王偉藝，唐文皓，張超，袁祖榮，唐健雄，姜翀弋，涂彥淵，吳兆坤

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院普外科，上海200040

胰腺導(dǎo)管腺癌是最多見的胰腺惡性腫瘤，惡性程度極高，其預(yù)后極差。2019年Cancer Statistics 雜志數(shù)據(jù)顯示美國(guó)胰腺癌5年生存率僅9%，轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者5年生存率3%，是美國(guó)死亡率第4 位的惡性腫瘤[1]。近年來，胰腺癌快速上升至中國(guó)惡性腫瘤死亡率第六位，其5年生存率不足8%[2]，且老年患者胰腺癌較高發(fā)，大多合并肝、腎、肺、心等臟器功能衰退，手術(shù)及化療耐受性差，預(yù)后更差。因此，尋找老年胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因素，是提高胰腺癌療效迫切需要的解決方法。Klebig C 等[3]研究表明，與正常乳腺組織相比，原發(fā)性乳腺癌組織中γ-氨基丁酸A 型受體相關(guān)蛋白（GABARAP）的mRNA 和蛋白水平較低，并且在低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系中異位表達(dá)GABARAP 基因會(huì)降低腫瘤的生長(zhǎng)速度。GABARAP 的這種抑瘤特性可以通過對(duì)自噬的直接作用和通過控制表皮生長(zhǎng)因子（EGFR）[4-5]等受體的轉(zhuǎn)運(yùn)間接介導(dǎo)，提示GABARAP 可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但仍有很多爭(zhēng)議。為此，本研究旨在探討GABARAP 與老年胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—2018年12月在復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院普外科行胰腺癌根治術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌的老年病例60 例，其中男性40例，女性20 例；年齡60～84 歲,平均(68.7±5.9) 歲。所有病例均有完整的隨訪資料，隨訪的截止日期為2020年12月31日。排除標(biāo)準(zhǔn)為圍術(shù)期死亡和切緣陽(yáng)性的病例。60 例老年胰腺導(dǎo)管癌患者一般資料見表1。

表1 60 例老年胰腺導(dǎo)管腺癌患者臨床資料

1.2 免疫組化 采用MaxVision 免疫組化法，檢測(cè)標(biāo)本取自于根治手術(shù)的胰腺癌組織以及配對(duì)癌旁正常胰腺組織。根據(jù)病理科檔案選取包含腫瘤組織的蠟塊及包含正常胰腺組織的蠟塊數(shù)枚，分別切片，行HE 染色，顯微鏡下觀察有無(wú)腫瘤組織及正常胰腺組織，選取腫瘤組織與非腫瘤組織界限分明、組織豐富的蠟塊。將蠟塊切片，且下的蠟塊薄片輕輕放入漂烘儀熱水中，使其漂浮，燙平，然后將蠟塊薄片附著于載玻片上，待水流干，放65℃電熱恒溫箱中烘干1 h。選擇Lumatas全自動(dòng)免疫組化染色儀附帶電腦內(nèi)的染色程序，用標(biāo)簽打印機(jī)打印出標(biāo)簽，該標(biāo)簽與待執(zhí)行的抗體模板相對(duì)應(yīng)。將打印出的標(biāo)簽貼在已完成烤片的玻片一端，再將玻片放入染色儀的染色架上。將裝有脫蠟液、一抗、二抗、DAB 的試劑盒放在試劑架上。將抗原修復(fù)液、緩沖液、酒精、蒸餾水放入儀器中相應(yīng)容器內(nèi)。進(jìn)入儀器操作軟件，掃描切片標(biāo)簽和試劑標(biāo)簽后，全自動(dòng)免疫組化染色儀自行完成脫蠟、水化、修復(fù)、加入一抗、加入二抗、DAB 顯色等步驟，運(yùn)行結(jié)束后取出玻片。取下載玻片，用蘇木精復(fù)染：清水沖洗，蘇木素染色10～30 s，PBS 溶液、氨水或自來水返藍(lán)。脫水：分別置入85%乙醇中、95%乙醇中及無(wú)水乙醇中，各浸泡3 min；透明：使用二甲苯進(jìn)行透明封片：使用中性樹膠封片。鏡檢。

