郭玉琦，劉 瀏，鄧麗玲，熊恒慶，吳 磊，陳 蓉，汪明權(quán)*

（1．武漢市動物園，湖北 武漢 430050；2．南京市紅山森林動物園，江蘇 南京 210028）

火烈鳥，又名紅鸛、紅鶴，屬于火烈鳥目，火烈鳥科，火烈鳥屬，共三屬六種，分別為大紅鸛（Phoenicopterus roseus）（古巴火烈鳥）、智利火烈鳥（Phoenicopterus chilensis）、加勒比海紅鸛（Phoenicopterus ruber）、小紅鸛（Phoeniconaias minor）、秘魯紅鸛（Phoenicoparrus jamesi）、安第斯紅鸛（Phoenicoparrus andinus）?；鹆银B外觀多呈火紅色、脖頸長而彎曲、體態(tài)優(yōu)美，深受人們喜愛?；鹆银B屬于非平胸類鳥，此類鳥不能從外觀上判斷雌雄，采用翻肛或者測定激素的方法困難較大，通常使用分子技術(shù)的手段鑒定性別。與哺乳動物不同，大多數(shù)鳥類的雌性染色體為ZW型，雄性染色體為ZZ型，因此既可以擴(kuò)增W染色體上的特異序列，也可以比較Z、W上同源序列的差異。因此，擴(kuò)增W染色體上特異性序列能夠區(qū)分鳥類動物的雌雄。使用較多的性別連鎖鑒定的基因主要有CHD基因和EE0.6序列。CHD基因基本上存在于所有非平胸類鳥類中，研究最為廣泛，擴(kuò)增成功率最高[1]。EE0.6是在雞的W染色體上克隆的非傳統(tǒng)型基因，包含EcoR1片段和一段類似外顯子的序列ET15（很可能是一個假基因），由于其在W、Z染色體上有一段差異較大的同源序列，所以在很多鳥類性別鑒定中應(yīng)用廣泛[2]。武漢動物園自引進(jìn)火烈鳥后一直未能繁殖，為探究緣由，本試驗選取6對較為常用的鳥類性別鑒定引物，對武漢動物園未知性別的54只火烈鳥進(jìn)行鑒定，并測試不同的反應(yīng)條件和引物組也可以應(yīng)用到其他鳥類的性別鑒定上，同時為武漢動物園火烈鳥的飼養(yǎng)管理和繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

54只來自武漢動物園未知性別的火烈鳥血樣；3只已知性別的南京紅山森林動物園的火烈鳥血樣。

1.2 儀器與試劑

臺式離心機(jī)（MIKRO）、PCR儀（AppliedBiosystem）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、紫外分析儀（BIORAD）、DNA測序儀ABI3730（AppliedBiosystem）、磁珠純化儀（Thermo）、分光光度計（Thermo）。

2×TaqPCRMasterMix（天一輝遠(yuǎn)生物科技公司）、PCR板（AXYGEN）、磁珠法口腔拭子基因組提取試劑盒（武漢納磁生物科技公司）、Big Dye染料（AppliedBiosystem）、磁珠法PCR產(chǎn)物回收試劑盒（英芮城生化科技公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 血樣DNA的提取

血樣收集到EDTA抗凝管中，加入200μL組織消化液GHA和20μL ProteinaseK。采用武漢納磁生物科技磁珠法提取試劑盒提取血液中的DNA，產(chǎn)物經(jīng)檢測，OD值均在1.8~2.0之間，符合后續(xù)試驗要求，DNA于4℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計

采用鳥類通用的CHD基因引物對2550F/2718R、P2/P8；3007F/3112R及EE0.6基因3對引物SINT-F/SINT-R、USP1-F/USP1-R、CPE15F/CPE15R[1-2]，引物設(shè)計見表1。對武漢動物園未知性別的54只火烈鳥和南京紅山森林動物園已知性別的3只火烈鳥DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增。

表1 引物設(shè)計Tab1 Primers design

1.3.3 PCR擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系為2×PowerTaqPCRMasterMix 15μL、DNA 1μg、上下游引物各1μL、ddH2O 12μL，總體積為30μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s、51.5℃退火50 s、72℃延伸50 s，循環(huán)35次；72℃末端延伸4 min，4℃保存。

1.3.4 PCR產(chǎn)物檢測

采用1%的瓊脂糖凝膠對樣品進(jìn)行檢測，于凝膠成像分析儀中進(jìn)行拍照，對得到的結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2550F/2718R引物擴(kuò)增武漢和南京的火烈鳥的DNA結(jié)果（見圖1、圖2）

圖1 武漢動物園54只火烈鳥電泳圖（2550F/2718R）Fig.1 Electrophoresis of 54 flamingos in Wuhan zoo(2550F/2718R)

