。

4 大防御素的作用機理

目前，大多數(shù)抗菌肽主要是與細菌細胞膜發(fā)生相互作用在膜上成孔或形成離子通道等來增加膜的滲透性，引起細胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏以及跨膜電勢的瓦解，進而導(dǎo)致細胞死亡[50-51]。而雙功能域的大防御素表現(xiàn)出不同于一般抗菌肽的抗菌機制。研究顯示，大防御素可能有兩種不同的抗菌過程：一種是鱟大防御素Tt-BigDef類型的抗菌作用，即大防御素在發(fā)揮抗菌作用時，N端結(jié)構(gòu)域插入到細菌細胞膜中引起膜穿孔導(dǎo)致細胞死亡[37]，強調(diào)了N端結(jié)構(gòu)域的直接抗菌作用；另一種是牡蠣大防御素Cg-BigDef1類型的抗菌作用，其抗菌作用是在菌的刺激下，N端結(jié)構(gòu)域驅(qū)動大防御素自組裝成的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)誘捕細菌進而將其殺死[3]。大防御素形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力也被稱為肽聚合能力，N端結(jié)構(gòu)域被認為是這類大防御素發(fā)生肽聚合的重要驅(qū)動力，肽聚合使大防御素與細菌充分接觸，而真正發(fā)揮殺菌活性的是C端結(jié)構(gòu)域[9]，強調(diào)了N端結(jié)構(gòu)域的輔助作用。通過對上述牡蠣大防御素Cg-BigDef1和鱟大防御素Tt-BigDef結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)的比較概述，猜想可能是連接區(qū)長度的不同、空間結(jié)構(gòu)中方向的不同共同導(dǎo)致了兩者表面性質(zhì)的差異，進而影響了抗菌作用。紫扇貝大防御素Ap-BigDef N端同樣具有肽聚合能力[52]，而Ap-BigDef兩結(jié)構(gòu)域間的連接區(qū)的長度與鱟大防御素接近，表明連接區(qū)的長度不是大防御素抗菌機制不同的直接原因，而空間構(gòu)象對抗菌機制的影響有待進一步探討和研究。此外，研究發(fā)現(xiàn)大防御素自組裝成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)還必須要有細菌的參與[3]，可能是細菌中的某種物質(zhì)或結(jié)構(gòu)觸發(fā)其構(gòu)象的改變進而導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，鱟大防御素Tt-BigDef在膠束溶液中N端空間構(gòu)象會發(fā)生改變[37]，但其是否能形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)還有待研究。因此，大防御素抗菌機理還有待進一步深入研究。

5 大防御素的應(yīng)用潛力

5.1 抗菌耐藥性的應(yīng)用

由于抗生素的長期使用與濫用對耐藥基因型細菌產(chǎn)生了選擇壓力，加速了耐藥型細菌的進化，導(dǎo)致細菌耐藥性的廣泛傳播與擴散，對于動物和人細菌性疾病的預(yù)防和治療是一種巨大的隱患。相較于傳統(tǒng)抗生素，抗菌肽藥效學(xué)和抗菌機制在預(yù)防耐藥性進化方面顯示出巨大優(yōu)勢。目前，已有超過3 100 種天然抗菌肽在大量的植物和動物中發(fā)現(xiàn)[53]，具有巨大的應(yīng)用前景。牡蠣大防御素Cg-BigDef1對臨床、環(huán)境分離的菌株以及對抗生素具有多重耐藥性的菌株均有抗性，其通過形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)誘捕病原菌來達到殺菌的目的，不會加速細菌耐藥性的進化，且對哺乳動物細胞無免疫源性、無抗性[9]，有望應(yīng)用于哺乳動物中多重耐藥菌的感染治療，有作為抗生素替代品的巨大潛力。近年來的研究發(fā)現(xiàn)不同抗菌肽之間具有抗菌協(xié)同作用[54]，抗菌肽的協(xié)同作用可以減少耐藥性基因進化的機率[55]，特別是那些可以感染多種動物的病原菌，宿主會大量表達多種抗菌肽，在這些抗菌肽的協(xié)同作用下通過殺死病原菌來保障宿主的健康。因此，應(yīng)進行大防御素與傳統(tǒng)的抗生素結(jié)合使用研究，利用不同抗菌物質(zhì)的協(xié)同抗菌作用來應(yīng)對細菌耐藥性的問題。梁正敏等[56]研究發(fā)現(xiàn)牛中性粒細胞β-防御素5可協(xié)助利福平發(fā)揮更強的牛分支桿菌抗性，說明防御素與抗生素的聯(lián)合使用具有巨大的應(yīng)用潛力。

