呂靜祎，丁思楊，張俊虎，徐冬樂，孫明宇，張瀠支，葛永紅，勵建榮*

（渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要包括超氧陰離子自由基（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等，是對生命活動具有重要調節(jié)作用的細胞新陳代謝產物。研究表明，ROS是影響植物細胞膜脂過氧化和凋亡、導致植物衰老的主要原因之一[1-2]。果實的后熟衰老過程是ROS代謝與氧化的過程[3-4]。植物體內對ROS的清除系統(tǒng)主要包括兩類：一類是酶促清除系統(tǒng)，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過氧化酶（ascorbate peroxidase，APX）等抗氧化酶類；一類是非酶促清除系統(tǒng)，主要是一些抗氧化物質，如抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等[5]。

蘋果屬于呼吸躍變型果實，是我國主產水果之一[6]。 按照蘋果的成熟期早晚差異可分為早熟品種、中熟品種和晚熟品種，其中晚熟品種最耐貯藏，中、早熟品種則不耐貯藏。對棗、梨、葡萄及杏等果實上的研究表明，ROS代謝與不同品種果實的耐貯藏性密切相關[7-10]。遼寧省是我國重點蘋果產區(qū)之一，主栽品種包括‘金冠’‘富士’‘寒富’‘國光’等。其中，‘金冠’是中熟品種，采后易失水皺縮、軟化，易患傳染性果腐病等，貨架期不超過1 個月，不耐貯藏[11-12]；而‘富士’晚熟品種采后呼吸代謝低，耐貯藏，常溫下可貯藏3～4 個月[13]?！鸸凇汀皇俊彩鞘澜缟系膬纱笾髟云贩N。本研究以‘金冠’和‘富士’兩個蘋果品種為試材，分析常溫后熟期間ROS代謝相關變化，旨在為進一步深入研究不同品種蘋果耐貯藏性差異的分子機理提供理論依據，也為找到新的蘋果貯藏保鮮方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘金冠’與‘富士’蘋果分別于2017年9月16日和2017年10月7日采于遼寧錦州一果園。隨機選取大小、成熟度一致，無病蟲害和機械損傷的‘金冠’蘋果150 個、‘富士’蘋果390 個，分別用5 層瓦楞超硬紙板箱包裝，每箱30 個果，當天運回實驗室。

乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、α-萘胺、冰醋酸、濃氨水、硫酸、四氯化鈦、 硫代巴比妥酸、鹽酸、丙酮、氮藍四唑、三氯乙酸、無水醋酸鈉、愈創(chuàng)木酚等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

722N可見分光光度計、GXH-3051H型果蔬呼吸測定儀 上海精密科學儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計、GC-14A型氣相色譜儀 日本島津公司； GY-3指針式水果硬度計 浙江托普儀器有限公司；TGL-16高速冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限 公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果貯藏

蘋果于（23±2）℃、相對濕度為（65±5）%的條件下貯藏。每7 d分別隨機取15 個果實，進行硬度、呼吸強度和乙烯釋放量的測定；并分別選取6 個果實，將果肉切成邊長約0.2 cm的正方體后用液氮速凍混勻，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 硬度、呼吸強度及乙烯釋放量的測定

參考Lü Jingyi等[14]的方法，選取15 個蘋果測定呼吸強度和乙烯釋放量。將15 個果實分為3 份，每份5 個，稱質量后置于12 L干燥器中常溫密封1 h，然后收集1.0 mL氣體，用氣相色譜儀測定呼吸強度和乙烯釋放量，測定結果取平均值。呼吸強度和乙烯釋放量的結果分別以每秒每千克果實釋放的CO2物質的量和釋放的乙烯物質的量表示，單位均為nmol/（kg·s）。隨后對果實進行硬度的測定，在每個果實的赤道部位，間隔等距離選擇3 個點，削去一小塊厚約1 mm 的果皮，用GY-3指針式水果硬度計測定此3 個位置處果肉的硬度。

1.3.4 SOD、POD、CAT、APX和谷胱甘肽還原酶 活力的測定

SOD與POD活力的測定參考王陽等的方法[17]。CAT活力的測定參考Wang Yousheng等的方法[18]。APX活力的測定參考文獻[19]。谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力的測定參考Labo等的方法[20]。