圖2 南京紅山森林動物園已知性別的火烈鳥電泳圖（2550F/2718R）Fig.2 Electrophoresis of known sexes flamingos in Nanjing zoo(2550F/2718R)

由圖1可知，Lane2、4、5、8、12、13、24、26、28、32、33、35、37、39、41、49、51、54均出現(xiàn)2條帶，分別在500~750 bp和400~500 bp；其他樣品只出現(xiàn)1條帶，在500~750 bp，可以預(yù)判出現(xiàn)兩條帶的18只火烈鳥為雌性，只有一條帶的36只火烈鳥為雄性，但是需要已知性別的火烈鳥進(jìn)行驗證，故向南京紅山森林動物園借用3只已知性別的火烈鳥血樣進(jìn)行驗證。

由圖2可知，lane1表示南京紅山森林動物園的雄性火烈鳥經(jīng)CHD基因引物（2550F/2718R）擴(kuò)增結(jié)果，只有一個條帶，在500~750 bp，lane2和3代表其雌性火烈鳥擴(kuò)增結(jié)果，出現(xiàn)了兩條帶，分別在500~750 bp和400~500 bp，說明不同性別的火烈鳥在CHD基因特異性引物對的擴(kuò)增下的確出現(xiàn)了不同條帶，條帶大小也和武漢動物園54只火烈鳥電泳的條帶大小一致，驗證了圖1預(yù)判的結(jié)果準(zhǔn)確，故武漢動物園有18只雌性火烈鳥，36只雄性火烈鳥，雌雄比為1∶2。

2.2 多重PCR結(jié)果（見圖3、圖4）

采用多重PCR將兩對引物同時加入反應(yīng)體系中，圖3代表了混合SINT-F/SINT-R、USP1/USP3兩對引物PCR擴(kuò)增結(jié)果。由圖3可知，雌性火烈鳥中出現(xiàn)了兩條帶，在450 bp和200 bp，雄性火烈鳥僅在200 bp的位置有一條帶。

圖3 混合SINT-F/SINT-R、USP1/USP3兩對引物后武漢動物園火烈鳥電泳圖Fig.3 Electrophoresis of flamingo in Wuhan zoo after mixing SINT-F/SINT-R and USP1/USP3 primers

由圖4可知，所有的火烈鳥經(jīng)USP1/USP3、CPE15F/CPE15R兩對引物擴(kuò)增后基本上均出現(xiàn)兩條帶，但雌性火烈鳥的300 bp左右的條帶更加明亮，雄性火烈鳥的300 bp的條帶較暗，均在250 bp左右出現(xiàn)了第二條帶。

圖4 混合USP1/USP3、CPE15F/CPE15R兩對引物后武漢動物園火烈鳥電泳圖Fig.4 Electrophoresis of flamingo in Wuhan zoo after mixing USP1/USP3 and CPE15F/CPE15R primers

2.3 P2和P8、3007F和3112R以及EE0.6基因3對引物擴(kuò)增火烈鳥DNA

5對引物單獨對火烈鳥DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并未出現(xiàn)雌性火烈鳥兩條帶，雄性火烈鳥一條帶的結(jié)果，不能通過該結(jié)果判斷雌雄。

3 討論

本次試驗采用的引物對2550F/2718R是擴(kuò)增CHD基因上的特異性片段，在非平胸目鳥類的性別鑒定中應(yīng)用較廣，方法也較為成熟。1996年，Griffiths等[1]首次發(fā)現(xiàn)在非平胸目鳥類中均含有CHD-W基因，由于CHD-Z、CHD-W基因中外顯子相同，但內(nèi)含子大小不同，根據(jù)這一原理能夠準(zhǔn)確鑒定鳥類的性別。擴(kuò)增后雌性有2條帶、雄性為1條帶。胡銳穎等[3]采用2550F/2718R鑒定了9種86只國家一級保護(hù)鳥類的性別；陳蓉等[4]鑒定了南京紅山森林動物園中的美洲紅鹮和火烈鳥的性別。結(jié)合本試驗和其他人研究結(jié)果，推測2550F/2718R引物可以大量使用在國內(nèi)大多數(shù)珍稀鳥類的性別鑒定中，如火烈鳥、丹頂鶴、白鶴、東方白鸛等，后續(xù)也會繼續(xù)使用該引物和已經(jīng)成功摸索出的PCR條件來鑒定其他珍稀鳥類的性別，如美洲紅鹮、白骨頂雞、鵜鶘等，可以提高鳥類性別鑒定的效率。

