申達(dá)甫，何志偉

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院心血管外科，上海200127；2.上海郵電醫(yī)院普外科，上海200040

心力衰竭是一種十分常見的臨床綜合征，以呼吸困難、容易疲勞和容量負(fù)荷過(guò)重為特征，可以出現(xiàn)外周水腫和肺啰音等體征[1-2]。心力衰竭的癥狀可由收縮或舒張功能障礙引起。心力衰竭的發(fā)病率和死亡率很高，特別是在老年人中[3-4]。我國(guó)每年約新發(fā)心力衰竭患者50 萬(wàn)例[5]。許多疾病，如冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、心臟瓣膜病和糖尿病，可引起或?qū)е侣孕牧λソ呤Т鷥?。慢性心力衰竭患者需要長(zhǎng)期進(jìn)行藥物治療和隨訪，不斷增加患者以及社會(huì)負(fù)擔(dān)。高發(fā)病率和不良預(yù)后使得對(duì)該疾病的早期診斷和及時(shí)治療尤為重要。慢性心力衰竭的診斷需要依據(jù)病史和體格檢查、胸片、心電圖、心臟彩超和實(shí)驗(yàn)室檢查等。目前并沒有單一診斷試驗(yàn)可以確診慢性心力衰竭。具有高靈敏度、高特異度的血清學(xué)標(biāo)志物可以應(yīng)用于早期非侵入性的篩查。近年來(lái)，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，不斷發(fā)現(xiàn)新的血清標(biāo)志物可以用于慢性心力衰竭的診斷或者風(fēng)險(xiǎn)分層。這些標(biāo)志物往往具有自身特異性，并且與特異的疾病的致病機(jī)制通路相關(guān)。聯(lián)合應(yīng)該這些指標(biāo)可以提高診斷效能，包括特異度和靈敏度[6-8]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與性別決定區(qū)Y-17（sex determining region Y-box 17,SOX17）均被證實(shí)與心力衰竭相關(guān)[9-10]，是可能用于心力衰竭診斷的潛在標(biāo)志物。本研究旨在探索，VEGF與SOX17 作為血清學(xué)標(biāo)志物在慢性心力衰竭診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 招募2020年1月—2021年1月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院住院治療的慢性心力衰竭患者50 例，設(shè)立為觀察組，50 名健康者設(shè)立為對(duì)照組。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)患者臨床癥狀、體格檢查結(jié)果、輔助檢查結(jié)果，診斷為慢性心力衰竭，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)會(huì)心力衰竭學(xué)組2018 版《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2018》[11]；（2）患者病程超過(guò)半年以上；（3）患者年齡在60 歲至75歲之間；（4）患者知曉本研究?jī)?nèi)容與意義，自愿參加本研究本簽署知情同意書。觀察組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并惡性腫瘤者；（2）合并急慢性感染者；（3）合并精神心理類疾病，不能正常交流者；（4）近半年內(nèi)參與其他臨床試驗(yàn)者。對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往無(wú)心腦血管疾病病史；（2）健康者年齡在60 歲至75 歲之間；（3）使用抗VEGF 藥物患者；（4）患者知曉本研究?jī)?nèi)容與意義，自愿參加本研究本簽署知情同意書。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)參照觀察組。本研究通過(guò)上海仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。記錄患者的一般資料，包括年齡、性別、平均身高、體重、收縮壓、舒張壓、吸煙史、飲酒史、糖尿病病史。記錄患者N 末端B 型利鈉肽前體(NT-proBNP) 和超聲心動(dòng)圖參數(shù)（每搏量和射血分?jǐn)?shù)）。

