王莉莉，吳文娟（同濟大學附屬東方醫(yī)院南院檢驗科，上海 200123）

感染性疾病是臨床常見病之一，若不及時診斷治療，極有可能進展為膿毒癥，造成患者多器官功能衰竭，甚至死亡。對引起感染的微生物進行鑒定是患者成功治療、康復和安全的關鍵。目前，傳統(tǒng)的病原學診斷方法主要是鑒定標本中的活微生物，其培養(yǎng)時間長且難以檢測苛養(yǎng)菌、胞內菌、病毒等病原體。常見的分子診斷技術包括基于核酸的診斷（如普通PCR 檢測和多重PCR 檢測）［1-2］、微陣列芯片［3］、液滴數字PCR 技術（digital droplet PCR，ddPCR）［4］等，但這些診斷技術不適用于復雜或包含多種微生物的臨床標本。宏基因組下一代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）一次運行可同時得到幾百萬到幾千萬條核酸分子的序列，從而對標本中所有病原體，尤其是復雜感染性疾病中少見、新發(fā)或不典型的病原體進行鑒定和分型，具有敏感性高、精確性強、檢測時間短等優(yōu)勢。該技術已被廣泛應用于各種臨床標本，如血漿、腦脊液、淚液及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）等。結合血漿標本的無創(chuàng)性、易獲得性和mNGS的高靈敏、高通量，血漿微生物游離DNA（microbial cell-free DNA，mcfDNA）mNGS在改善感染性疾病的診斷和治療方面顯示出廣闊的應用前景。

1 血漿mcfDNA 概述

1948年，Mandel和Metais 首次報道了來自患者或健康人體細胞釋放到體液中的游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）［5］。在健康個體中檢測到的血漿cfDNA 濃度差異很大，通常為0～100 ng／mL，有時甚至超過1 500 ng／mL。在某些疾病狀態(tài)下，尤其是炎癥性疾?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、癌癥）和感染性疾?。ㄈ缒摱景Y），cfDNA 的濃度有所增加［6］。cfDNA以多種形式存在于循環(huán)中，包括核基因組、線粒體基因組和微生物基因組的片段［7］。其中，人源DNA 占絕大多數（＞90%，甚至＞99%），而外源的mcfDNA只占小部分，0.08%～4.85%來自細菌，0.00%～0.01%來自真菌，0.00%～0.16%來自病毒或噬菌體。通過對1 例血培養(yǎng)陽性患者的血漿標本進行雙端測序，發(fā)現鮑曼不動桿菌cfDNA片段在150～200 bp 處存在主峰；相較于核基因組片段（正態(tài)分布），mcfDNA呈偏態(tài)分布［8］。

血漿mcfDNA的兩大來源包括微生物菌體入血和核酸片段入血。微生物菌體入血可能由于全身性血流感染致循環(huán)系統(tǒng)中存在微生物，或局灶感染時微生物短暫地侵入血液循環(huán)系統(tǒng)，造成一過性的菌血癥。這些入侵的微生物可被抗感染藥物和宿主免疫系統(tǒng)殺滅［9］，導致微生物DNA 釋放進入循環(huán)，在核酸外切酶的作用下形成小的DNA片段，即mcfDNA。核酸片段入血是由于血供豐富的器官發(fā)生局灶感染（如肺部），在巨噬細胞的免疫作用下，吞噬病原體后凋亡，向血液循環(huán)系統(tǒng)釋放出微生物核酸片段，或病原體感染人體細胞，造成人體細胞凋亡，向血液循環(huán)系統(tǒng)釋放出微生物核酸片段。研究表明，mcfDNA 的半衰期僅幾分鐘，短于核基因組片段（10～15 min），且主要通過肝臟清除［10］。

2 血漿mcfDNA mNGS 流程

作為非侵入性診斷技術，血漿mcfDNA mNGS通過捕獲和識別血液循環(huán)中高度片段化的mcfDNA 來診斷常見甚至罕見的感染。在微生物學實驗室中，mNGS 分析涉及濕試驗、干試驗兩部分（圖1）。

圖1 血漿微生物游離DNA宏基因組下一代測序的技術原理

2.1 濕試驗 濕試驗包括血漿標本處理、游離核酸提取、文庫制備和上機測序。

不同于其他臨床標本，血漿中人源和病原體核酸均以短片段游離形式存在，標本前處理無需破壁。血漿標本的宿主DNA含量高達90%～99%且存在異質性，易干擾病原體檢出序列數?？上蜓獫{標本中加入已知濃度的內標（非人源和病原核酸序列）以去除人源背景的影響，對病原的真實載量進行評估［11］。

