何鵬搏，李詠梅，劉宏斌，范世達(dá)，王金振，孫致遠(yuǎn)，李遠(yuǎn)航，彭 磊，王云月，李 琦

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明650201）（2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院）（3 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院）（4 云南省玉溪市華寧縣柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展辦公室）

柑橘黃龍病（citrus Huanglongbing）是一種嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)業(yè)的細(xì)菌性病害[1]，其病原菌主要由柑橘木虱和嫁接傳播，可侵染寬皮橘類(lèi)、柚、金橘、橙等重要經(jīng)濟(jì)水果[2]，尚無(wú)有效的商業(yè)化抗病品種和化學(xué)藥劑可防治[3]。目前中國(guó)已經(jīng)有300 多個(gè)縣報(bào)道有黃龍病發(fā)生。江西省贛州市自2013 年黃龍病暴發(fā)以來(lái)，砍了5 000 萬(wàn)株柑橘樹(shù)，嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。玉溪市柑橘種植面積達(dá)到1.47 萬(wàn)hm2，占玉溪市水果種植面積的1/3 以上[5]，其中華寧縣是重要的山地產(chǎn)區(qū)[6]，也是柑橘黃龍病病區(qū)[7]。

生物防治是一種環(huán)境友好型的病害防治方式，近些年來(lái)很受重視[8]。芽孢桿菌屬的細(xì)菌廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治[9]，其中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）L1-21 是一株分離自柑橘葉片的內(nèi)生細(xì)菌[10]，可防治柑橘黃龍病[11]。華寧縣柑橘的灌溉方式以微噴灌溉為主，本研究將根域灌溉技術(shù)與生物防治的方式結(jié)合，以期給柑橘黃龍病的田間防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)在云南省玉溪市華寧縣華溪鎮(zhèn)斑茅棵亞熱帶水果示范園內(nèi)，地理坐標(biāo)在北緯24°06′，東經(jīng)103°02′，海拔1 223 m，年日照時(shí)數(shù)2 190 h，年平均氣溫19.5 ℃，無(wú)霜期350 d，年平均空氣相對(duì)濕度70%～80%，該地區(qū)分雨季和旱季，平均年降水量930 mm，6—10 月為雨季，降水主要集中在6—8 月，11 月至次年5 月長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月的時(shí)間為旱季。試驗(yàn)地土壤透水性強(qiáng)、保水性差，屬沙礫土壤。

1.2 根域灌溉系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

2014 年開(kāi)始，作者團(tuán)隊(duì)在上述示范園內(nèi)構(gòu)建了水肥藥一體根域精準(zhǔn)自動(dòng)灌溉系統(tǒng)[12]，以2 年生蜜柑‘新津’幼樹(shù)為試材，開(kāi)始根域灌溉技術(shù)與微噴灌溉技術(shù)研究與試驗(yàn)，建立了對(duì)比研究試驗(yàn)基地，根域灌溉試驗(yàn)地面積0.67 hm2，微噴灌溉試驗(yàn)地面積0.33 hm2。試驗(yàn)地共有1 447 株柑橘樹(shù)，依據(jù)控制澆水、施肥、施藥的電磁閥分成8個(gè)不同區(qū)域，其中2號(hào)閥區(qū)域有柑橘樹(shù)120 株、8號(hào)閥192 株，均隨機(jī)標(biāo)記5 株病樹(shù)為生防菌處理區(qū)，7號(hào)閥區(qū)域有柑橘樹(shù)240 株，隨機(jī)標(biāo)記5 株樹(shù)為不用生防菌對(duì)照區(qū)，相鄰微噴灌溉地塊（人工開(kāi)關(guān)閥）有柑橘樹(shù)480株，其中1 行有15 株樹(shù)，選取5 株為空白對(duì)照。2017 年試驗(yàn)地與對(duì)照地均開(kāi)始試掛果，采果時(shí)發(fā)現(xiàn)疑似黃龍病病果及病樹(shù)，大部分集中在2、7、8號(hào)閥控制區(qū)域，標(biāo)記取樣檢測(cè)確診后，于2018 年開(kāi)始根部施用生防菌劑的黃龍病治療試驗(yàn)。

