高錄貴，陳朝喜

（1．淮安生物工程高等職業(yè)學校，江蘇 淮安 223200；2．西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041）

牦牛是青藏高原及其周邊地區(qū)最重要的草食家畜，能夠適應海拔3 000 m以上的極寒氣候，為藏區(qū)同胞提供奶、肉等生活資料[1-2]。阿壩和甘孜藏族自治州位于川西北藏族聚居區(qū)。該地區(qū)生存著的大量牦牛，為牧民提供的牛奶及其奶制品。牦牛奶豐富的營養(yǎng)和獨特風味備受牧民喜愛[3]。Bandyopadhyay等[4]報道，牦牛是產志賀氏毒素大腸桿菌的天然宿主，且腸道致病性大腸桿菌在牦牛奶及其奶制品中也檢測到。然而，國內關于牦牛源大腸桿菌的報道相對較少。本研究主要對采自川西北高原牦牛糞便源大腸桿菌進行耐藥性、生物被膜表型和Ⅰ類整合子的檢測，以期為后續(xù)檢測牦牛源大腸桿菌多重耐藥性提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

412株大腸桿菌從川西北高原的阿壩和甘孜藏族自治州的牦牛繁育基地和成都青白江區(qū)牦牛屠宰場的健康牦牛糞便樣本分離。大腸桿菌標準株ATCC25922由西南民族大學獸醫(yī)藥理學實驗室保存。

1.2 抗菌藥物

14種抗菌藥物恩諾沙星、阿米卡星、慶大霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、安普霉素、阿莫西林、卡那霉素、利福平、左旋氧氟沙星、磺胺嘧啶、頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢噻呋，均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 分子生物學試劑

普通PCR分子生物學試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 最小抑菌濃度（MIC）的測定

試驗分析參考NCCLS推薦的微量肉湯稀釋法，對412株大腸桿菌進行14種抗菌藥物最小抑菌濃度測定，試驗結果利用WHONET 5.6軟件統(tǒng)計分析。

1.4.2 生物被膜形成試驗

參考文獻[5]的方法，采用改良結晶紫染色方法對生物被膜進行半定量測定。操作步驟如下：37°C條件下，所有菌株在聚乙烯96孔板內培養(yǎng)24 h，滅菌去離子水浸沒洗滌2次。96孔板孔內黏附的細菌用0.2 mL無水甲醇固定20 min，棄去甲醇并自然風干。每孔加入0.2 mL 2.5%結晶紫染色10 min。棄去多余的染料后用滅菌去離子水洗滌3次。過夜風干后每孔內加入160μL 33%冰乙酸溶解染料，利用ELX800酶標儀在570 nm處測定各孔OD值。試驗重復3次。

1.4.3 I類整合酶基因PCR檢測

根據說明書操作步驟，采用商業(yè)化試劑盒對過夜培養(yǎng)的大腸桿菌進行基因組DNA提取。intI1基因的引物序列參考Bass的方法：intI1-F：5'-CCTCCCGCACGATGATC-3'和intI1-R：5'-TCCACGCATCGTCAGGC-3'[6]。25μL標準反應體系包括2 pmolintI1引物、10 nmol dNTP混合物、50 ng DNA模板和1U ExTaq DNA多聚酶。intI1基因擴增步驟：94°C條件下預變性10 min；94°C預變性45 s，56°C條件下退火30 s，最后72°C延伸45 s，30個循環(huán)；94°C條件下延伸10 min。

2 結果與分析

2.1 牦牛源大腸桿菌MIC和耐藥菌株數量（見表1）

從481份糞便樣本中共分離鑒定大腸桿菌412株，分離率為85.65%（412/481）。由表1可知，分離菌株對利福平、氟苯尼考和頭孢噻呋的耐藥率較高，多西環(huán)素和慶大霉素次之，對氟喹諾酮類恩諾沙星和左旋氧氟沙星的耐藥率在30%以上。

表1 牦牛源大腸桿菌MIC和耐藥菌株數量Tab.1 MIC and No.of resistant strains for Escherichia coli isolated from yaks

2.2 生物被膜半定量檢測結果（見圖1）

參考文獻[7]方法，根據ODs值大小將412株大腸桿菌的生物被膜形成能力分為4種不同的表型：無成膜能力、弱成膜能力、中等成膜能力和強成膜能力。由圖1可知，大多數菌株表現(xiàn)出弱的生物被膜表型，占菌株總數的57.52%（237/412）。

圖1 412株牦牛源大腸桿菌生物被膜形成能力Fig.1 Biofilm-forming ability of 412 Escherichia coli isolated from yaks

2.3 牦牛源大腸桿菌intI1基因PCR擴增結果（見圖2）

圖2 牦牛源大腸桿菌intI1基因PCR擴增結果Fig.2 intI1 amplification results of the Escherichia coli isolated from yaks

由圖2可知，127株大腸桿菌擴增到intI1約280 bp，占菌株總數的30.82%（127/412）。127株大腸桿菌中，僅有1株無成膜能力，其他菌株表現(xiàn)出不同的生物被膜形成能力。

3 討論

本研究中，從采自481份牦牛糞便樣本中共分離鑒定大腸桿菌412株。MIC結果顯示，分離菌株對選用的抗菌藥物的耐藥水平較高，對利福平、氟苯尼考和頭孢噻呋的耐藥率分別為95.0%、88.3%、53.3%；多西環(huán)素、慶大霉素次之，耐藥率分別為48.3%和45.8%；其他9種抗菌藥物的耐藥率菌株45%以下。在所有的試驗藥物中，分離菌株對阿米卡星的耐藥率最低，為20.8%。此外，本研究結果表明，30%以上的菌株對氟喹諾酮類恩諾沙星和左旋氧氟沙星的耐藥率，高于Kijima-Tanaka等[8]的研究結果。

57.52%的菌株表現(xiàn)出弱生物被膜形成能力，30.82%的菌株攜帶Ⅰ類整合子基因。試驗結果也表明，intI1基因陽性菌株表現(xiàn)出對磺胺嘧啶、安普霉素、多西環(huán)素和慶大霉素耐藥的多重耐藥表型。

盡管本研究分離的菌株來源于健康牦牛，然而由于抗生素的濫用和不正確合理用藥仍然存在耐藥菌株，而且大腸桿菌能夠在抗生素持續(xù)壓力下形成生物被膜以逃避抗生素的滲透和機體免疫系統(tǒng)的清除。以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌多重耐藥性與整合子和生物被膜形成息息相關，它們可以在自身重組酶的作用下交換抗生素耐藥基因。研究表明，大腸桿菌生物被膜的形成與多重耐藥基因和毒力基因存在相關性[9-12]。基于本研究的試驗結果，在后續(xù)的工作中，將重點關注在不同抗生素選擇壓力下，大腸桿菌生物被膜形成、耐藥譜型和整合子之間的相關性，以闡明生物被膜的形成對大腸桿菌耐藥性的影響及作用機制。

4 結論

本試驗研究結果表明，從481份牦牛新鮮糞便樣本中分離鑒定412株大腸桿菌，分離菌株對利福平、氟苯尼考和頭孢噻呋的耐藥率較高；多西環(huán)素、慶大霉素次之；對其他9種抗菌藥物的耐藥率均在45%以下，其中對阿米卡星的耐藥率最低（20.8%）。412株大腸桿菌中，57.52%的菌株表型出弱生物被膜形成能力，30.82%的菌株攜帶Ⅰ類整合子基因，intI1基因陽性菌株對磺胺嘧啶、安普霉素、多西環(huán)素和慶大霉素等表現(xiàn)出多重耐藥。