1.2 觀察指標(biāo)檢測(cè) 本研究使用人血清VEGF 酶聯(lián)免疫試劑盒（德國(guó)merck-millipore 公司，貨號(hào)：QIA51-1EA）和SOX17 酶聯(lián)免疫試劑盒（美國(guó)raybiotech 公司，貨號(hào)：ELH-SOX17-2）。取患者早晨空腹血樣5mL，經(jīng)離心機(jī)（德國(guó)BAXIT 公司，型號(hào)：BXTGL16M）離心后，分離上層血清。使用包被稀釋液稀釋好的抗原在96 孔板上進(jìn)行加樣，每孔加入100 L。在4℃的環(huán)境中放置24 h。放置時(shí)要求物理封閉96 孔板，防止液體蒸發(fā)。完成上述步驟之后，丟棄96 孔板中液體。使用小牛血清封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔，封閉時(shí)間應(yīng)超過(guò)40 min。本研究要求封閉時(shí)，血清加滿反應(yīng)孔，放置于37℃的恒溫箱中。封閉完成后充分洗滌反應(yīng)孔。將待檢測(cè)血清建立合適濃度梯度后加入孔板，重復(fù)3 次。本研究要求放置于37℃的恒溫箱中，時(shí)間為1 h。上述步驟完成后充分洗滌反應(yīng)孔。加入酶標(biāo)抗體，放置于37℃的恒溫箱中，反應(yīng)時(shí)間為1 h。最后加入底物液TMB-過(guò)氧化氫尿素溶液，放置于37℃的恒溫箱，避光反應(yīng)3 min。終止反應(yīng)，并使用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度，計(jì)算所測(cè)目標(biāo)因子血清含量，取3 次測(cè)量平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究中所用統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)使用R 軟件（V3.5.1）和相關(guān)R 包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，采用卡方檢驗(yàn)。通過(guò)Logistic 回歸分析篩選慢性心力衰竭獨(dú)立危險(xiǎn)因素并建立聯(lián)合診斷指標(biāo)。通過(guò)受試者工作特征(Receiver operatingcharacteristic，ROC) 曲線評(píng)估VEGF、SOX17、以及聯(lián)合指標(biāo)診斷效能。使用STRING 11.0 構(gòu)建VEGF、SOX17 為核心的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)和PathView軟件對(duì)VEGF、SOX17 相關(guān)的基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組之間一般情況比較 本研究觀察組和對(duì)照組一般情況如表1 所示，2 組之間在平均年齡、性別、平均身高、體重、收縮壓、舒張壓、吸煙史、飲酒史、糖尿病史等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。50 例心衰患者中18（36.00%）例患冠心病、13（26.00%）例患高血壓病、6（12.00%）例患心肌炎、5（10.00%）例患有擴(kuò)張性心肌病、10（20.00%）例患有瓣膜病。2 組之間NT-pro BNP 和超聲心動(dòng)圖參數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.001）。見如表2。

表1 2 組基線情況比較

表2 2 組NT-pro BNP 和超聲心動(dòng)圖參數(shù)比較

2.2 2 組之間VEGF 與SOX17 血清含量差異 對(duì)照組VEGF 血清含量（72.29±37.20） pg/mL，觀察組VEGF 血清含量（122.73±67.85）pg/mL；觀察組VEGF血清含量高于對(duì)照組（<0.001）。對(duì)照組SOX17血清含量（94.80±49.49）pg/mL，觀察組SOX17 血清含量（142.34±87.64）pg/mL；觀察組SOX17 血清含量高于對(duì)照組（<0.001）。見圖1。

圖1 對(duì)照組和觀察組血清VEGF、血清SOX17 含量差異比較

2.3 Logistic 回歸分析本研究以慢性心力衰竭患病情況為因變量，SOX17 和VEGF為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果表明，SOX17（OR=1.32,95%[0.96,1.36]）和VEGF（OR=1.41,95%[1.06,1.62]）是慢性心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（<0.05）。見表3。

表3 血清SOX17、VEGF 含量Logistic 回歸分析

本研究基于SOX17 和VEGF 構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)值計(jì)算公式：風(fēng)險(xiǎn)值=-2.96+0.01×SOX17 血清含量+0.02×VEGF 血清含量。ROC 曲線表明，SOX17 曲線下面積（area under the curve,AUC）為0.67，95%CI 為[0.57,0.76]，最佳臨界值為115.89 pg/mL，敏感度為48%，特異度為82%。VEGF 的AUC 為0.76，95%CI 為[0.67,0.84]，最佳臨界值為79.32 pg/mL，敏感度為76%，特異度為74%。風(fēng)險(xiǎn)值的AUC 為0.81，95%CI 為[0.72,0.88]，最佳臨界值為0.60，敏感度為78%，特異度為82%。此外，本研究還納入了NTpro BNP 作為參照，其AUC 為0.762，小于風(fēng)險(xiǎn)值A(chǔ)UC，表明聯(lián)合指標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)值診斷效能優(yōu)于NT-pro BNP。

圖2 VEGF、SOX17 血清含量對(duì)慢性心力衰竭診斷受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic，ROC）

2.4 SOX17、VEGF 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究構(gòu)建了SOX17、VEGF 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。見圖3。

圖3 SOX17、VEGF 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。線條越粗表示相互間作用關(guān)系支持越強(qiáng)

2.4 KEGG 通路富集 分析本研究將SOX17、VEGF及相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG 通路富集。結(jié)果顯示，SOX17、VEGF 及相互作用蛋白質(zhì)基因主要富集在鈣信號(hào)通路、擴(kuò)張型心肌病、糖酵解和糖質(zhì)新生、松弛素信號(hào)通路、ECM 受體交互、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、PI3K-Akt 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、HIF-1 信號(hào)通路、蛋白質(zhì)消化吸收等信號(hào)通路上（<0.05）。見圖4。