5.2 水產(chǎn)養(yǎng)殖和育種、水產(chǎn)源食品安全中的應(yīng)用

5.2.1 抗菌劑和疾病診斷

2008年，有研究發(fā)現(xiàn)β-防御素有對創(chuàng)傷感染和肺部感染疾病診斷的潛力[57]。而大防御素是無脊椎海洋動物先天免疫中的重要效應(yīng)因子，當(dāng)機體受到病原菌感染時，不同組織中的大防御素基因的表達顯著上調(diào)，因此大防御素可作為海洋養(yǎng)殖軟體動物疾病診斷的依據(jù)。大防御素具有廣譜抗菌活性，對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物抵抗病原菌感染具有重要作用，可作為抗菌劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中以防止病原菌的感染。目前研究顯示，大防御素對革蘭氏陽性菌具有較強的抗性，特別地，大防御素Cg-BigDef1是少數(shù)對水產(chǎn)致病性弧菌表現(xiàn)出顯著抗性的抗菌肽[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的抗菌活性不僅具有廣度，而且對于某些特定菌株還具有特異性[58]。因此，從基因、蛋白等水平上研究大防御素的抗菌特異性對于水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義，能夠防止殺害養(yǎng)殖動物中的有益菌群，且能從解決外患和防止內(nèi)憂入手更好地達到防止動物病原感染的目的。

5.2.2 作為評估宿主免疫能力標(biāo)志物的潛力

研究發(fā)現(xiàn)，物種特異性的抗菌肽能反映宿主的病原抗菌能力[59]。大防御素為海洋無脊椎動物所特有的抗菌肽，可通過作為評估宿主免疫系統(tǒng)能力強弱的標(biāo)志物來篩選含有大防御素的牡蠣、扇貝等優(yōu)良養(yǎng)殖物種親本，以促進養(yǎng)殖動物的遺傳改良。吳彪等[60]通過測定魁蚶不同發(fā)育時期大防御素的mRNA和蛋白質(zhì)的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)母源性大防御素能夠通過卵細胞傳遞給子代，并在卵子受精后被逐漸消耗。此外，牡蠣和貽貝中大防御素基因表現(xiàn)出很高的序列多態(tài)性和表達多態(tài)性，Schmitt等[61]研究發(fā)現(xiàn)通過免疫相關(guān)基因的表達多態(tài)性和序列多態(tài)性可以區(qū)分夏季死亡率高時的高生存率個體和低生存率個體，因此可以通過測定養(yǎng)殖物種在菌刺激時大防御素的表達情況來進行優(yōu)良品種的篩選。并且研究顯示大防御素基因在牡蠣中會發(fā)生存在缺失變異[62]，這是同一物種在基因水平上的個體差異，因此，大防御素可應(yīng)用于更易適應(yīng)環(huán)境、生物與非生物壓力的品種篩選。這些研究提示，可以通過了解先天免疫因子大防御素在子代中的表達規(guī)律，并結(jié)合母源免疫開發(fā)提高宿主體內(nèi)自身免疫因子含量的方法，來有效增強子代的免疫抵抗力，為科學(xué)制定提高養(yǎng)殖動物早期成活率的策略提供理論依據(jù)，進而促進魁蚶、牡蠣、扇貝等苗種繁育產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

5.2.3 水產(chǎn)品安全

大防御素來源于水產(chǎn)源生物的先天免疫系統(tǒng)，研究顯示化學(xué)合成和重組表達的大防御素對食品常見致病菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）甚至是耐多重藥物的金黃色葡萄球菌具有很強的抗性[3,52]，蛤蜊大防御素對魚類腐敗致病菌惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）具有很強的抗性[16]，將其應(yīng)用于水產(chǎn)生物中，有利于保證水產(chǎn)食品源的衛(wèi)生安全性和進行水產(chǎn)食品的防腐。

5.3 新型藥物開發(fā)——納米網(wǎng)的形成

大防御素的N端結(jié)構(gòu)域?qū)g-BigDef1、Ap-BigDef1形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對鹽離子穩(wěn)定以及抗菌活性至關(guān)重要[3,52]。一方面，可利用這一特性設(shè)計一種類似于大防御素N端結(jié)構(gòu)的藥物載體將細菌誘引至不同接觸靶點，使具有協(xié)同作用的抗菌肽與之充分接觸，保證殺菌的高效性，同時更好地規(guī)避耐藥性的風(fēng)險；另一方面，在一些需要采用耐鹽的抗菌肽治療的疾?。ㄈ缒覡罾w維癥）藥物開發(fā)方面，大防御素的N端結(jié)構(gòu)域在保證鹽離子穩(wěn)定抗菌活性上顯示出巨大優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)Cg-BigDef1不會引起哺乳動物細胞毒性[3]，說明大防御素的納米結(jié)構(gòu)對哺乳動物是安全的。綜上所述，通過從大防御素的結(jié)構(gòu)和抗菌特點逐步深入，可為新型藥物的開發(fā)提供新的設(shè)計思路。