常用的血漿游離核酸提取方法包括磁珠法和提取柱法［12］（表1），核酸提取后可直接用于建庫。文庫構建是對片段化核酸進行末端修復后，在兩端加上已知序列信息的寡核苷酸接頭以便于區(qū)分每個文庫。單個文庫構建完成后，可經過PCR擴增再將文庫等量混合后上機測序［13］。主流深度測序方法包括DNA 納米球測序、邊合成邊測序和半導體測序。測序平臺的測序長度一般為50～200 bp，少數儀器可達300～400 bp；測序數據量至少為10 兆條核酸序列數，根據實驗需求可適當增加測序數據量以提高檢測靈敏度［14］。PCR可同比放大微生物和人源核酸，而NGS按比例抽樣，如HiSeq2500測序運行時只檢測原始數據量的0.02%，因此，也可選擇PCR-free的文庫構建方法［15］。

表1 血漿游離DNA提取試劑盒

最近，Wang等［16］開發(fā)了自動化設備NGSmaster以實現濕試驗自動化，包括核酸提取、PCR-free文庫的制備和純化，將從標本處理到結果報告的時間由24～28 h縮短至16 h，降低人工操作且減少微生物污染。

2.2 干試驗 干試驗是mNGS 的重要環(huán)節(jié)，是對測序產生的原始數據進行處理和分析，包括生物信息學分析及實驗室對數據的解釋。生物信息學分析包括數據質控、人源序列比對過濾、微生物物種檢測等流程，由數據質控軟件（如FastQC）、比對軟件（如BWA）、物種分析軟件（如Taxonomer［17］）共同完成。解讀報告時，作為無菌標本，血漿應與正常有菌部位，如呼吸道、開放性傷口等進行區(qū)分。但也需排除臨床采樣污染、實驗室環(huán)境背景微生物等對檢測結果的干擾。

3 血漿mcfDNA mNGS 在感染性疾病中的應用

近30年來，血漿cfDNA逐漸成為臨床檢測中不可缺少的生物標志物，常用于產前篩查、移植和腫瘤個體化治療等。隨著對mcfDNA的認識加深，血漿mcfDNA mNGS 在感染性疾病檢測中取得快速進展，臨床主要應用于血流感染、常見呼吸系統(tǒng)細菌性感染以及侵襲性真菌感染等。

3.1 血流感染 血流感染易導致膿毒癥甚至感染性休克。2016年，Grumaz等［18］報告了一個完整的mNGS 診斷流程，從采樣到結果報告的30 h內，從血漿標本中識別出導致膿毒癥的病原體。該研究還顯示，膿毒癥患者與健康志愿者相比，血漿mcfDNA濃度顯著升高（9.82% vs 3.50%）。本實驗室及其他團隊研究表明，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，mcfDNA mNGS顯著提高了膿毒癥標本的病原體檢出率（約提高20%～30%）（表2），為制定合理的抗生素治療方案和揭示膿毒癥患者的病原體譜提供有用的信息［19-22］。2019 年，Blauwkamp等［11］提出了第一個商業(yè)化的定量血漿mNGS 試驗（Karius試驗），以每微升血漿中mcfDNA分子數作為檢測信號值，可準確評估不同基因組大小的病原體豐度，從而識別和量化血漿中1 250個臨床相關細菌、DNA 病毒、真菌和寄生蟲來源的mcfDNA。同時，通過檢測350 例疑似膿毒癥患者的血漿標本，發(fā)現mNGS診斷膿毒癥的敏感性為92.9%，特異性為62.7%；更有價值的是，對于2 周內接受過抗菌治療的患者，mNGS 的病原體檢出率明顯優(yōu)于血培養(yǎng)（47.9%vs 19.6%）。文獻報道，在血流感染發(fā)生前3天，通過mNGS檢測血漿中mcfDNA來預測兒科癌癥患者血流感染發(fā)生的預測敏感性為75%（高于其預先定義的50%的有利值），特異性超過80%，顯示mNGS 或可更好地輔助臨床醫(yī)生對血流感染發(fā)病時間作出預測［23］。但該研究未能覆蓋到所有免疫低下人群，方法應用價值需要進一步探索。