圖4 SOX17、VEGF 及相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG 通路富集分析

3 討論

心力衰竭被美國(guó)心臟協(xié)會(huì)和美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)定義為一種復(fù)雜的臨床綜合征，可由任何結(jié)構(gòu)性或功能性心臟疾病導(dǎo)致，損害心室充血或輸出血液的能力。由于心肌受到壓力，心輸出量減少，交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活增加了血壓(組織灌注) 和血容量(通過(guò)Frank-Starling 機(jī)制增加前負(fù)荷、搏出量和心輸出量)。這些代償機(jī)制也可導(dǎo)致進(jìn)一步的心肌惡化和心肌收縮性惡化。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)了一些可以用于慢性心力衰竭的診斷血清學(xué)標(biāo)志物，包括生長(zhǎng)刺激表達(dá)因子-2、半乳糖凝集素-3、生長(zhǎng)分化因子-15 等，但是均未廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中[12]。本研究旨在探索，VEGF 與SOX17 作為血清學(xué)標(biāo)志物在慢性心力衰竭診斷中的價(jià)值。

本研究通過(guò)ELISA 的方法測(cè)定了慢性心力衰竭患者和健康受試者血清中VEGF、SOX17 血清中的含量。研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭患者VEGF 血清含量高于健康受試者。這一結(jié)果得到了既往研究和文獻(xiàn)的支持，慢性心力衰竭患者血清中VEGF 水平升高，經(jīng)過(guò)治療之后有所降低[13-14]。慢性心力衰竭患者血清中SOX17 血清含量高于健康受試者。SOX17 與慢性心力衰竭之間的關(guān)系尚缺乏相關(guān)研究闡明，本研究這一結(jié)果需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行證實(shí)。

本研究通過(guò)Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，SOX17 和VEGF 是慢性心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)值計(jì)算公式，并進(jìn)一步探索了VEGF、SOX17 以及兩者的聯(lián)合診斷效能。ROC 曲線表明，SOX17、VEGF、風(fēng)險(xiǎn)值的AUC 分別為0.67、0.76、0.81，最佳臨界值以及對(duì)應(yīng)的敏感度和特異度分別為115.89 pg/mL（0.48,0.82）、79.32pg/mL（0.76,0.74）、0.60（0.78,0.82）。上述結(jié)果表明，VEGF 和SOX17 均可以獨(dú)立應(yīng)用于慢性心力衰竭的診斷，并且診斷效能良好。VEGF 和SOX17 聯(lián)合構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)值作為診斷指標(biāo)，其效能高于兩者獨(dú)立作為診斷指標(biāo)。此外，本研究還納入了NT-pro BNP 作為參照，其AUC 為0.762，小于SOX17 和VEGF 聯(lián)合指標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)值A(chǔ)UC，表明聯(lián)合指標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)值診斷效能優(yōu)于NT-pro BNP。

本研究構(gòu)建了SOX17、VEGF 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并且對(duì)相互作用基因進(jìn)行了KEGG 通路富集分析。富集分析結(jié)果表明，SOX17、VEGF 及相互作用蛋白質(zhì)基因主要富集在鈣信號(hào)通路、擴(kuò)張型心肌病、糖酵解和糖質(zhì)新生、松弛素信號(hào)通路、ECM 受體交互、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、PI3K-Akt 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、HIF-1 信號(hào)通路、蛋白質(zhì)消化吸收等信號(hào)通路上。值得注意的是這些通路之中，HIF-1在心衰的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，HSF1 缺陷通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞mir-195a-3p 介導(dǎo)的心臟血管生成損傷，加速了壓力超載誘導(dǎo)的心肌肥肥大向心力衰竭的轉(zhuǎn)變[15]。也有研究證實(shí)P53 的缺失部分通過(guò)抑制HIF1 信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)逆轉(zhuǎn)壓力過(guò)載引起的心臟重構(gòu)[16]。鈣信號(hào)通路、擴(kuò)張型心肌病信號(hào)通路同樣被證實(shí)在慢性心力衰竭致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。相關(guān)研究還表明細(xì)胞凋亡與心力衰竭發(fā)生進(jìn)展相關(guān)。miR-122 心臟特異性過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)線粒體依賴的心肌細(xì)胞凋亡并通過(guò)抑制Hand2促進(jìn)心力衰竭[18]。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)以及KEGG通路富集分析得出的結(jié)果，可以為慢性心衰的致病機(jī)制提供新的思路，發(fā)現(xiàn)潛在的生物學(xué)標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 和SOX17 均可以獨(dú)立應(yīng)用于慢性心力衰竭的診斷，并且診斷效能良好。VEGF 和SOX17 聯(lián)合構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)值作為診斷指標(biāo)，其效能高于兩者獨(dú)立作為診斷指標(biāo)，值得在臨床應(yīng)用中進(jìn)行推廣。