陳靜陳桂信葉乃興黃先洲潘玉華楊曉濱

(1.寧德職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系,福建 福安 355000;2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建 福州 350002)

白茶萎凋工序是水分逐步散失過程，細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)作用下，細(xì)胞膜滲透性發(fā)生明顯改變，引起生化及內(nèi)質(zhì)成分的變化，各特征性次生代謝產(chǎn)物酚類物質(zhì)[1-4]、咖啡堿[5-7]、茶氨酸[8,9]、萜烯類香氣物質(zhì)[10-12]代謝途徑中的關(guān)鍵酶及相關(guān)基因共同決定白茶品質(zhì)形成，已陸續(xù)在NCBI數(shù)據(jù)庫登錄相關(guān)基因的序列信息及相關(guān)功能注釋。本研究從白茶萎凋芽葉-新鮮芽葉正向文庫中分離獲得了S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、磷酸-2-脫氫-3-脫氧庚糖酸醛縮酶(DAHPS)，并對基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為以后研究白茶品質(zhì)形成分子形成機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為國家級審定茶樹良種“福鼎大白茶”，種植于福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)茶學(xué)教學(xué)基地種質(zhì)資源圃，按傳統(tǒng)白茶加工工藝進(jìn)行萎凋，室內(nèi)自然萎凋溫度22～25℃，空氣相對濕度70%～75%，分別稱取0.1000g的鮮葉(萎凋處理0h)和萎凋處理4h、8h、16h、24h、32h、40h、48h、52h的葉片，共9個(gè)樣品，設(shè)3次重復(fù)，經(jīng)液氮速凍后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白茶萎凋葉與鮮葉正向抑制差減雜交cDNA文庫的構(gòu)建

各取萎凋芽葉與新鮮芽葉樣品總RNA為模板，參考俞瀅[13]的方法構(gòu)建文庫。

1.2.2 白茶萎凋葉與鮮葉差異基因陽性克隆的篩選

反向Northern-blotting中探針的制備、點(diǎn)膜、預(yù)雜交、雜交、顯色等步驟，參照俞瀅[13]的方法和Roche公司的DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit I(Version 13)試劑盒的說明書進(jìn)行，根據(jù)反向Northern-blotting的結(jié)果，挑取陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，用于測序。

經(jīng)反向Northern Bloting顯色驗(yàn)證出的陽性克隆所對應(yīng)菌液送上海祥音公司測序。利用在線NCBI vecscreen剔除載體序列、刪除污染序列和低于并結(jié)合300 bp的序列；利用DNAMAN軟件對有效序列進(jìn)行拼接，將測序結(jié)果生成fasta文件以供后期生物信息學(xué)分析；將測序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫和擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫結(jié)合進(jìn)行Blast N比對分析，對基因功能進(jìn)行注釋和歸類分析。

1.2.4 白茶品質(zhì)形成的相關(guān)差異基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對陽性克隆的測序結(jié)果，見表1，所獲得的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行Blast X比對；陽性克隆基因的推測功能使用Protparam在線軟件；預(yù)測陽性克隆基因所編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)使用SOPMA在線軟件，找出與功能密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進(jìn)化樹在MEGA軟件中形成以進(jìn)行聚類分析。

表1 3個(gè)白茶品質(zhì)形成相關(guān)基因信息表

1.2.5 白茶品質(zhì)形成的相關(guān)基因在不同萎凋時(shí)期的表達(dá)量變化

利用Primer Premier 5和Beacon Desiner7軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，見表2。

表2 熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 白茶Cs SAMDC基因的生物信息學(xué)分析與表達(dá)

2.1.1 白茶Cs SAMDC基因的生物信息學(xué)分析

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶是合成亞精胺的重要酶類。S-腺苷甲硫氨酸經(jīng)過S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)催化，生成脫羧SAM，由Put與脫羧的SAM提供的氨丙基合成Spd和Spm，合成亞精胺合成酶和精胺合成酶，目前已在許多植物中克隆到了SAMDC基因，如擬南芥[14]、棉花[15]、番茄[16]、杜梨[17]等。研究表明，SAMDC基因是由一個(gè)多基因家族所編碼[18]，每一種植物中的SAMDC基因都不止一個(gè)，如擬南芥中有4個(gè)SAMDC基因[19]、水稻中有4個(gè)SAMDC基因[109]、番茄中有3個(gè)SAMDC基因[16]。

