郭俊，張學(xué)堯，張建珍，劉曉健*

（1. 山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西 太原 030006；2. 山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

0 引言

核受體可與特異的配體結(jié)合，通過調(diào)控下游基因的表達(dá)在生命體中發(fā)揮重要作用，分7 個(gè)亞家族：NR0、NR1、NR2、NR3、NR4、NR5 和NR6［1］。核受體一般包括5 個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)非依賴配體的激活結(jié)構(gòu)域（A/B 結(jié)構(gòu)域）、DNA 結(jié)合域（C 結(jié)構(gòu)域）、鉸鏈連接域（D 結(jié)構(gòu)域）、配體結(jié)構(gòu)域（E 結(jié)構(gòu)域）和F 結(jié)構(gòu)域［2］，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都具有特定的結(jié)構(gòu)和功能，E75核受體屬于NR1 亞家族，命名為NR1D3。目前對E75 基因的研究多集中在完全變態(tài)昆蟲中，如埃及 伊 蚊（Aedes aegypti）［3］、煙 草 天 蛾（Manduca sexta）［4］、大蠟螟（Galleria mellonella）［5］、云杉芽卷蛾（choristoneura fumiferana）［6］、家 蠶（Bombyx mori）［7］、印度谷螟（Plodia interpunctella）［8］、歐洲蜜蜂（Apis mellifera）［9］、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）［10］、德國小蠊（Blattella germanica）［11］等。根據(jù)A/B 結(jié)構(gòu)域的不同，E75 可分為多個(gè)亞型，如家蠶中有3 個(gè)亞型［12］，馬鈴薯甲蟲有3 個(gè)亞型［13］，各亞型均受蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）調(diào)控且具有時(shí)間和空間特異性差異表達(dá)特性。如馬鈴薯甲蟲LdE75的3 個(gè)亞型基因均在體壁低表達(dá)，而在中腸、腹神經(jīng)節(jié)等多個(gè)組織高表達(dá)，且具有相似的發(fā)育表達(dá)特性［13］。本課題組前期克隆獲得E75 的3 個(gè)亞型：LmE75A、LmE75B和LmE75C，三者僅在A/B域不同，其余結(jié)構(gòu)域相同。研究發(fā)現(xiàn)3 個(gè)LmE75亞型基因具有不同的組織表達(dá)特性；LmE75A在體壁和肌肉中高表達(dá)，其次是觸角和前腸；LmE75B在體壁中高表達(dá)，其次是前腸；LmE75C特異性在體壁高表達(dá)［14］。

對E75 功能研究表明，E75 參與蛻皮激素信號途徑，且在其中扮演至關(guān)重要的作用。如在馬鈴薯甲蟲中取E75 不同亞型的共同區(qū)域進(jìn)行RNAi，影響蛻皮激素和保幼激素的滴度從而調(diào)控相關(guān)信號通路，最終導(dǎo)致馬鈴薯甲蟲化蛹困難而死亡［13］。黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）突變所有的E75亞型嚴(yán)重影響胚胎的存活且缺失E75 品系的細(xì)胞在卵黃生成中期即停止發(fā)育［15］。不完全變態(tài)昆蟲德國小蠊中5 個(gè)E75 亞型，全部亞型基因沉默后大部分個(gè)體無法正常蛻皮而死亡［11］。

飛蝗（Locusta migratoria）屬于不完全變態(tài)昆蟲，且是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害蟲，目前主要使用有機(jī)磷等化學(xué)殺蟲劑和真菌微生物農(nóng)藥進(jìn)行害蟲防治，化學(xué)農(nóng)藥的殘留危害環(huán)境和人類健康［16］。RNA干擾是由dsRNA 誘發(fā)的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象［17］。近年來，RNAi 技術(shù)因其具有高度特異性、高效性以及相對安全性等特點(diǎn)，在害蟲防治中展現(xiàn)了極大的潛力，并被稱為第四代殺蟲劑的核心技術(shù)。本文闡明了飛蝗LmE75基因的功能，為基于RNAi的飛蝗防治提供分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

