吳 優(yōu)，王曉媛，甄 莉

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163000）

miRNA是發(fā)現(xiàn)的較晚的一類單鏈小分子非編碼RNA，在植物到動物組織中廣泛存在，在生物的發(fā)育、生殖、疾病、細胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮調(diào)控作用。miRNA分子很小，僅由20~24個核苷酸組成，通過靶向抑制或降解mRNA在轉(zhuǎn)錄水平進行基因表達的調(diào)控[1]。生物的一切活動均與環(huán)境密不可分。低溫作為一種最常見的非生物因素對動、植物生理機能產(chǎn)生直接影響。由低溫引起的冷應(yīng)激常發(fā)生于早春和晚秋季節(jié)，尤其是濕度大的天氣，可導致畜禽生長發(fā)育遲緩，代謝紊亂，免疫力、生產(chǎn)性能、繁殖性能下降，甚至導致死亡[2]。冷應(yīng)激研究過程中發(fā)現(xiàn)，松鼠、大鼠、蝙蝠、斑馬魚等動物的心臟、骨骼肌、肝臟、脂肪等器官和組織中有多種miRNA與冷應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，如miR-425、miR-483、miR-92b、miR-383等[3-5]。miR-383是miRNA家族的一員，主要參與細胞的氧化損傷、增殖、凋亡等生物進程[6]，其表達失調(diào)已在癌癥、不孕不育、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病中得到證實[7-8]。本研究通過qRT-PCR法檢測急性冷暴露仔豬多器官中miR-383的表達量，以明確急性冷暴露是否能夠影響miR-383在組織器官中的表達，從而揭示冷應(yīng)激反應(yīng)中miR-383的調(diào)控機制，為冷應(yīng)激的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選取體況相近、健康的斷奶仔豬（30日齡）16頭，隨機分為對照組（NT）和冷暴露組。對照組條件為（24±2）℃，相對濕度40%~50%；冷暴露條件為（4±2）℃，相對濕度40%~50%。冷暴露組又分為3個處理，分別進行2（CE 2 h）、6（CE 6 h）和12 h（CE 12 h）冷暴露，每組4頭仔豬。飼養(yǎng)試驗在人工氣候室內(nèi)進行。預試7 d后，進行冷暴露試驗。試驗期間自由采食和飲水。

1.2 儀器設(shè)備

Nanodrop 2000核酸蛋白定量儀（Thermo Fisher Scientific，美國）、移液器（Eppendorf，德國）、低溫高速離心機（Hitachi，日本）、CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）、MM400混合型球磨（Retsch，德國）。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 血清中皮質(zhì)醇（CORT）

冷暴露結(jié)束后，股動脈采血，制備血清，凍存于-80℃冰箱，使用豬皮質(zhì)醇（CORT）ELISA檢測試劑盒（mni.mAbs，美國）檢測CORT含量。

1.3.2 組織中miR-383表達量

冷暴露結(jié)束后，將仔豬乙醚麻醉后處死，取肺、小腸、肌肉（背最長?。?、腎、脾和肝組織置于-80℃保存。使用5 min RNA純化試劑盒（B0132，哈爾濱新?；驒z測有限公司）提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（D0401，哈爾濱新?；驒z測有限公司）制備cDNA。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司根據(jù)miRBase中登錄的豬miR-383和U6的基因序列進行設(shè)計和合成。miR-383的反轉(zhuǎn)錄引物和上游序列為：5′-CAGTTGGTCAGCAGTTCTTGG TAT-3′和5′-ACCTCCCACAGCACTGCC-3′；U6的反轉(zhuǎn)錄引物和上游序列為：5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′和5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。熒光定量檢測利用Fast DNA Probe qPCR Mix（A2301，哈爾濱新?；驒z測有限公司）。反轉(zhuǎn)錄參數(shù)如下：37℃、15 min，85℃、5 s。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，40個循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0進行單因素方差統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，采用t檢驗進行組間比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷暴露對仔豬CORT含量的影響（見圖1）