1.3 GABARAP 陽(yáng)性結(jié)果判定 陽(yáng)性對(duì)照為已知胰腺癌陽(yáng)性玻片，陰性對(duì)照為TW-0821 緩沖液代替GABARAP 鼠多克隆抗體。胰腺癌或癌旁胰腺細(xì)胞胞質(zhì)中觀察到棕黃色的顆粒，則判定為該細(xì)胞GABARAP 陽(yáng)性。將切片置于400 倍鏡下觀察，結(jié)合細(xì)胞染色強(qiáng)度分析并計(jì)算呈棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)與視野中所有細(xì)胞個(gè)數(shù)的比值，至少計(jì)算10 個(gè)視野，綜合比值>25%判定該標(biāo)本為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分率表示， 組間比較采用卡方檢驗(yàn)； Kaplan-Meier 和Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，尋找可能影響胰腺癌導(dǎo)管腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，采用Cox 回歸模型分析篩選影響胰腺癌根治術(shù)后預(yù)后的因素。<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GABARAP 的表達(dá)及其與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床病理關(guān)系 GABARAP 在老年胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為58.3%（35/60）,而在癌旁正常胰腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為15.0%（9/60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.001)（見圖1）。而與腫瘤部位、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、神經(jīng)侵犯、病理分級(jí)、腫瘤T NM 分期（AJCC2017）以及性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均>0.05）。

圖1 GABARAP 在胰腺癌及癌旁正常胰腺組織的免疫組化表達(dá)情況

2.2 胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后預(yù)后情況 本研究中胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)患者共60 例，隨訪的截止日期為2020年12月31日,總共48 例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，當(dāng)中局部復(fù)發(fā)的比例為29.2%（14/48）,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的比例為66.7%（32/48），局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都有的患者的比例為14.6%（7/48）。60 例患者的無(wú)病中位生存期為17.7 個(gè)月，平均為（21.1±13.4）個(gè)月?，F(xiàn)在仍有18 例患者存活，1 例失訪。60 例患者中位總生存期為24.0 個(gè)月，平均為（24.3±12.4）個(gè)月。1年、2年、3年累計(jì)總生存率為80.0%、46.7%、32.6%。

2.3 GABARAP、臨床病理因素（腫瘤位置、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、TNM 分期、性別和是否術(shù)后輔助化療）與老年胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 生存分析表明（見表2），Logrank 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)25 例GABARAP 陰性與35 例GABAR AP 陽(yáng)性老年胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后患者的無(wú)病生存期、總生存期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為=0.023、=0.012，均<0.05）（見圖2）。單因素生存分析提示：血管侵犯（=0.027）、神經(jīng)侵犯（=0.044）同樣與胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后的無(wú)病生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05)。同樣，單因素生存分析結(jié)果表明輔助化療（=0.016）亦與胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后總生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05)。

表2 GABARAP 與老年胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后無(wú)病生存期、總生存期的關(guān)系

2.4 Cox 回歸模型分析結(jié)果 Cox 回歸多因素分析結(jié)果提示，GABARAP（=0.013)、血管侵犯（=0.016)與術(shù)后輔助化療（=0.011) 與胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后的無(wú)病生存期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表3）,但神經(jīng)侵犯和胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后的無(wú)病生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在總生存期上，GABARAP（=0.002)、血管侵犯（=0.034) 與術(shù)后輔助化療（=0.001) 亦與胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后總生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表3 老年胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后無(wú)病生存期危險(xiǎn)因素Cox 回歸模型多因素分析結(jié)果

表4 老年胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后總生存期危險(xiǎn)因素Cox 回歸模型多因素分析結(jié)果