飛蝗蟲卵由河北省滄州市建民蟲業(yè)公司提供。將蟲卵置于孵化盒中進(jìn)行孵化，期間噴灑適量水以保持沙土潮濕，孵化出的一齡若蟲轉(zhuǎn)移至25 cm×25 cm×25 cm 的紗籠中，在溫度為（30±2）℃，相對濕度為（40±10）%，光照14 h、黑暗10 h 的養(yǎng)蟲室中飼養(yǎng)，飼喂新鮮的小麥苗，待其生長發(fā)育至3 齡若蟲期開始輔以麥麩飼喂。

1.2 LmE75D基因cDNA序列分析

課題組前期已獲得飛蝗E75 的3 個(gè)亞型：LmE75A、LmE75B和LmE75C，后基于前胸腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索又獲得1 條E75D cDNA 序列。利用NCBI 網(wǎng)站中（http：//cms.ncbi.nlm.nih.gov）ORF Finder 軟件明確LmE75D基因的開放閱讀框序列。利用ExPASy 網(wǎng)站中（https：//www.expasy.org/）translate 軟件將LmE75D基因開放閱讀框序列翻譯為氨基酸序列，pI/Mw 軟件預(yù)測LmE75D 蛋白分子量（Mw）及等電點(diǎn)（pI）。利用SMART 軟件分析預(yù)測E75D 的蛋白結(jié)構(gòu)域，并和其他3 個(gè)飛蝗E75 亞型結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較，SignalP 分析E75 是否具有信號肽。運(yùn)用GENEDOC 軟件將LmE75A、LmE75B、LmE75C和LmE75D特異性的A/B 域核苷酸進(jìn)行比對，分析核苷酸一致度；運(yùn)用GENEDOC 軟件將4個(gè)飛蝗LmE75 亞型氨基酸序列與馬鈴薯甲蟲（LdE75A、LdE75B 和LdE75C）和 德 國 小 蠊（BgE75A、BgE75C 和BgE75E）氨基酸序列進(jìn)行比對，分 析 其DNA 結(jié) 合 域（DNA-binding domain，DBD）和 配 體 結(jié) 構(gòu) 域（Ligand-binding domain，LBD）。

1.3 LmE75D mRNA表達(dá)特性分析

為了研究LmE75D在不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性，選取5 齡第2 天（N5D2）飛蝗，在體視顯微鏡下解剖觸角、腦、前腸、胃盲囊、中腸、后腸、精巢、卵巢、體壁、脂肪體和翅11 個(gè)組織，選取并解剖4齡 第1－5 天（N4D1-N4D5）和5 齡 第1－7 天（N5D1-N5D7）飛蝗若蟲2－3 腹節(jié)處體壁并凍存于液氮中，－80 ℃保存?zhèn)溆谩? 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4 頭試蟲。

上述樣本RNA 的提取按照RNAisoTMPlus（TaKaRa）試劑說明書操作，用1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA 的質(zhì)量，利用NanoDrop 2 000 定量各個(gè)樣品的RNA 濃度。以1 μg 總RNA 為 模 板，根 據(jù)Reverse Transcriptase MMLV（RNase H-）（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成cDNA。運(yùn)用Primer 3.0 軟件設(shè)計(jì)LmE75D的特異性表達(dá)引物。每個(gè)樣本作2 個(gè)技術(shù)重復(fù)，以βactin作為內(nèi)參。利用軟件Primer 3.0 設(shè)計(jì)特異性的表達(dá)引物，引物信息見表1。2-△Ct法分析LmE75D基因在每個(gè)組織與發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Tukey’s HSD 進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，柱形圖上不同字母代表基因表達(dá)差異顯著。

