張 慧，楊瑞利，劉 芳，周賽楠，盧 娜，唐慶娟*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000）

卡拉膠又名角叉菜膠，是一種從鹿角菜、石花菜和麒麟菜等紅藻中提取出的天然多糖類植物膠體[1]。 卡拉膠由半乳糖和3,6-脫水半乳糖構(gòu)成重復(fù)二糖單位，并由α-1,3-和β-1,4-糖苷鍵交替連接而成碳骨架。根據(jù)其糖單位的硫酸化程度和位置，卡拉膠可主要分為κ-、ι-、λ- 3 種亞型[2-3]?？ɡz分子質(zhì)量巨大，天然卡拉膠的分子質(zhì)量可達到1.5×106～2×107Da；食品級卡拉膠分子質(zhì)量略低，約100 000～800 000 Da或200 000～400 000 Da?？ɡz經(jīng)酸降解得到的小分子質(zhì)量寡聚糖片段，被稱為降解卡拉膠，其分子質(zhì)量約為20 000～40 000 Da[2,4]。2003年歐盟委員會[5]及2007年食品添加劑聯(lián)合專家委員會[6]均規(guī)定，食品級卡拉膠中檢出分子質(zhì)量小于50 000 Da的寡糖相對含量不得超過5%。天然卡拉膠和食品級卡拉膠由于獨特的結(jié)構(gòu)和較高的分子質(zhì)量而具有特殊的理化性質(zhì)（如膠凝性、穩(wěn)定性和蛋白反應(yīng)性）。這些性質(zhì)使得高分子質(zhì)量卡拉膠廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如作為增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑等食品添加劑來改善食品的感官性能[1,7]。

然而，近幾十年來，有研究人員發(fā)現(xiàn)天然卡拉膠或食品級卡拉膠能夠誘發(fā)或促進腸道炎癥的發(fā)生或發(fā)展。如Borthakur等[8]發(fā)現(xiàn)3 種亞型的未降解卡拉膠均能誘發(fā)正常人腸道上皮細胞釋放白細胞介素-8并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；Wu Wei等[9]的研究表明卡拉膠預(yù)處理能夠加劇脂多糖誘發(fā)的結(jié)腸炎癥。但是也有研究表明，高分子質(zhì)量卡拉膠不會對腸道產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)。Weiner等[10]使用分子質(zhì)量范圍為196 000～257 000 Da的卡拉膠對大鼠干預(yù)90 d，實驗結(jié)束后大鼠腸道正常。由此可以看出，對于卡拉膠是否具有致結(jié)腸炎性的爭議一直存在。有研究人員指出，該爭議的產(chǎn)生不僅歸因于不同實驗中采用的卡拉膠特征不同，還可能是實驗動物的機體狀態(tài)不同導(dǎo)致的[11]。 而肥胖作為一種慢性炎癥的機體狀態(tài)，處于該狀態(tài)下卡拉膠的攝入是否更易誘發(fā)結(jié)腸炎癥則鮮被探究或證實。因此本實驗以肥胖小鼠為模型，探究不同劑量食品級κ-卡拉膠致結(jié)腸炎的可能性。此外，Bhattacharyya等[12]的研究表明卡拉膠能夠加劇肥胖誘發(fā)的系統(tǒng)炎癥，如導(dǎo)致更嚴重的葡萄糖（glucose，Glu）不耐受和胰島素抵抗等，說明卡拉膠對于營養(yǎng)素的消化吸收，如糖類和脂類的代謝也有一定程度的影響。因此本實驗將同時探討食品級κ-卡拉膠的攝入對肥胖小鼠脂質(zhì)代謝的影響。

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們的生活水平和生活習(xí)慣發(fā)生了巨大的改變，高熱量攝入的飲食結(jié)構(gòu)和低能量 消耗的工作方式使得肥胖癥的發(fā)生率越來越高。據(jù)報道， 至2016年，成年肥胖患者約為6.71×108人[13]；而中國肥胖人群比例在2013年已超過美國，位居世界首位[14]。隨著肥胖人群數(shù)量的增多，針對其精準營養(yǎng)及個性化干預(yù)治療也成為食品等行業(yè)的發(fā)展趨勢和研究熱點所在。因此，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，分析不同劑量的食品級κ-卡拉膠對肥胖機體的影響，包括其對結(jié)腸健康及脂質(zhì)代謝等的影響，旨在進一步探究卡拉膠在肥胖機體內(nèi)的安全性，為卡拉膠加工食品研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性C57BL/6Cnc小鼠（生產(chǎn)許可證號：SCΧK（京）2016-0006），6 周齡，體質(zhì)量17～19 g 北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