1.4 數據處理與分析

上述各指標均重復取樣3 次，每個樣品重復測定3 次，取平均值。數據均以平均值±標準差表示。采用Excel 2010進行數據分析與作圖，用SPSS 22對數據進行t檢驗并進行統(tǒng)計分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 蘋果貯藏過程中硬度、乙烯釋放量和呼吸強度的變化

如圖1A所示，兩個品種的果肉硬度在整個貯藏期間呈現(xiàn)下降趨勢，‘金冠’在貯藏35 d時的果肉硬度為4.80 kg/cm2，而同一時間‘富士’的果肉硬度則為7.97 kg/cm2，是‘金冠’的1.66 倍。如圖1B～C所示，‘金冠’果實的呼吸強度和乙烯釋放量均在貯藏28 d時達到高峰，而‘富士’則在貯藏77 d時達到高峰?！鸸凇麑嵉暮粑鼜姸群鸵蚁┽尫帕吭谫A藏期間均顯著 或極顯著高于‘富士’（P＜0.05、P＜0.01），且峰值分別為‘富士’的2.70 倍和2.22 倍?？梢?，‘金冠’由于高的呼吸強度和乙烯釋放量，成熟衰老較快，因此貯藏期短。‘金冠’與‘富士’分別在第35天和第105天時果實硬度很低，已失去銷售和食用價值，故本實驗中‘金冠’與‘富士’的貯藏終點分別為第35天和第105天。

圖1 不同品種蘋果果實在貯藏期間硬度（A）、呼吸強度（B）和 乙烯釋放量（C）的變化Fig.1 Changes in firmness (A), respiration rate (B) and ethylene production (C) of different apple cultivars during postharvest storage

2.2 蘋果貯藏過程中·產生速率、H2O2含量及MDA含量的變化

圖2 不同品種蘋果貯藏期間·產生速率（A）、H2O2含量（B）和MDA含量（C）變化Fig.2 Changes in production rate (A), H2O2 content(B) and MDA content (C) of different apple cultivars during postharvest storage

2.3 蘋果貯藏過程中ROS代謝相關酶活力的變化

如圖3所示，‘金冠’中的SOD、POD、CAT活力在貯藏期間顯著或極顯著高于‘富士’。‘金冠’的SOD和CAT活力峰值分別出現(xiàn)在28、21 d，POD活力高峰出現(xiàn)在14 d，而‘富士’中這3 種酶的活力峰值均則出現(xiàn)在貯藏77 d。‘金冠’中的SOD、POD和CAT活力峰值分別為‘富士’的1.12、1.59、3.49 倍。

圖3 不同品種蘋果在貯藏期間SOD（A）、POD（B） 和CAT（C）的活力變化Fig.3 Changes in activities of SOD (A), POD (B) and CAT (C) in different apple cultivars during postharvest storage

2.4 蘋果貯藏過程中AsA含量、APΧ及GR活力的變化

如圖4A所示，兩個品種蘋果的AsA含量在整個貯藏期間逐漸下降，其中，‘富士’蘋果中的AsA含量顯著或極顯著高于‘金冠’蘋果（P＜0.05、P＜0.01）。在貯藏35 d后，‘富士’的AsA含量是‘金冠’的3.08 倍。如圖4B所示，‘金冠’和‘富士’的APΧ活力分別在貯藏21 d和貯藏77 d達到峰值，且‘金冠’的活力峰值是‘富士’的1.95 倍。如圖4C所示，在貯藏前28 d，‘金冠’的GR活力略高于‘富士’?！鸸凇汀皇俊O果GR活力分別在28 d和77 d出現(xiàn)峰值，且‘富士’的峰值是‘金冠’峰值的2.11 倍（圖4C）。

圖4 不同品種蘋果貯藏期間AsA含量（A）和APX（B）、 GR（C）活力的變化Fig.4 Changes in AsA content (A), APX activity (B) and GR activity (C) of different apple cultivars during postharvest storage