1.4 基于RNAi的LmE75功能分析

1.4.1 dsRNA的體外合成與注射

由于飛蝗4個(gè)E75亞型N端A/B域核苷酸相似度較高，LmE75A 和LmE75B 以及LmE75C 的A/B 域核苷酸一致度為45.0%和47.7%，LmE75B 和LmE75C的A/B 域核苷酸一致度為64.1%，LmE75D和其他亞型相比僅在N 端A/B 域核苷酸差異60 bp，無法設(shè)計(jì)特異的有效dsRNA 進(jìn)行RNAi 實(shí)驗(yàn)，因此我們選擇了4 個(gè)LmE75 亞型共同區(qū)域設(shè)計(jì)dsRNA 以全部沉默4個(gè)LmE75 轉(zhuǎn)錄本，研究LmE75 在飛蝗中的生物學(xué)功能。根據(jù)4 個(gè)飛蝗LmE75亞型基因共同區(qū)域的核苷酸序列，在E-RNAi（http：//www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php）網(wǎng)站設(shè)計(jì)dsRNA 引物，引物信息見表1。以稀釋后的LmE75和GFP 質(zhì)粒DNA分別為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增以獲得用于體外轉(zhuǎn)錄dsRNA 的模板，按照2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN）說明書進(jìn)行PCR 反應(yīng)體系的配置及反應(yīng)程序的設(shè)置。PCR產(chǎn)物的回收純化按照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（Vazyme）說明書操作，之后用1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增條帶的單一性。利用純化后的DNA 產(chǎn)物為模板，參照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega）試劑盒說明書步驟分別合成LmE75和GFP基因的dsRNA，利用NanoDrop 2 000定量各個(gè)樣品的dsRNA濃度和純度。用ddH2O 將合成的dsRNA 稀釋至終濃度為2 μg/μL，置于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。挑取N4D1 的若蟲進(jìn)行dsRNA 注射，同時(shí)注射dsGFP作為對照組。每頭10 μg，設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 頭若蟲。注射完畢后，將所有試蟲放置于養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)。

表1 本文所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4.2 沉默效率檢測及表型觀察

注射dsRNA 48 h 后分別收集對照組dsGFP和處理組dsLmE75的飛蝗第2－3 體節(jié)體壁提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-qPCR 方法檢測LmE75的沉默效果，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，3 頭試蟲為1 個(gè)重復(fù)，并做2 個(gè)技術(shù)重復(fù)，操作與1.4 的檢測方法相同，其余試蟲用來觀察表型。

1.4.3 體壁HE染色及透射電鏡觀察

解剖對照組N4D5（脊線開裂時(shí)）和處理組蛻皮前死亡和蛻皮困難死亡的飛蝗第2－3 體節(jié)體壁組織制作顯微切片。用3%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛固定，一部分4 ℃過夜以制備石蠟切片，另一部分剝離舊表皮后，將新表皮送至青島醫(yī)科大學(xué)制備電鏡樣品。用于制備體壁HE 染色的樣品，步驟包括：1）不同濃度的酒精梯度脫水；2）不同比例的二甲苯和酒精進(jìn)行透明，之后浸蠟及包埋；3）切片后，依次用蘇木精和伊紅兩種染液染色；4）中性樹脂封片后，常溫保存?zhèn)溆?，利用Olympus BX51 顯微鏡觀察表皮結(jié)構(gòu)。HE 染色的詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)［18］。用于電鏡制備的樣品，步驟包括：1）戊二醛固定后，放入1%（體積分?jǐn)?shù)）的四氧化鋨中3 h；2）不同濃度丙酮梯度脫水后，用Epon812 滲透；3）半薄切片定位分析，1%（體積分?jǐn)?shù)）甲苯胺藍(lán)染色；4）制備超薄切片，圖片用JEM-1200EX 透射電子顯微鏡采集，詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)［19］。