測序結(jié)果，見圖3，白茶Cs SAMDC核苷酸序列長度為1355bp,該基因編碼的蛋白由334個(gè)氨基酸組成，含有SAMDC_redism_C superfamily結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)，見圖1，相對分子量為38988.23，等電點(diǎn)為5.29，不穩(wěn)定系數(shù)為48.55，屬于不穩(wěn)定脂溶蛋白，在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，28.19%為α螺旋，23.44%為延伸鏈，7.42%為β轉(zhuǎn)角，40.95%為無規(guī)則卷曲。

治愈:治療三天,患兒沒有腹瀉癥狀,精神狀態(tài)良好;有效:治療三天,患兒沒有嘔吐脫水癥狀,大便次數(shù)減少;無效:治療三天沒有任何改善或更加嚴(yán)重。

圖1 Cs SAMDC氨基酸結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖2 Cs SAMDC序列的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 Cs SAMDC基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

將Cs SAMDC基因的氨基酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，該基因與茶樹(Camellia sinensis)的同源性為87%、與香附子(Cynodon dactylon)、小麥(Triticum aestivum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)同源性均為100%。使用MEGA進(jìn)行NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,結(jié)果見圖2。

2.1.2 白茶Cs SAMDC基因的表達(dá)分析

以GAPDH為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR對白茶萎凋過程中Cs SAMDC基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，見圖4，結(jié)果表明，不同萎凋歷時(shí)下，萎凋前期即萎凋歷時(shí)0～16h,萎凋后期即萎凋歷時(shí)24～52h，2個(gè)階段Cs SAMDC呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在萎凋歷時(shí)4h的相對表達(dá)量是最高的，是0 h的4倍。

圖4 白茶不同萎凋歷時(shí)中Cs SAMDC基因的表達(dá)分析

2.2 白茶Cs SDH基因的生物信息學(xué)分析與表達(dá)

2.2.1 白茶Cs SDH基因的生物信息學(xué)分析

琥珀酸脫氫酶是參與三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化的關(guān)鍵酶基因。

測序結(jié)果見圖7，白茶Cs SDH基因的cDNA核苷酸序列長度為1224bp，包含17 bp的5/-UTR、57 bp的3/-UTR和1150bp的ORF，起始密碼子為ATG、終止密碼子為TGA；該基因編碼的蛋白由388個(gè)氨基酸組成，見圖5，相對分子量為43239.04，等電點(diǎn)為6.45，不穩(wěn)定系數(shù)為32.15，屬于不穩(wěn)定脂溶蛋白，在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，29.70 %為α螺旋，25.13%為延伸鏈，13.96%為β轉(zhuǎn)角，31.22 %為無規(guī)則卷曲。

圖5 Cs SDH氨基酸結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖6 Cs SDH序列的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖7 Cs SDH的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

將Cs SDH基因的氨基酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，該基因與荔枝(Litchi chinensis)、馬尾松(Pinus massoniana)、葡萄(Vitis vinifera)、油棕(Elaeis guineensis)的同源性均為100%。使用MEGA進(jìn)行NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，Cs SDH基因與玉米的SDH基因?qū)儆谕环种?，見圖6。

2.2.2 白茶Cs SDH基因的表達(dá)分析

以GAPDH為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR對白茶萎凋過程中Cs SDH基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，不同萎凋歷時(shí)下，萎凋歷時(shí)0～52h,Cs SDH含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，變化差異不大，在萎凋歷時(shí)0h的相對表達(dá)量是最高的，是52h的6倍。

圖8 白茶不同萎凋歷時(shí)中CsSDH基因的表達(dá)分析

2.3 白茶Cs DAHPS基因的生物信息學(xué)分析與表達(dá)

2.3.1 白茶CsDAHPS基因的生物信息學(xué)分析

莽草酸途徑是芳香族氨基酸的生物合成途徑，同時(shí)也控制著芳香族次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)出，連接糖代謝和次生代謝的紐帶。磷酸-2-脫氫-3-脫氧庚糖酸醛縮酶是莽草酸途徑7個(gè)酶促反應(yīng)中的第1個(gè)酶類，是參與次級代謝的主要蛋白。