3 討 論

呼吸作用是基本的生命現(xiàn)象，蘋果是典型的呼吸躍變型果實。呼吸躍變型果實在達到呼吸躍變高峰后，食用品質迅速下降，很快便會失去耐貯藏性[21]。呼吸躍變的發(fā)生意味著果實衰老的開始。乙烯是促進躍變型果實成熟的重要內源激素，呼吸躍變型果實呼吸高峰的出現(xiàn)常常伴隨著乙烯合成的迅速增加[21]。本研究中，‘金冠’的呼吸高峰和乙烯高峰出現(xiàn)時間早于‘富士’，同時高峰值都大于‘富士’，表明‘金冠’在常溫貯藏期間的呼吸代謝旺盛，后熟速度比‘富士’快，也比‘富士’提前進入衰老階段，因此不耐貯藏。此外，果肉硬度是衡量耐貯性的重要指標[22]。由于‘金冠’成熟衰老速度比‘富士’快，在果肉硬度上則表現(xiàn)為硬度持續(xù)下降，軟化速度快，在35 d的時候硬度為4.80 kg /cm2，果肉已經綿軟，失去商品價值，而‘富士’在同一時間硬度為7.97 kg /cm2，仍保持較好的貯藏品質。

果蔬在正常生命活動中所需的O2中有1%會被傳送到線粒體、葉綠體以及過氧化物酶體中用以生成ROS，高濃度的ROS會造成生物分子的損害，ROS的大量積累 對果蔬細胞有毒性，會引發(fā)膜脂過氧化，導致細胞膜系統(tǒng)被破壞，加速果實衰老[2,23]。通常將H2O2和O2-·等ROS水平和MDA含量作為衡量果實組織衰老程度的重要指標[15]。 本研究中‘金冠’的O2-·產生速率、H2O2和MDA的含量在常溫貯藏期間（前35 d）均高于‘富士’蘋果，高水平的ROS導致其膜脂過氧化加劇，進一步加速果實組織衰老，使其衰老程度在貯藏前35 d遠高于‘富士’。O2-·可以通過SOD轉化為H2O2，然后可以通過CAT、POD和APΧ去除H2O2[24]。本研究發(fā)現(xiàn)‘金冠’中SOD、POD和CAT活力在貯藏期間高于‘富士’，可能是由于高的ROS水平需要高的酶活性進行代謝[25]。謝忠斌等在乙烯處理后的菠蘿蜜果實上也觀察到H2O2等ROS水平增加的同時伴隨著SOD、CAT等酶活力增加的現(xiàn)象[26]。需要注意的是，即使是‘金冠’的ROS代謝相關酶活性在常溫貯藏期間高于‘富士’，但其ROS水平也高于‘富士’，成熟衰老速度比‘富士’快，推測可能是由于‘金冠’果實中ROS代謝能力不足以清除過量積累的ROS。

AsA是AsA-GSH循環(huán)中的重要抗氧化劑，它在APΧ作用下，以自身被氧化形成脫氫抗壞血酸為代價，將H2O2還原成H2O[27]。APΧ和GR是AsA-GSH循環(huán)中的兩種關鍵酶，是抗氧化系統(tǒng)的關鍵參與者[28-29]。在AsAGSH循環(huán)中，GR可催化氧化型谷胱甘肽（glutathiol，GSSG）還原形成GSH，GSH又在脫氫抗壞血酸還原酶作用下將脫氫抗壞血酸還原成AsA，以補充AsA[30]。本研究中，‘金冠’在常溫貯藏期間的APΧ活力和GR活力高于‘富士’，而AsA含量低于‘富士’，可能是與‘富士’相比，‘金冠’的AsA被APΧ氧化的量不足以通過AsA-GSH循環(huán)進行補充，因此造成其AsA含量低。H2O2可以在細胞內擴散，被認為是ROS的信號物質，其在植物體內產生途徑較多，除了通過O2-·的歧化反應生成外，還可通過酶促反應生成[29]。與‘富士’相比，‘金冠’在常溫貯藏期間的高H2O2含量是否與其較低的AsA水平有必然聯(lián)系還需要進一步深入研究。

綜上所述，‘金冠’在常溫貯藏期間呼吸強度、乙烯釋放速率、MDA含量、ROS水平和與ROS代謝有關的酶活力均高于‘富士’，成熟衰老速度快，貯藏期短。因此，不同品種蘋果果實的耐貯藏性差異與體內ROS水平密切相關，但考慮到ROS產生和清除體系復雜性，蘋果果實的耐貯藏性與ROS代謝能力的聯(lián)系需要進一步研究闡明。今后應當在分子水平圍繞不同品種蘋果采后ROS代謝差異的作用機制進行深入研究與探討。