1.2.2 生防菌劑的施用

從2018 年3 月1 日開(kāi)始用菌，每月1 次，一直延續(xù)至2020 年2 月，共24 次?？莶菅挎邨U菌L1-21 由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害生防實(shí)驗(yàn)室分離，由云南省微生物發(fā)酵工程研究中心生產(chǎn)。稀釋300 倍，菌濃度為3×107cfu/mL，每次每株樹(shù)施菌液5 L。于2018 年5 月9 日和2019 年5月27 日抽取柑橘葉片，用于黃龍病菌含量檢測(cè)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃龍病菌含量檢測(cè)

取6 片柑橘葉片，清水洗凈，使用CTAB 法[13]提取葉中脈的DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Realtime Quantitative PCR，qPCR）法檢測(cè)柑橘黃龍病拷貝數(shù)，方法參照文獻(xiàn)［14］。所用引物為CQULA04F/CQULA04R（5′-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3′/5′-CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3′），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。TB Green Premix Ex Taq Ⅱ由 TaKaRa 公司。儀器為StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fiser Scientific）。反應(yīng)體系為：TB Green Premix ExTaq Ⅱ12.5 μL，引物CQULA04F/CQULA04R 各0.8 μL（10 μmol/L），去離子水5.9 μL，DNA 溶液5 μL（約100 ng），總體積25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)DNA 樣品3 次重復(fù)。做標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程：Y＝（33.934－X）/3.275，其中X為qPCR 反應(yīng)后的CT 值，Y為DNA 模板溶液的Lg 值。DNA 模板溶液的DNA 來(lái)自m（葉中脈質(zhì)量，g）且溶于100 μL 去離子水，所以黃龍病菌含量＝（10Y×100）/m。

病原菌下降率（%）＝［（處理前病原菌含量－處理后病原菌含量）/處理前病原菌含量］×100

校正防效（%）＝［（處理組病原菌下降率－空白對(duì)照組下降率）/（1－空白對(duì)照組下降率）］×100

1.3.2 柑橘果實(shí)品質(zhì)的測(cè)定

測(cè)定了柑橘果實(shí)可溶性固形物、維生素C、還原糖和總酸4個(gè)指標(biāo)。其中還原糖含量測(cè)定方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.7—2016?？扇苄怨绦挝锖繙y(cè)定方法參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2637—2014?？偹岷繙y(cè)定方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 12456—2008。維生素C 含量測(cè)定方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.86—2016。每株樹(shù)3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 1 年后防治效果

由表1 可知，采用根域灌溉1 年后，同一株柑橘樹(shù)的黃龍病病菌含量均下降，但是施菌液處理（8號(hào)閥）的柑橘黃龍病病菌含量下降幅度最大，平均下降率為98.39%，校正防效為86.29%；未施菌液處理（7號(hào)閥）和對(duì)照的黃龍病病菌平均下降率為96.36%、88.25%，可見(jiàn)生防菌劑對(duì)黃龍病病菌有一定的抑制作用。對(duì)照的黃龍病病菌含量也在下降，原因是施用生防菌劑枯草芽孢桿菌L1-21 后，該菌株在同一個(gè)區(qū)域里向四周擴(kuò)散，借風(fēng)雨覆瓦狀傳播，導(dǎo)致未直接處理的相鄰植株黃龍病菌亦減少。

表1 1 年內(nèi)柑橘黃龍病病菌含量對(duì)比

2.2 生防菌對(duì)柑橘果實(shí)品質(zhì)的影響

2018 年9 月、2019 年9 月和2020 年10 月測(cè)定了各處理果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明（表2），施菌液后（2號(hào)閥、8號(hào)閥）的果實(shí)可溶性固形物、維生素C、還原糖、總酸含量均未受到影響。然而，由于內(nèi)生枯草芽孢桿菌L1-21 在田間擴(kuò)散的原因，導(dǎo)致各處理植株果實(shí)品質(zhì)沒(méi)有明顯差異。

表2 1 年內(nèi)柑橘果實(shí)品質(zhì)各指標(biāo)對(duì)比

3 討論與結(jié)論

在以年為單位的時(shí)間里，黃龍病病菌含量是隨著時(shí)間的變化而變化的[13]，但施菌液處理（8號(hào)閥）的柑橘黃龍病病菌含量下降幅度大于未施菌液處理（7號(hào)閥），說(shuō)明生防菌劑對(duì)減少黃龍病菌有明顯的效果。在同一時(shí)期，施菌液處理（2號(hào)閥、8號(hào)閥）的柑橘樹(shù)黃龍病病菌平均下降率大于對(duì)照，說(shuō)明生防菌劑對(duì)黃龍病病菌有一定治療作用。特別值得說(shuō)明的是，柑橘樹(shù)一旦患上黃龍病，就變成不可逆。在每年同一個(gè)季節(jié)里，植株體內(nèi)的病菌數(shù)量不可能自動(dòng)減少，病情只會(huì)逐年加重，病菌數(shù)量增多，從而造成病樹(shù)逐年失去生產(chǎn)能力，最終死亡。