10%低脂對照飼料（TP23302）、60%高脂對照飼料（TP23300）及其受試物添加飼料 南通特洛菲科技有限公司。

食品級κ-卡拉膠 石家莊春信生物科技有限公司；便隱血檢測試劑盒（膠體金法） 艾博生物醫(yī)藥有限公司； 酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海艾萊薩生物科技有限 公司；TRIzol試劑 美國Thermo Fisher Scientific公司；5Χ All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EvaGreen 2Χ qPCR MasterMix定量試劑盒 加拿大ABM生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液、油紅O染液 武漢賽維爾生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、Glu測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司；基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

電動熒光顯微鏡 日本尼康公司；SPARK 10M酶 標儀 瑞士Tecan公司；Nanodrop 2000/2000C分光光 度計 美國Thermo Scientific公司；Χ960全自動醫(yī)用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分析 系統(tǒng) 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；Bioprep-24生物樣品均質(zhì)儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 卡拉膠特征及劑量確定

本課題組前期測定了卡拉膠亞型和分子質(zhì)量，確定其為κ-型，平均分子質(zhì)量為300 400 Da，不含有低分子質(zhì)量（＜50 kDa）片段，分散性良好[15]，符合食品級卡拉膠要求[4]。根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局推薦的人和小鼠之間有效劑量換算公式[16]，確定卡拉膠實驗劑量。

1.3.2 實驗動物分組及處理

動物實驗經(jīng)中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院動物倫理委員會批準后進行（編號SPΧY2019042001）。將77 只雄性C57BL/6Cnc小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，之后隨機分為2 組，低脂對照組（NC，11 只）飼喂10%低脂飼料（包含7%蔗糖，脂肪提供10%能量）、高脂飼料組（66 只）飼喂60%高脂飼料（包含7%蔗糖，脂肪提供60%能量）[17-18]； 5 周后，高脂飼料組小鼠的平均體質(zhì)量（30.91 g）高于低脂飼料組小鼠（25.33 g）22%，肥胖模型構(gòu)建成功。將66 只肥胖小鼠再隨機分為6 組，每組11 只，包括高脂模型組（HFD，繼續(xù)飼喂高脂飼料）以及不同劑量卡拉膠的高脂實驗組（H0.05%、H0.5%、H1%、H2.5%、H5%，即將不同比例的卡拉膠摻入高脂飼料中飼喂小鼠）。受試物干預(yù)小鼠6 周后處死，實驗周期共12 周。飼養(yǎng)溫度23～25 ℃、相對濕度40%～55%，通風良好，晝夜各12 h，小鼠自由飲水和進食。實驗設(shè)計流程如圖1所示。

圖1 動物實驗設(shè)計流程Fig.1 Timeline flowchart for animal experiments

1.3.3 攝食量及疾病活動指數(shù)測定

小鼠飼養(yǎng)期間，每2 d稱量攝食量；每3 周測定小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠糞便性狀，并通過試劑盒測定小鼠糞便隱血情況，并對體質(zhì)量降低率、糞便性狀、糞便隱血情況進行評分，按照式（1）計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI），DAI相關(guān)指標評分標準見表1[19]。

表1 DAI相關(guān)指標評分標準[19]Table 1 Relative evaluation criteria for DAI[19]

1.3.4 炎癥介質(zhì)蛋白和炎癥因子基因的表達分析

采用ELISA法測定小鼠結(jié)腸中炎癥介質(zhì)的蛋白表達量。小鼠處死后取結(jié)腸約1 cm，用生理鹽水將其制備成質(zhì)量分數(shù)為10%的組織勻漿并按照4 ℃、7 500 r/min的條件離心5 min取上清液，通過ELISA試劑盒測定上清液中髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活力及前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）質(zhì)量濃度[20-21]，檢測時嚴格按照試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀在450 nm波長處測定各樣品吸光度。

采用反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）-PCR測定小鼠結(jié)腸中卡拉膠受體和炎癥因子mRNA表達量。取結(jié)腸約1 cm，通過TRIzol法提取組織總RNA，利用Nanodrop 2000/2000C測定RNA質(zhì)量濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳測定其完整性；采用5Χ All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；之后采用EvaGreen 2Χ qPCR MasterMix定量試劑盒進行定量PCR并按照ΔΔCT法計算Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的基因相對表達量[9]?；蛳嚓P(guān)引物如表2[22]所示，以β-actin作為內(nèi)參基因。PCR循環(huán)條件嚴格按照試劑盒說明書進行。