2 結(jié)果

2.1 LmE75D基因序列特性分析

將搜索獲得的1 個(gè)LmE75基因cDNA 序列命名為LmE75D（GeneBank 登 錄 號 為MN584735），LmE75D的cDNA 序列其ORF 長度為1 971 bp，編碼656 個(gè)氨基酸；Smart 預(yù)測LmE75D核受體結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明：LmE75D A/B 域缺失、C 域（DBD）缺失、含有部分D域、完整的E域（LBD）和F域（圖1），使用ExPaSy預(yù)測蛋白分子量以及等電點(diǎn)，LmE75D 的相對分子量為71.44 kDa，其pI為堿性7.64。SignalP分析LmE75D蛋白沒有信號肽。綜合比較LmE75 4 個(gè)亞型的核苷酸差異僅在N端（圖2A），LmE75D和其他亞型相比僅在N 端A/B 域核苷酸差異60 bp；蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，LmE75A、LmE75B 和LmE75C 亞型具有典型的核受體結(jié)構(gòu)域：A/B 域、C 域（DBD）、D 域、E 域（LBD）和F域，而LmE75D 亞型A/B域缺失、C域（DBD）缺失、含有部分D 域、完整的E 域（LBD）和F 域（圖2B），4 個(gè)亞型的LBD 結(jié)構(gòu)域與其他昆蟲的LBD 結(jié)構(gòu)域具有高度一致性，其中DBD 結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)鋅指區(qū)域，每一個(gè)具有4 個(gè)半胱氨酸殘基。LBD結(jié)構(gòu)域中包含4 個(gè)參與血紅素結(jié)合的重要氨基酸殘基（圖2C）。

圖1 飛蝗LmE75D 序列分析下劃線所示為配體結(jié)合域；小三角所示為與血紅素結(jié)合的重要氨基酸殘基Fig. 1 Sequence analysis of LmE75D in L. migratoria LBD underlined is the ligand binding domain（LBD）；Small triangles show important amino acid residues that bind to heme

圖2 飛蝗LmE75 各亞型的生物信息學(xué)分析A：4 個(gè)LmE75 亞型N 端核苷酸序列比對；B：4 個(gè)LmE75 亞型結(jié)構(gòu)域分析；C：LmE75 亞型氨基酸序列與馬鈴薯甲蟲和德國小蠊E75 多重比對. 在序列的上方標(biāo)記DNA 結(jié)合域（DNA-binding domain）鉸鏈域（Hinge domain）配體結(jié)合域（Ligand-binding domain）。序列下方的圓圈指示鋅指中的四個(gè)Cys 殘基，三角形標(biāo)記參與血紅素結(jié)合的重要氨基酸殘基Fig. 2 Bioinformatics analysis of LmE75 isoformsA：Nucleotide alignment of the A/B domain of three LmE75 isoforms；B：Domain structure analysis of the LmE75 nuclear receptor isoforms；C：Multiple alignments of LmE75 isoforms with E75 of L. decemlineata and B. germanica The DNA-binding domain，hinge domain and ligand-binding domain are tagged above the sequence. The zinc binding site，the DNA binding site，the ligand binding site and the core regulatory site are labeled below the sequence，the circle indicates that there are four Cys residues in the zinc finger，and the important amino acid residues involved in heme binding are marked with triangles

2.2 LmE75D時(shí)空表達(dá)特性分析

RT-qPCR 檢測LmE75D在不同組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，LmE75D在馬氏管、體壁、前腸和后腸中表達(dá)量較高，而在卵巢中表達(dá)量最低（圖3A）。進(jìn)一步分析LmE75D在體壁4 齡第1－5 天（N4D1-N4D5）以及5 齡第1－7 天（N5D1-N5D7）的表達(dá)模式顯示，LmE75D在4 齡和5 齡若蟲每一天均衡表達(dá)（圖3B）。

圖3 飛蝗LmE75D 基因的時(shí)空表達(dá)（A）：AN：觸角；FG：前腸；GC：胃盲囊；MG：中腸；HG：后腸；FB：脂肪體；MT：馬氏管；SP：精巢；OV：卵巢；MU：肌肉；WP：翅；IN：體壁；BR：腦（B）：N4D1-N4D5 代表四齡第1-5 天，N5D1-N5D7 代表五齡第1-7 天，F(xiàn)ig. 3 Spatio-temporal expression of LmE75D in L. migratoria（A）：AN：Antennae；FG：Foregut；GC：Gastric caeca；MG：Midgut；HG：Hindgut；FB：Fat body；MT：Malpighian tubules；SP：Sperm；OV：Ovary；MU：Muscle；WP：Wing；IN：Integument；BR：Brain（B）：N4D1-N4D5 represent day 1 to 5 of the 4th instar nymphs，N5D1-N5D7 represent day 1 to 7 of the 5th instar nymphs