表2 血漿微生物游離DNA宏基因組下一代測序與初始血培養(yǎng)的性能比較

3.2 呼吸系統(tǒng)細菌感染 為了鑒定呼吸道病原體，通常進行細菌培養(yǎng)、PCR和抗原檢測，但只能鑒定某一類目標微生物。Farnaes等［24］利用血漿mcfDNA 診斷社區(qū)獲得性肺炎的敏感性達到86%（13／15），且47%（7／15）的兒童在抗生素管理方面發(fā)生了變化，而使用標準培養(yǎng)和PCR 方法識別出病原體的比例為47%。對于疑似肺部感染患者，Chen等［25］建議同時送檢BALF和血液標本，mNGS 檢測發(fā)現BALF 與早期血漿中的病原體高度一致，提示重癥肺炎患者的病原體可能從肺部播散到血流，即血液中的病原體可能部分預測了肺部存在感染。與血漿相比，BALF 標本人源背景較高，導致微生物讀數減少，從而降低了mNGS 的靈敏度［13］。為了對結核病進行早期診斷，可通過檢測血液中的mcfDNA來確定感染的存在［26］。即使沒有分枝桿菌血癥，痰涂片陽性結核病患者的血漿中也可以檢測到結核分枝桿菌復合群DNA［27］。Nomura等［28］發(fā)現對有心臟病手術史且存在分枝桿菌感染的患者進行血漿mNGS，可在標本采集后的第4天（中位數）檢測到分枝桿菌，比標準的抗酸桿菌培養(yǎng)快1 個多月；并且發(fā)現即使患者存在抗生素暴露，也可以從血漿中檢測到病原體cfDNA，表明mcfDNA可能是結核病檢測和治療監(jiān)測中的一項有價值的生物標志物。

3.3 侵襲性真菌感染（invasive fungal infection，IFI） 2018年，Hong等［29］首次報道使用血漿mNGS 檢測到IFI 患者感染的病原體核酸，其確診依據為穿刺液或組織真菌培養(yǎng)或靶向測序。運用血漿mNGS，還在一名患有播散性疾病的肺炎患者中發(fā)現了侵襲性真菌病原體——組織胞漿菌［30］，并在一名62歲患有移植物抗宿主病的造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）受者中檢測到2種引起侵襲性疾病的真菌（小克銀漢霉和Aspergillus lentulus），即混合感染［31］。Zhang 等［32］研究表明，與涂片及β－D－葡聚糖試驗等常規(guī)方法相比，mNGS對肺孢子菌肺炎的檢出率較好，并在血液、組織、BALF 和痰液中均檢出肺孢子菌，檢出病例中有3例為血漿mNGS 檢出的不耐受支氣管鏡檢查或拒絕侵入性手術的患者。本實驗室對一名67歲重癥肺炎患者連續(xù)2次進行血漿mNGS送檢，均檢出肺孢子菌，且隨著病情進展，檢出序列數逐漸增多且血清G 試驗陽性。這與Zhang等［32］的報告一致，可能是由于患者免疫系統(tǒng)受損，導致肺孢子菌的核酸片段穿透局部感染部位而進入外周血。2019年歐洲癌癥研究和治療組織／侵襲性真菌感染協作組（European Organization for Research and Treatment of Cancer／Mycoses Study Group，EORTC／MSG）侵襲性真菌感染指南更新中指出，在痰液、BALF 等真菌易定植部位的標本中檢出肺孢子菌和隱球菌核酸不可作為確診指標［33］。血液中抗原、抗體和游離核酸的檢測為不能體外培養(yǎng)的真菌感染的檢測提供有力的支持依據。Armstrong等［34］報道m(xù)NGS能成功檢測出兒科腫瘤、血液病和HSCT患者中的侵襲性真菌病原體，與從肺組織、胰腺假性囊腫液和頭皮傷口中培養(yǎng)分離出的真菌相關，證明了血漿mNGS 能夠從各種部位感染中檢測出種水平的真菌病原體。

4 血漿mcfDNA mNGS 面臨的挑戰(zhàn)

4.1 分析前 合格的血漿標本是mcfDNA mNGS 成功的關鍵。實驗室應制定合理的標本接收和拒收標準，若不滿足接收標準但又不能對患者重新采樣，可與臨床有效溝通后實施讓步mcfDNA mNGS。且mNGS 操作復雜，需要培養(yǎng)訓練有素的實驗室人員，在處理標本時避免錯誤和交叉污染。在Karius商品化試驗中，標本需要滿足以下標準：（1）使用EDTA-K2抗凝；（2）血漿量不少于1.2 mL；（3）必須在采血后96 h內分離血漿；（4）應將新鮮（在抽血后4 d內）或冷凍的標本送往實驗室［11］。由于血漿標本中mcfDNA的水平通常是微量的，人源DNA容易降低mcfDNA的檢測靈敏度（導致假陰性），而外源微生物DNA 污染將增加結果解釋的復雜性（導致假陽性），因此，可通過一系列方法減少DNA污染。例如，在取樣和處理標本過程中，醫(yī)務人員應該穿上防護服和保護設備（實驗室外套、口罩和一次性手套）覆蓋所有暴露的皮膚，以減少污染物進入標本［35］。實驗流程如耗材和試劑的制備、血漿分離和分樣等，需盡可能在干凈、隔離的工作環(huán)境中完成。此外，陰性對照（如取樣空白對照）、試劑評估是監(jiān)測實驗室和標本交叉污染的重要方法［15］。