表2 RT-PCR引物[22]Table 2 Primers for RT-PCR used in this study[22]

1.3.5 組織病理學(xué)分析

每只小鼠均固定選取遠端結(jié)腸約1 cm，立即放入質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛組織固定液中進行固定，以便后續(xù)制作切片。結(jié)腸組織進行石蠟包埋并切成4 μm切片，進行HE染色，使用電動熒光顯微鏡觀察結(jié)腸健康狀況，包括腸壁形態(tài)、腸黏膜結(jié)構(gòu)、炎癥浸潤情況等[23]。按照式（2）計算組織學(xué)活動性指數(shù)（histologic activity index，HAI），以判斷結(jié)腸炎發(fā)生情況，HAI相關(guān)指標評分標準如表3所示；同時采用ImageJ軟件測量小鼠結(jié)腸隱窩深度，各組隨機選定2 個切片，每個切片隨機選取8～10 個視野，統(tǒng)計各組隱窩深度平均值。

表3 結(jié)腸炎癥HAI相關(guān)指標評分標準[9]Table 3 Relative evaluation criteria for histological activity index of colonic inflammation[9]

1.3.6 體質(zhì)量及體脂率測定

小鼠處死前測定最終體質(zhì)量；小鼠處死后分別剝離皮下脂肪、附睪脂肪和腎周脂肪，稱質(zhì)量并按式（3）計算體脂率。

1.3.7 血清生化指標測定

小鼠經(jīng)乙醚麻醉后，摘眼球取血于滅菌離心管中，15 000 r/min離心10 min后取上清液，按照試劑盒說明書測定血清中的TG、TC和Glu濃度，使用酶標儀在505 nm波長處測定血清吸光度。

1.3.8 脂質(zhì)沉積測定

小鼠處死后取肝臟和附睪脂肪各約0.1 g，立即放入質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛組織固定液中進行固定，以便后續(xù)制作切片。脂肪組織進行石蠟包埋并切成4 μm厚切片，分別進行油紅O染色和HE染色，使用電動熒光顯微鏡觀察肝臟細胞和脂肪細胞的形態(tài)，并統(tǒng)計脂肪細胞大小。脂肪細胞采用熒光顯微鏡測量功能測量其半徑，各組均隨機選取3 個切片，每個切片隨機選取4 個視野，每個視野隨機選取20 個細胞。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件作圖，采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，組間采用單因素方差分析法分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量卡拉膠對小鼠攝食量及DAI的影響

卡拉膠干預(yù)前后，各組小鼠攝食量均正常，實驗結(jié)束后統(tǒng)計各組小鼠平均攝食量，結(jié)果表明攝食量在各組間無顯著差異（P＞0.05）（圖2A）。實驗過程中，小鼠DAI在各組間無顯著差異（P＞0.05）（圖2B）：各組小鼠體質(zhì)量無減輕，卡拉膠高劑量組小鼠糞便較軟，各組小鼠糞便隱血基本呈陽性。

圖2 卡拉膠劑量對小鼠攝食量和DAI的影響 Fig.2 Effect of carrageenan dosage on food intake and DAI of mice

2.2 不同劑量卡拉膠對小鼠結(jié)腸中炎癥介質(zhì)和炎癥因子表達的影響

如圖3A所示，各組小鼠結(jié)腸中MPO活力無顯著差異（P＞0.05）；如圖3B所示，H1%（271.93 pg/mL）、 H2.5%（250.42 pg/mL）組PGE2分泌量顯著低于HFD組（315.98 pg/mL），分別下降了13.94%（P＜0.05）和20.75%（P＜0.001）；此外，H2.5%組PGE2分泌量與H0.05%（294.89 pg/mL）和H0.5%（310.05 pg/mL）組相比也分別下降了15.08%（P＜0.05）和19.23% （P＜0.001），表明2.5%的卡拉膠具有一定程度的抑制PGE2分泌的能力。

圖3 卡拉膠劑量對小鼠結(jié)腸中炎癥介質(zhì)蛋白表達和炎癥因子 mRNA表達的影響Fig.3 Effect of carrageenan dosage on protein expression of inflammatory mediators and mRNA expression of inflammatory factors in the colon of mice