2.3 基于RNAi的LmE75生物功能分析

2.3.1LmE75沉默效率檢測及表型觀察

RT-qPCR 的結(jié)果表明，相比對照組，注射dsLmE75D的飛蝗其LmE75基因的表達(dá)被顯著抑制（圖4A）。當(dāng)對照組飛蝗5 天蛻皮發(fā)育為5 齡若蟲時(shí)，注射dsLmE75的飛蝗67.5%脊線未開裂于蛻皮前死亡，32.5%脊線開裂蛻皮失敗死亡（圖4B）。

圖4 注射dsLmE75 后基因表達(dá)以及表型分析Fig. 4 Gene expression and phenotypic analysis of L. migratoria after injected with dsLmE75

2.3.2 干擾LmE75后體壁H＆E 染色和透射電鏡觀察

體壁HE 染色的結(jié)果顯示，與對照組相似，注射dsLmE75D組可以正常發(fā)生皮層溶離，并且有新表皮合成和舊表皮降解過程（圖5A）。透射電鏡結(jié)果顯示，相比對照組，注射dsLmE75組的新表皮厚度明顯降低，對照組新表皮的層狀結(jié)構(gòu)有明顯的16層，而注射dsLmE75組的新表皮層狀結(jié)構(gòu)有12 層，相比對照減少4 層（圖5B）。

圖5 注射dsLmE75 后體壁HE 染色和透射電鏡TEM 分析Fig.5 HE staining and TEM analysis after injected with dsLmE75

3 討論

本研究基于飛蝗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，搜索獲得E75 的亞型LmE75D，開放閱讀框全長為1 971 bp，編碼656 個(gè)氨基酸。在黑腹果蠅D. melanogaster［15］、家蠶［12］、德 國小蠊［11］、褐 飛虱Nilaparvata lugens［20］、赤擬谷盜［10］和馬鈴薯甲蟲［13］等昆蟲中也發(fā)現(xiàn)E75 具有不同數(shù)量的亞型，如馬鈴薯甲蟲中有3個(gè)E75 亞型［13］，黑腹果蠅有4 個(gè)E75 亞型［15］，德國小蠊 有5 個(gè)E75 亞 型［11］。飛 蝗 有4 個(gè)E75 不 同 亞 型，LmE75A、LmE75B和LmE75C具有完整的一個(gè)非依賴配體的激活結(jié)構(gòu)域（A/B 結(jié)構(gòu)域）、DNA 結(jié)合域（C 結(jié)構(gòu)域）、鉸鏈連接域（D 結(jié)構(gòu)域）、配體結(jié)構(gòu)域（E 結(jié)構(gòu)域）和F 結(jié)構(gòu)域，而LmE75D 結(jié)構(gòu)域分析顯示A/B 域缺失、C 域（DBD）缺失、含有部分D 域、完整的E 域（LBD）和F 域。類似結(jié)果在德國小蠊中也有報(bào)道，如BgE75B 亞型含有部分DBD 和完整LBD，BgE75D 亞型缺失DBD 含有完整LBD［11］。果蠅E75 是血紅素傳感器，位于LBD 結(jié)構(gòu)域的血紅素中心能與雙原子分子（CO 或NO）結(jié)合［21］，和果蠅相似，飛蝗也含有4 個(gè)參與血紅素結(jié)合的重要氨基酸殘基。