3 討論

GABARAP是自噬相關(guān)蛋白Atg8 家族成員之一，是哺乳動(dòng)物酵母Atg8 基因的同源物，其基因位于17號(hào)染色體17p13.1 的后鏈上，基因大小為1.5kb，該基因編碼GABA（A）受體相關(guān)蛋白，在自噬過程中參與了自噬體的形成，相比于人體其他器官組織GABARAP 在胰腺組織中表達(dá)較少[6]。Joachim J 等[7]研究發(fā)現(xiàn)GABARAP在饑餓誘導(dǎo)的自噬激活中特異性地與ULK1 的LIR（LC3 交互區(qū)域）基序直接相互作用，從而促進(jìn)了激活ULK復(fù)合物來維持自噬體的生長(zhǎng)。與周圍胰腺組織相比，大多數(shù)胰腺導(dǎo)管腺癌組織樣本的血管相對(duì)較少。增殖的癌細(xì)胞比周圍的非癌細(xì)胞需要更多的營(yíng)養(yǎng)，盡管營(yíng)養(yǎng)是通過功能結(jié)構(gòu)上不成熟的新血管提供的。由于自主增殖的癌細(xì)胞經(jīng)常暴露在缺氧條件下，自噬是缺氧應(yīng)激下惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，研究推測(cè)胰腺癌細(xì)胞的重要過程可能是自噬，缺氧已被報(bào)道為胰腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志[8-9]。Yang S 等[10]研究表明胰腺癌依賴于自噬，胰腺癌的細(xì)胞系與原發(fā)腫瘤在基礎(chǔ)的條件下自噬水平上升。自噬的遺傳或藥理抑制導(dǎo)致活性氧增加，DNA 損傷增加，代謝缺陷引起線粒體氧化磷酸化下降。在胰腺癌異種移植和遺傳小鼠模型中，通過氯喹治療或遺傳手段遏制自噬可引起腫瘤的穩(wěn)定消退和延長(zhǎng)生存期。Fujii S 等[11]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌周圍組織高水平自噬強(qiáng)烈提示患者不良的預(yù)后。以上研究提示自噬在胰腺癌發(fā)展過程中的促癌作用。然而當(dāng)自噬被過度激活，大量大分子物質(zhì)、細(xì)胞器等被降解也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡也是抑制胰腺癌細(xì)胞的一種方式。有研究表明吉西他濱及電離輻射等治療措施可激活胰腺癌細(xì)胞自噬并誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞自噬性死亡[12]。在最近的一項(xiàng)研究中,Rosenfeldt M T 等[13]用轉(zhuǎn)基因的胰腺導(dǎo)管腺癌模型表明,TP53 突變存在時(shí)抑制自噬可促進(jìn)癌癥的形成，TP53 狀態(tài)的表征將有助于識(shí)別新診斷的胰腺導(dǎo)管腺癌患者，他們可能從自噬抑制劑中獲益最多。Miao Y 等[14]探討了GABARAP 與結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果提示結(jié)直腸癌中GABARAP 表達(dá)升高與低分化、總生存期縮短相關(guān)，GABARAP 的高表達(dá)與預(yù)后有關(guān)，提示GABARAP 在結(jié)腸癌上可能為促癌基因。另外，有一項(xiàng)研究表明與正常乳腺組織相比，原發(fā)性乳腺癌組織中GABARAP的mRNA 和蛋白水平較低，并且在低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系中異位表達(dá)GABARAP基因會(huì)降低腫瘤的生長(zhǎng)速度，提示GABARAP 在乳腺癌上可能為抑癌基因[3]。如今的研究成果提示GABARAP表達(dá)可能與胰腺癌的自噬相關(guān)，因此本研究使用免疫組化的方法檢測(cè)GABARAP 在老年胰腺導(dǎo)管腺癌組織和配對(duì)的癌旁正常胰腺組織的表達(dá)。

本研究結(jié)果表明GABARAP 在60 例老年胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的陽(yáng)性率（58.3%）高于在癌旁胰腺正常組織中的陽(yáng)性率（15.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.001）。目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)研究GABARAP 在胰腺癌及正常胰腺組織上的表達(dá)。所以，本研究推測(cè)GABARAP可能是老年胰腺導(dǎo)管腺癌的一個(gè)特異性的生物標(biāo)志物，本研究進(jìn)一步分析GABARAP 與臨床因素的關(guān)系，探討GABARAP 是否與老年胰腺導(dǎo)管腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本研究進(jìn)一步將GABARAP表達(dá)分為陽(yáng)性組和陰性組，探討GABARAP 表達(dá)和胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后的無(wú)病生存期、總生存期的相關(guān)性，結(jié)果顯示GABARAP 陽(yáng)性表達(dá)的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的無(wú)病生存期（28.9±3.2）個(gè)月，高于陰性表達(dá)的患者（17.3±2.5）個(gè)月，GABARAP 表達(dá)陽(yáng)性的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的總生存期（34.5±3.1）個(gè)月，均高于陰性患者的（21.0±2.5）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。鑒于導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后差的因素眾多，進(jìn)一步的胰腺癌預(yù)后關(guān)鍵因素的多因素回歸分析，GABARAP 均是影響胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后的無(wú)病生存期與總生存期的獨(dú)立影響因素，而且GABARAP 表達(dá)水平和胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后相關(guān)，GABARAP陽(yáng)性表達(dá)者無(wú)病生存期長(zhǎng)，預(yù)后好。在本研究中,術(shù)后輔助化療（=0.001) 和血管侵犯（=0.034) 也是胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后患者無(wú)病生存期獨(dú)立的影響因素。結(jié)合本研究結(jié)果，初步考慮GABARAP 為抑癌基因，與之前KlebigC 等[3]研究一致，GABARAP 在分子生物學(xué)層面具體通過自噬或其他機(jī)制抑制胰腺癌發(fā)展的作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。胰腺癌好發(fā)于老年患者，年輕患者較少，故本研究著重研究GABARAP 在60 歲以上老年胰腺導(dǎo)管腺癌的表達(dá)情況，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，包括添加年輕胰腺癌患者樣本加以研究。

綜上所述，GABARAP 在老年胰腺導(dǎo)管腺癌組織中高表達(dá)，并與老年胰腺導(dǎo)管腺癌根治術(shù)后無(wú)病生存期、總生存期正相關(guān)，GABARAP 可能是預(yù)測(cè)老年胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后的生物標(biāo)記物，但GABARAP 具體通過哪些分子機(jī)制影響于胰腺導(dǎo)管腺癌還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。