柑橘黃龍病在不同的寄主上，發(fā)病癥狀差異較大，又因其癥狀類(lèi)似缺素癥，且其病原菌不能培養(yǎng)，因此常用的病害診斷方法為PCR 檢測(cè)和熒光定量檢測(cè)[14]。其中熒光定量檢測(cè)方法不僅靈敏度高，還可以對(duì)病原菌定量。本研究采用此方法測(cè)定病原菌含量，比較不同年份同一月份的病原菌含量，以病原菌下降率來(lái)計(jì)算防效，結(jié)果較為可靠。黃龍病為系統(tǒng)病害，根、莖、葉和果均可檢出病原菌，但其含量不同[15]。Johnson 等[16]研究表明，黃龍病的病原侵染柑橘后，優(yōu)先定殖于根部，根部就像一個(gè)病原菌庫(kù)，源源不斷地為新葉提供病原菌。因此柑橘黃龍病的防治，根部健康不容忽視?？莶菅挎邨U菌L1-21 是柑橘內(nèi)生菌，葉面噴施和灌根均可使其定殖在柑橘的根、莖、葉和果實(shí)內(nèi)。施用L1-21 的柑橘園周?chē)臇|、南、西、北4個(gè)方向1 km 內(nèi)均可檢測(cè)到L1-21 定殖，并且定殖量較高[17]。此外，L1-21 還可定殖在柑橘園內(nèi)的多種雜草里[10]，這些結(jié)果表明L1-21 可以離開(kāi)植株寄主，借風(fēng)雨傳播開(kāi)來(lái)，這就是為什么未施生防菌劑但是緊靠處理組的7號(hào)閥、對(duì)照的病原菌含量也下降的原因，而小路對(duì)面的對(duì)照組因?yàn)殡x處理組較遠(yuǎn)，其病原菌含量下降率低于7號(hào)閥。因此，以后的田間試驗(yàn)對(duì)照不能設(shè)在相鄰地塊，必須間隔1 km 以上。菌株L1-21 在田間的這種擴(kuò)散特性有利于田間防治，即只是在部分植株或地塊，特別是在上風(fēng)口處施用菌劑，就能很好地減輕病害。L1-21 處理柑橘后，代謝組結(jié)果表明，寄主與抗病相關(guān)物質(zhì)發(fā)生變化[11]，防治黃龍病可能的機(jī)制為誘導(dǎo)抗病性，但其機(jī)制尚未十分明確。

柑橘黃龍病可影響果實(shí)品質(zhì)和造成減產(chǎn)，果實(shí)癥狀為“紅鼻子果”[18]。本試驗(yàn)田因L1-21 的擴(kuò)散，所有植株均未出現(xiàn)“紅鼻子果”。本研究中生防菌對(duì)柑橘果實(shí)品質(zhì)4 項(xiàng)指標(biāo)影響不明顯，也可能與該菌株擴(kuò)散有關(guān)。

目前尚無(wú)有效的商業(yè)化抗病品種和化學(xué)藥劑防治黃龍病，常用防治方法為采取微量元素補(bǔ)給、控制傳播載體柑橘木虱來(lái)阻斷傳播和砍伐發(fā)病植株[19]。微量元素補(bǔ)給在病害較輕時(shí)可在一定程度上保證柑橘產(chǎn)量，防治柑橘木虱重在預(yù)防，而砍樹(shù)對(duì)于產(chǎn)量來(lái)說(shuō)是毀滅性的。本研究結(jié)合微生物菌劑的生物防治方法，用機(jī)械灌溉的方法根施生防菌劑，以期為柑橘黃龍病的田間防治提供新思路。由于未做葉片、果實(shí)和根部的生防菌檢測(cè)，植株體內(nèi)有多少生防菌在發(fā)揮作用，還有待于進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證。