本研究采用RT-qPCR 對LmE75D在不同組織以及發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明LmE75D在體壁、前腸、中腸等多個(gè)組織中表達(dá)。E75 基因的多組織分布特性在家蠶［12］、黑腹果蠅［15］、煙草天蛾［4］和馬鈴薯甲蟲［13］中也有報(bào)道，但不同昆蟲E75亞型的表達(dá)特性有所不同，如馬鈴薯甲蟲中3 個(gè)E75 均在體壁低表達(dá)，而在馬氏管、中腸、腹神經(jīng)節(jié)、腦-心側(cè)體-咽側(cè)體復(fù)合體等多個(gè)組織高表達(dá)［13］。LmE75D在4－5 齡每一天均衡表達(dá)，這 一 表 達(dá) 模 式 與20E 滴 度［18］沒 有 正 相 關(guān)，推 測LmE75D的表達(dá)可能不受20E 的調(diào)控。 這與LmE75A、LmE75B和LmE75C的 表 達(dá) 模 式 不 同，LmE75A和LmE75B在4 齡和5 齡期均在蛻皮中表達(dá)量最高，蛻皮前后表達(dá)量均較低，LmE75C在4 齡和5 齡期蛻皮前表達(dá)量最高。家蠶B. mori中3 個(gè)E75 亞型也表現(xiàn)出不同的發(fā)育表達(dá)模式［12］，而在馬鈴薯甲蟲中，3 個(gè)E75 亞型具有相似的發(fā)育表達(dá)特性［13］，表明不同昆蟲E75轉(zhuǎn)錄本在不同齡期可能發(fā)揮著不同的功能從而共同完成E75的功能。

目前僅在黑腹果蠅［15］、德國小蠊［11］和褐飛虱［20］中報(bào)道了E75 各亞型的功能，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)E75 亞型功能存在冗余現(xiàn)象，如德國小蠊不同轉(zhuǎn)錄本RNAi均能下調(diào)各自靶基因的表達(dá)量，但其他轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，最終沒有可見表型出現(xiàn)。由于飛蝗4 個(gè)E75 亞型N 端A/B 域核苷酸相似度較高，LmE75A 和LmE75B 以及LmE75C 的A/B 域核苷酸一致度為45.0%和47.7%，LmE75B 和LmE75C 的A/B 域核苷酸一致度為64.1%，LmE75D 和其他亞型相比僅在N 端A/B 域核苷酸差異60 bp，無法設(shè)計(jì)特異的有效dsRNA 進(jìn)行RNAi 實(shí)驗(yàn)，因此我們選擇了4 個(gè)LmE75 亞型共同區(qū)域，設(shè)計(jì)dsRNA 以全部沉默4 個(gè)LmE75 轉(zhuǎn)錄本研究LmE75 在飛蝗中的生物學(xué)功能。注射dsLmE75至4 齡若蟲后，LmE75的表達(dá)較對照組顯著降低，當(dāng)對照組飛蝗蛻皮發(fā)育為5 齡若蟲時(shí)，注射dsLmE75的飛蝗分別以蛻皮前死亡和蛻皮中致死兩種形式達(dá)到100%死亡率。進(jìn)一步對體壁進(jìn)行HE 染色和透射電鏡分析發(fā)現(xiàn)，注射dsLmE75組的若蟲，新表皮形成較對照組顯著減少。這與5 齡期LmE75RNAi 結(jié)果不同，注射dsLmE75至五齡第1 天后飛蝗出現(xiàn)發(fā)育延遲現(xiàn)象，死亡率達(dá)100%，且體壁無皮層溶離現(xiàn)象。蟲體承受dsRNA 的能力不同，可能導(dǎo)致4 齡注射和5 齡注射dsLmE75后表型的差異。類似結(jié)果在赤擬谷盜中也有報(bào)道，當(dāng)在幼蟲階段沉默TcE75后，一部分幼蟲在蛻皮時(shí)死亡，另一些幼蟲在靜息階段死亡［10］。而在德國小蠊中，注射BgE75的六齡若蟲可存活長達(dá)80 天，最終不能蛻皮為成蟲而死亡［11］。以上研究表明E75功能在昆蟲中是保守的。