6 大防御素的重組表達與分析檢測

鑒于大防御素的應(yīng)用前景廣泛，大防御素的高效獲得方法成為研究熱點。大防御素的重組表達是重要獲得途徑。Zhao Jianmin等[14]通過構(gòu)建鰻弧菌感染的海灣扇貝的cDNA文庫找到并克隆出海灣扇貝大防御素基因，根據(jù)釀酒酵母密碼子使用偏好優(yōu)化基因Ai-BigDef，亞克隆到重組表達載體pPIC9K中，由畢赤酵母GS115誘導(dǎo)表達了重組海灣扇貝大防御素，重組海灣扇貝大防御素對革蘭氏陽性菌和陰性菌具有抑制活性。此外，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離發(fā)酵液上清蛋白時有較多雜蛋白條帶，而畢赤酵母分泌的內(nèi)源蛋白極少[63]，雜蛋白條帶的出現(xiàn)可能是大防御素對宿主菌有溶菌作用，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白的溶出，這一現(xiàn)象需要進一步的解釋。畢赤酵母分泌表達外源蛋白的影響因素主要有密碼子偏愛性、基因中腺嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸（A、T）含量、啟動子、分泌信號、分子伴侶、基因拷貝數(shù)、糖基化修飾以及發(fā)酵條件等，近年來，針對這些影響因素開發(fā)了許多優(yōu)化畢赤酵母表達系統(tǒng)的策略，有望實現(xiàn)目的蛋白的高效表達[64]。 而鑒于大防御素對大腸桿菌（Escherichia coli）的抑菌作用較弱，2010年，Zhao Jianmin等[16]構(gòu)建了重組表達載體pET-21a-Vp-BigDef，以大腸桿菌BL21(DE3)-plysS為宿主菌成功表達了重組菲律賓蛤蜊大防御素，50 mL發(fā)酵液中可純化得到0.9 mg重組蛋白。同樣，Teng Lei[8]和González[7]等利用pET系列載體在大腸桿菌DE3中分別實現(xiàn)了頭索動物文昌魚大防御素Bj-Bigdef、紫扇貝大防御素Ap-Bigdef的重組表達，且均具有抗菌活性。為了提高大防御素的表達量，董姝君[18]進行了將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶與三角帆蚌大防御素在大腸桿菌中融合表達的嘗試，實現(xiàn)了融合蛋白表達，并且隨著時間的延長表達量逐漸增加。因此，通過畢赤酵母表達系統(tǒng)和大腸桿菌表達系統(tǒng)的不斷完善以及大防御素表達條件的不斷優(yōu)化可實現(xiàn)大防御素的高效表達。

目前，防御素的測定方法有競爭性化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法、狹縫印記測定法、半定量Western分析、酶聯(lián)免疫吸附法、非標(biāo)記液晶生物傳感器法、基于選擇性反應(yīng)監(jiān)測的蛋白質(zhì)組學(xué)法、高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法[65]。而大防御素的檢測方法主要是生產(chǎn)對應(yīng)的抗體，采用酶聯(lián)免疫吸附法進行檢測[7]，酶解法裂解大防御素后，利用高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法分析肽段進而對大防御素氨基酸進行分析[3]。針對大防御素的功能檢測主要是通過微量肉湯稀釋法測定大防御素對革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌、溶壁微球菌（Micrococcus lysodikicus）等）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、弧菌等）的最小抑菌濃度[14,16]來評判其抗菌效果。

7 結(jié) 語

大防御素具有廣泛應(yīng)用潛力，但其實際應(yīng)用首先要基于足夠的生產(chǎn)量。但目前生物體合成量少，直接從生物體中提取困難，化學(xué)合成成本比較高且技術(shù)還不夠成熟，無法達到應(yīng)用的需求。因此，基因工程菌體外重組表達成為獲取大防御素的重要途徑。目前，對于大防御素的重組表達進行了大腸桿菌和畢赤酵母表達系統(tǒng)的初步嘗試[7-8,14,16]，但有關(guān)表達量、產(chǎn)物純化以及純化產(chǎn)物生物學(xué)活性的研究資料還十分缺乏，僅處于生產(chǎn)階段，還未進入表達質(zhì)量評估階段。因此，今后研究的一個重點就是優(yōu)化大防御素體外重組表達，以獲得高表達、高質(zhì)量的大防御素。另外，為了更好地挖掘大防御素的抗生素替代潛力以及設(shè)計開發(fā)更多的新型藥物，需要加大大防御素相關(guān)基礎(chǔ)問題的研究，例如大防御素的分離鑒定、大防御素的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域的抗菌作用機理、大防御素與其他物質(zhì)如抗生素等的互作等。