測序結(jié)果見圖11，白茶Cs DAHPS基因的cDNA全長為1935 bp，核苷酸序列長度為1682bp,包含65bp的5/-UTR、58bp的3/-UTR和1812bp的ORF，起始密碼子為ATG、終止密碼子為TGA；該基因編碼的蛋白由538個(gè)氨基酸組成，含有異戊二烯結(jié)構(gòu)域Isoprenoid_Biosyn_C1 superfamily，見圖9，相對分子量為62021.74，等電點(diǎn)為8.82，不穩(wěn)定系數(shù)為42.90，屬于不穩(wěn)定脂溶蛋白，在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，35.36%為α螺旋，16.25%為延伸鏈，7.32%為β轉(zhuǎn)角，41.07 %為無規(guī)則卷曲。

圖9 Cs DAHPS氨基酸結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖10 Cs DAHPS序列的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖11 Cs DAHPS的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

將Cs DAHPS基因的氨基酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，該基因與番茄(Solanum lycopersicum)、番薯紫竹(Ipomoea purpurea)、可可(Theobroma cacao)的同源性均為100%，見圖10。

2.3.2 白茶Cs DAHPS基因的表達(dá)分析

以GAPDH為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR對白茶萎凋過程中Cs DAHPS基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，萎凋歷時(shí)0～24h,Cs DAHPS含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，變化差異不大，在萎凋歷時(shí)32h的相對表達(dá)量是最高的，是52h的5倍。

圖12 白茶不同萎凋歷時(shí)中CsDAHPS基因的表達(dá)分析

3 結(jié)論與討論

3.1 白茶萎凋過程品質(zhì)形成與逆境的關(guān)系

白茶萎凋過程中水分及酶活性不斷變化，本身就是失水條件下的逆境，因此形成與水分散失條件下相關(guān)的基因，本研究分離的白茶Cs SAMDC合成亞精胺的重要酶類家族，BLAST比對結(jié)果表明，Cs SAMDC編碼的蛋白在氨基酸序列上與茶樹、菜豆等植物的SAMDC基因具有較高的同源性，兩者均達(dá)到85%以上。從圖2中Cs SAMDC的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，白茶Cs SAMDC屬于SAMDC家族，與山茶屬茶樹形成一個(gè)分類群，可以初步確定Cs SAMDC是編碼白茶的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的同源基因。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶是合成亞精胺主要限速酶基因。白茶在萎凋歷時(shí)4h,SAMDC酶表達(dá)量最高，說明體內(nèi)可能產(chǎn)生大量的亞精胺等物質(zhì)，通過滲透調(diào)節(jié)途徑來增強(qiáng)能力，之后趨于平衡，可能是滲透調(diào)節(jié)達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)飽和階段，有待進(jìn)一步研究。

3.2 白茶萎凋過程品質(zhì)形成與三羧酸循環(huán)的關(guān)系

白茶萎凋過程是各類酶系活躍的階段，其中白茶Cs SDH是三羧酸循環(huán)關(guān)鍵限速酶基因，其表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，可初步判定萎凋失水的含量變化是由高至低，因此Cs SDH在萎凋過程中呈現(xiàn)表達(dá)逐漸下調(diào)趨勢，這與孫躍進(jìn)[20]的結(jié)果相一致，萎凋后期糖酵解途徑加強(qiáng),三羧酸循環(huán)減弱。

3.3 白茶萎凋過程品質(zhì)形成與莽草酸循環(huán)的關(guān)系

莽草酸循環(huán)是芳香族氨基酸的生物合成途徑，這些芳香族氨基酸除了用來合成蛋白質(zhì)外，還作為前提生成種類繁多的具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物，如木質(zhì)素、維生素E、花青素、植物抗毒素、吲哚乙酸酯、紫草素、水楊酸、丹寧酸、肉桂酸、黃酮及黃酮類等[21-25]。王芳等[26]研究表明，室內(nèi)自然萎凋過程中不同白茶品種的谷氨酸脫羧酶(GAD)性整體變化趨勢基本一致，即萎凋前期的茶葉GAD活性隨谷氨酸(GLU)含量的增加而增強(qiáng)，催化GLU轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸(GABA)，但隨著萎凋葉失水程度的增加，催化成GABA的能力下降，且GABA的降解速度大于生成速度，故其含量在萎凋中后期呈緩慢下降趨勢。作為莽草酸途徑的第1個(gè)酶，白茶Cs DAHPS 在萎凋歷時(shí)0～24h呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，萎凋歷時(shí)40～52h呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，這與王芳的結(jié)果基本一致。但在萎凋歷時(shí)32h呈現(xiàn)最大值，這一結(jié)果可進(jìn)一步研究。