由圖1可知，斷奶仔豬血清CORT含量在冷暴露2 h后開始上升，但差異不顯著（P＞0.05）；冷暴露6 h CORT含量持續(xù)上升，極顯著高于對照組（P＜0.01）；冷暴露時間延長到12 h，CORT含量迅速回落，與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 冷暴露仔豬血清CORT含量的影響Fig.1 Effect of cold-exposed piglet serum CORT content

2.2 冷暴露對仔豬miR-383表達水平的影響（見圖2）

由圖2可知，冷暴露2 h后，肺和肌肉中miR-383表達量顯著降低（P＜0.05），肝和脾中則顯著升高（P＜0.05）；冷暴露6 h后，肌肉中miR-383表達量持續(xù)下降（P＜0.05），肝中繼續(xù)上升（P＜0.01），其他器官中miR-383表達量與對照組無顯著差異（P＞0.05），表明冷暴露對肌肉和肝臟中miR-383表達量的影響迅速且穩(wěn)定；冷暴露12 h后，miR-383表達量在小腸顯著上升（P＜0.05），在腎顯著下降（P＜0.05），脾顯著上升（P＜0.05），肝中仍表現(xiàn)為持續(xù)上升（P＜0.01），表明冷暴露對肝臟中miR-383表達量的影響較肌肉中更穩(wěn)定。由此可以推測，miR-383有可能成為冷應(yīng)激的臨床診斷標志物，尤其是在肝臟中。

圖2 冷暴露斷奶仔豬組織中miR-383相對表達量的影響Fig.2 Effect of relative expression of miR-383 in cold-exposed weaned piglets

3 討論

在本研究中，對30日齡斷奶仔豬進行冷暴露時采用的溫度是（4±2）℃，冷暴露時間分別設(shè)置為2、6、12 h。這一條件的選擇是利用了本實驗室在前期研究工作中建立的仔豬冷暴露模型。模型建立過程中檢測了冷暴露斷奶仔豬動脈血pH值、電解質(zhì)、血氣參數(shù)、多種血清激素，在這些指標檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上對仔豬機體內(nèi)環(huán)境是否處于穩(wěn)態(tài)進行綜合評價，最終篩選出適宜的冷暴露條件[9]。

在冷暴露條件下，仔豬多器官中miR-383表達量出現(xiàn)顯著變化，尤其是在肌肉和肝臟中，表明其參與了多器官的冷應(yīng)激反應(yīng)。有研究表明，在成纖維細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化過程中，miR-383水平的上升直接抑制LdhamRAN的表達[10]。Ldha在生物中普遍存在，表達產(chǎn)物為乳酸脫氫酶A，主要大量存在于肌肉組織中，實現(xiàn)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，通過促進糖酵解過程起到為肌肉組織迅速供能的作用。當動物處于低溫環(huán)境時，呼吸道黏膜和肢體末端的毛細血管發(fā)生收縮，從而影響呼吸和循環(huán)過程，進而引起血氧濃度下降。本試驗中，冷暴露仔豬肌肉中miR-383表達量下降，可靶向調(diào)控Ldha表達量上升，從而加速肌肉組織中丙酮酸的乳酸發(fā)酵過程，從而使糖酵解加強，迅速產(chǎn)能，以適應(yīng)寒冷環(huán)境。在肝臟中miR-383可抑制Pfkfb1的表達[11]，Pfkfb1能夠間接激活糖酵解關(guān)鍵酶PFK-1，因而仔豬冷暴露后，肝臟中miR-383表達量的上升抑制了糖酵解過程，同時可促進糖和脂肪的有氧氧化，從而適應(yīng)寒冷環(huán)境。

4 結(jié)論

本研結(jié)果表明，4℃冷暴露6 h可使仔豬處于急性冷應(yīng)激狀態(tài)。從miR-383表達量的角度分析，肺、肌肉、肝和脾對冷刺激響應(yīng)迅速（2 h），小腸和腎的響應(yīng)時間較長（12 h），急性冷暴露（2~12 h）可使仔豬肝臟中miR-383表達量持續(xù)顯著上升。