持有“卡拉膠具有致結(jié)腸炎性”觀點的研究者認為，卡拉膠在結(jié)腸中會被TLR4識別并結(jié)合，進而誘發(fā)結(jié)腸炎[8]；而TNF-α是炎癥發(fā)生過程中最初始和最重要的細胞因子，其調(diào)節(jié)并促進了其他細胞因子的釋放[24]。因此本實驗測定了TLR4和TNF-α基因在結(jié)腸中的表達量。如 圖3C、D所示，各組小鼠結(jié)腸中卡拉膠的受體TLR4及促炎因子TNF-α的mRNA相對表達量之間均無顯著差異 （P＞0.05），說明劑量高達5%的食品級κ-卡拉膠無致結(jié)腸炎風險。

2.3 不同劑量卡拉膠對小鼠結(jié)腸病理學(xué)的影響

如圖4所示，分別采用40×和200×顯微鏡對小鼠結(jié)腸進行觀察，發(fā)現(xiàn)各組中大部分小鼠均結(jié)腸腸壁完整，厚度正常；腸黏膜結(jié)構(gòu)比較完整，無明顯炎癥浸潤[23]，隱窩完整且排列有序，杯狀細胞無明顯減少，排列有序致密（圖4）。各組小鼠結(jié)腸HAI及隱窩深度之間均無顯著差異（P＞0.05）（表4），進一步表明食品級κ-卡拉膠不會導(dǎo)致肥胖小鼠結(jié)腸炎癥。

圖4 小鼠結(jié)腸HE染色切片圖Fig.4 Hematoxylin-eosin staining section of the colon of mice

表4 卡拉膠劑量對小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)的影響Table 4 Effect of carrageenan dosage on colonic structure of mice

2.4 不同劑量卡拉膠對小鼠體脂率的影響

根據(jù)動物肥胖模型構(gòu)建標準，將模型組體質(zhì)量相較于對照組上升超過20%定義為造模成功[25]。如圖5所示，實驗結(jié)束后，與NC組（體質(zhì)量26.59 g、體脂率2.77%）相比，HFD組體質(zhì)量（35.76 g）和體脂率（9.08%）顯著升高，體質(zhì)量增加34.49%（P＜0.001）；而與HFD組相比，H5%組（體質(zhì)量32.00 g、體脂率5.66%）小鼠體質(zhì)量和體脂率顯著降低，二者分別下降了10.51%（P＜0.05）和37.67%（P＜0.001），說明5%卡拉膠對肥胖小鼠具有降脂減重的作用。

圖5 卡拉膠劑量對小鼠體質(zhì)量及體脂率的影響Fig.5 Effect of carrageenan dosage on body mass and body fat percentage of mice

2.5 不同劑量卡拉膠對小鼠血清生化指標的影響

如圖6所示，與NC組（Glu濃度5.90 mmol/L、TC濃度3.64 mmol/L）相比，HFD組小鼠血清中Glu濃度（8.24 mmol/L）和TC濃度（4.85 mmol/L）顯著 升高（P＜0.05），分別上升了39.66%和33.24%。而H5%組具有一定的降低肥胖小鼠血清Glu、TG和TC濃度的作用（P＞0.05）。

圖6 卡拉膠劑量對小鼠血糖血脂水平的影響 Fig.6 Effect of carrageenan dosage on glucose and lipid levels in serum of mice

2.6 不同劑量卡拉膠對小鼠脂質(zhì)沉積的影響

如圖7所示，與NC組（28.86 μm）相比，HFD組（53.15 μm）附睪脂肪細胞半徑高度顯著增大 （P＜0.001）。高劑量卡拉膠（H1%、H2.5%和H5%）高度顯著減小了附睪脂肪細胞尺寸，H1%組（47.09 μm）小鼠附睪脂肪細胞半徑與HFD組相比下降了11.40%，H2.5%組（45.56 μm）和H5%組（36.36 μm）與HFD組相比分別下降了14.28%和31.59%（P＜0.001）， 其中H5%組的效果最為明顯。上述結(jié)果進一步說明劑量為5%的食品級κ-卡拉膠摻入飼料中對肥胖小鼠具有減少脂質(zhì)蓄積的作用。

圖7 卡拉膠劑量對小鼠附睪脂肪細胞半徑的影響Fig.7 Effect of carrageenan dosage on epididymal adipocyte radius of mice

如圖8肝臟油紅O染色切片圖所示，與NC組相比，HFD組和H0.5%組小鼠肝臟脂質(zhì)沉積明顯加劇，而高劑量卡拉膠具有減少脂質(zhì)沉積的作用，進一步印證了上文中結(jié)論，即高劑量卡拉膠，尤其是劑量為5%的卡拉膠具有改善肥胖小鼠體脂蓄積的作用。