另外，還有很多引物也能鑒定鳥類性別，如CHD基因上的P2/P8、3007F/3112R，EE0.6序列上的3對引物（SINTF/SINTR、USP1/USP3、CPE15F/CPE15R）也曾成功鑒定多種鳥類的性別[1,5-8]。本試驗選用剩下5種引物進(jìn)行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除2550F/2718R引物能夠準(zhǔn)確鑒別火烈鳥性別以外，其他5種引物對的電泳結(jié)果無法判定本園古巴火烈鳥的性別，與其他文獻(xiàn)中的結(jié)果不一致。此結(jié)果可能因為P2/P8這對引物更多試驗成功在雞、海鷗和金剛鸚鵡上[9-10]，而黑美洲鷲、烏鴉上只出現(xiàn)一條帶，雌雄鳥的電泳條帶出現(xiàn)在不同的位置；3007F/3112R在白鹡鸰和白頭翁兩種鳥類上也未能鑒定性別，雌雄均在同樣的位置出現(xiàn)條帶，僅在山雀上區(qū)別了雌雄，出現(xiàn)了兩條帶[10]。上述研究結(jié)果表明，這兩對引物在擴(kuò)增不同物種的性染色體時，擴(kuò)增出來的片段不一定具有特異性，有的雌雄片段大小相似，而有的鳥類雌雄片段無同源性。因此，是否能將P2/P8、3007F/3112R應(yīng)用于鑒定武漢動物園其他珍稀鳥類的性別，需要進(jìn)一步試驗研究。

陳武等[11]使用CPE15F/CPE15R和AWS03/USP3擴(kuò)增丹頂鶴的EE0.6序列，成功鑒定了丹頂鶴的性別；Owaga[2]成功使用EE0.6基因上的引物鑒定了11種鳥類的性別，但對于雌性的相思鸚鵡和王企鵝卻無法擴(kuò)增出兩條帶，說明單對引物擴(kuò)增EE0.6序列存在操作缺陷，無法準(zhǔn)確判斷鳥類的性別，因此選擇合適的引物組合較為關(guān)鍵[12]。本試驗中，對EE0.6基因上的3對引物對采用多重PCR的方法，結(jié)果顯示，SINT-F/SINT-R、USP1/USP3擴(kuò)增出來的結(jié)果與預(yù)期一致，表明有18只雌性和36只雄性，條帶分別在450 bp和200 bp，與李文斌等[12]結(jié)果較相似，但采用USP1/USP3、CPE15F/CPE15R兩對引物擴(kuò)增目的基因后，所有火烈鳥均出現(xiàn)了兩條帶，雖然亮度不一樣，但無法說明性別之分，與李文斌的結(jié)果有差異?？紤]到胡銳穎等[3]使用EE0.6序列上的引物擴(kuò)增出來的結(jié)果與我園火烈鳥擴(kuò)增出來的結(jié)果一致，因此不同物種不會影響結(jié)果。多重PCR對我園火烈鳥或是其他珍稀鳥類性別鑒定上的應(yīng)用還需進(jìn)一步的研究。

除了采血可以提取DNA，鑒定性別外，還可以通過羽毛來提取DNA。拔羽的時候需要獲取帶毛囊的羽毛，提取DNA的量不如血樣提取的量大，但刺激較小，適用于美洲紅鹮等應(yīng)激性較強(qiáng)的鳥類，也適合晚成雛鳥在早期的鑒定性別[13]。故需要根據(jù)不同的情形使用不同的采樣方法。

武漢動物園在2012年和2013年引進(jìn)火烈鳥以后，一直未有成功繁殖的記錄，僅在2019年7~8月份下了11枚蛋，但全部為未受精蛋。我園在火烈鳥的繁殖問題上一直未有突破。本試驗初次鑒定了武漢動物園火烈鳥的性別，結(jié)果表明，雄性火烈鳥遠(yuǎn)大于雌性，雌雄比為1∶2?；鹆银B是一夫一妻制的配對形式[14]，可能出現(xiàn)繁殖期未配對的火烈鳥對配對成功的火烈鳥夫妻進(jìn)行干擾，或者打架爭執(zhí)，影響火烈鳥的整個繁殖季節(jié)[15-16]。后續(xù)會考慮隔離體重小、活力不強(qiáng)的雄性火烈鳥，使其雌雄比為1∶1，改善它們的配對環(huán)境，并在后續(xù)的研究中試圖引進(jìn)人工翻肛采精和授精的技術(shù)，突破我園火烈鳥多年的繁殖困難。

4 結(jié)論

本研究采用分子技術(shù)的手段，使用CHD基因上的引物對2550F/2718R成功鑒定了武漢動物園火烈鳥的性別，并用南京紅山森林動物園的已知性別火烈鳥進(jìn)行驗證，結(jié)果表明，我園共有18只雌性和36只雄性火烈鳥，雌雄比為1∶2，采用多重PCR的方法發(fā)現(xiàn)混合SINT-F/SINT-R、USP1/USP3兩對引物能夠鑒定出火烈鳥的性別。