4.2 分析中 提取試劑決定了回收cfDNA的質量。一項商業(yè)化cfDNA提取試劑盒評估試驗發(fā)現，提取柱法得到的游離核酸片段大小分布與原始添加的較為一致且總回收率更高，而磁珠法比提取柱法成本更低、流程更簡單［36］。研究發(fā)現，膿毒癥患者血漿中mcfDNA 在150～200 bp 處有一個主峰，且比人類cfDNA更碎片化［8］?；诖?，Burnham 等［7］開發(fā)了用于cfDNA 測序的單鏈DNA（ssDNA）文庫制備方法，其被證明在回收血漿中細菌和病毒的短片段cfDNA方面比雙鏈DNA（dsDNA）文庫制備方法更靈敏。除了提取試劑盒，全流程中各種試劑的選擇都應考慮生產過程中的工程菌和環(huán)境污染微生物的核酸殘留及其對檢測的影響。

濕實驗部分操作時間長，存在重復的移液操作，為減輕工作人員壓力，可將工作流程分成多個獨立的步驟，通過人員輪換來執(zhí)行，有助于避免實驗室錯誤。為了確保mNGS分析的質量和穩(wěn)定性，需要具有良好特性的參考標準和對照樣本。可以開發(fā)由微生物核酸組成的混合物作為外部對照，以確定檢測限。常見的陰性對照為不含任何微生物核酸的標本，可使用經確認的臨床陰性標本、商品化的人源模擬標本或核酸提取試劑的洗脫緩沖液等。自制的質控品均應有詳細的制備流程及驗證記錄，可供查詢［37］。

4.3 分析后 針對血漿mcfDNA 進行mNGS 檢測時，檢出序列可能屬于致病微生物、標本污染、死亡微生物裂解，或是定植菌群所致的一過性菌血癥，需要從臨床的角度綜合分析。目前，mNGS 發(fā)現的微生物的感染依據主要有［38］：（1）覆蓋率（物種水平）明顯大于任何其他微生物或陰性對照中的覆蓋率，或嚴格比對序列數位于微生物列表的前幾位；（2）與傳統(tǒng)檢測方法結果一致；（3）在治療過程中，測序讀數或病原體載量顯著減少；（4）經靶向抗菌藥物治療后患者病情好轉。然而，對mNGS 結果的報告在臨床上仍未實現標準化和統(tǒng)一化。為了對測序結果進行合理和準確的解釋，可參考以下方法：（1）對健康人血漿進行測序，以建立和維護一個基準數據庫，顯示陰性人群中微生物cfDNA 的類型和數量。（2）生信分析結果中疑似背景菌同樣會對病原診斷結果產生影響，應該建立本實驗室的背景微生物數據庫以控制假陽性結果。（3）開發(fā)統(tǒng)計模型，以提高自動識別真實病原體的能力。Brenner 等［39］創(chuàng)建了膿毒癥指示量器（SIQ）評分，以區(qū)分信號讀數與膿毒癥患者血液標本中的污染物或共生物種引起的干擾。（4）在向臨床報告最終陽性結果之前，應考慮其他方法（如培養(yǎng)、血清學檢測、組織病理學、ddPCR、Sanger測序等）來交叉驗證病原體或感染的存在。有文獻認為，現有的血漿cfDNA 測序技術仍需提高靈敏度，因此不能作為獨立或排除試驗使用，需結合臨床證據及常規(guī)培養(yǎng)手段［40］。（5）有必要建立一個多學科的團隊來評估檢測結果的臨床意義或對實驗室人員進行生物信息學和生物學方面的綜合培訓［13］。此外，mcfDNA mNGS無法鑒定與人類感染相關的RNA病毒，包括丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、諾如病毒等。為了鑒定以上RNA病毒，常見的替代方法包括血清學測試、qPCR、RNA-seq以及非靶向的mNGS RNA檢測技術。

5 結語

綜上所述，在一個新病原體不斷出現的時代，除了用改進的技術提高檢測效率外，不應盲目期待單一技術的完美結果。盡管血漿mcfDNA mNGS 在臨床檢測技術上仍有諸多挑戰(zhàn)，但其在疾病的預測、診斷、預后等方面均取得了較好的結果，改變了既往感染性疾病的診斷模式。相信在不久的未來，越來越多的實驗室可以進行本地化的血漿mcfDNA mNGS，有機結合流行病學、臨床表現、影像學和其他生物標志物等參數，改善患者診療、預后和抗菌藥物管理。