圖8 小鼠肝臟油紅O染色切片圖（100×）Fig.8 Oil red O stained sections of the liver of mice (100 ×)

3 討 論

本研究結(jié)果表明，0.05%～5%的食品級κ-卡拉膠摻入高脂飼料中飼喂小鼠6 周后，其結(jié)腸炎癥相關(guān)指標（DAI、結(jié)腸中MPO活力及炎癥因子mRNA相對表達量）以及結(jié)腸結(jié)構(gòu)（隱窩深度、HAI）與HFD組相比并沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05），說明劑量高達5%的食品級κ-卡拉膠不會誘發(fā)肥胖小鼠結(jié)腸炎癥。該結(jié)論與大多數(shù)研究中高分子質(zhì)量卡拉膠不會誘發(fā)腸道毒性的結(jié)論[10,26]一致。事實上，對于卡拉膠能否誘發(fā)腸道炎癥的爭議，一定程度上源于一些研究人員及普通民眾對卡拉膠及降解卡拉膠概念上的混淆[4]。很多有關(guān)卡拉膠安全性報道中的結(jié)論未考慮卡拉膠的特征，尤其是分子質(zhì)量，從而導(dǎo)致錯誤的結(jié)論或者讀者的誤解。如Myers[27]和Borthakur[28]等利用卡拉膠探究炎癥機制時，直接采用“carrageenan”的說法而未提及其分子質(zhì)量，讀者因此直接默認“卡拉膠”具有致炎性，公眾由此對卡拉膠的安全性產(chǎn)生疑慮和恐慌。因此，卡拉膠本身的特征，如分子質(zhì)量及分布、亞型及純度等的鑒定及辨別對卡拉膠安全性的結(jié)論和解釋是極其重要的。本研究采用的食品級κ-卡拉膠，平均分子質(zhì)量為300 400 Da，分散性良好，且不含有低于50 kDa的低分子質(zhì)量片段，這是其未導(dǎo)致機體結(jié)腸炎癥的重要原因。同時，卡拉膠的蛋白反應(yīng)性使其與飼料中的蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而減少了游離卡拉膠在腸道中的直接暴露[11]，這也是高分子質(zhì)量卡拉膠作為添加劑不會誘發(fā)機體腸道炎癥的原因之一。此外，本研究發(fā)現(xiàn)1%和2.5%的卡拉膠還具有降低肥胖小鼠結(jié)腸中PGE2分泌量的作用，且H2.5%組與HFD組相比PGE2分泌量降低20.75%（P＜0.001），該現(xiàn)象是否表明一定劑量的 食品級κ-卡拉膠具有腸道保健作用，還需后續(xù)實驗進一步探究。

卡拉膠降脂減重的作用已經(jīng)被很多研究所證明。如Chin等[29]的研究表明5%卡拉膠通過上調(diào)脂肪降解相關(guān)基因的表達而起到減緩脂質(zhì)沉積和肥胖相關(guān)代謝綜合征的作用。本研究結(jié)果同樣表明5%食品級κ-卡拉膠具有顯著降低肥胖小鼠體質(zhì)量（10.51%）、體脂率（37.67%）和脂肪細胞半徑（31.59%）的作用（P＜0.05）；此外，5%卡拉膠對于肥胖小鼠血糖血脂水平也具有一定的降低作用，但影響并不顯著（P＞0.05），該結(jié)果與Chin等[29]的研究結(jié)果具有一致性。然而，也有研究表明，卡拉膠攝入能夠抑制胃蛋白酶的活性并降低多種食物蛋白的酶解效率，這是卡拉膠的蛋白反應(yīng)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)、多肽以及氨基酸的生物利用度降低造成的[30]。這也可能是卡拉膠導(dǎo)致食物營養(yǎng)素吸收不良，從而造成小鼠糖脂代謝減緩、體質(zhì)量減輕的原因之一。因此，對于高劑量卡拉膠的降脂減重作用究竟通過何種機制，對機體是有益的或不利的，還需要后續(xù)研究進一步論證。

綜上，本研究表明，劑量高達5%的食品級κ-卡拉膠對小鼠進行膳食干預(yù)不會誘發(fā)肥胖小鼠結(jié)腸炎癥，且5%卡拉膠具有降脂減重的作用，但其機制還需進行深入研究。本實驗可為卡拉膠安全性研究提供新思路。