李玉杰 盛媛 魏秀麗 徐恩民 吳靜 劉娜 馬秀麗

摘 要：本研究測定了2020年以來本實(shí)驗(yàn)室從不同地區(qū)分離的44個(gè)IBV毒株的S1基因序列，并與參考株序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的44個(gè)IBV毒株共占據(jù)5個(gè)分支。其中：第一分支為QX型，包括25個(gè)分離株，QX型分離株又分為ClusterⅠ亞分支（7個(gè)）和ClusterⅡ亞分支（18個(gè)）;第二分支為4/91型，包括12個(gè)分離株;第三分支為LDT3型，包括3個(gè)分離株;第四分支為Mass型，包括2個(gè)分離株;第五分支為TW型，包括2個(gè)分離株。從毒株遺傳進(jìn)化分析結(jié)果可以看出，QX型仍是我國IBV流行的主要基因型。

關(guān)鍵詞：傳染性支氣管炎病毒;S1基因;遺傳變異;進(jìn)化變異

中圖分類號：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2021）6-0005-05

傳染性支氣管炎（IB）是雞的一種急性、高度接觸性的病毒性呼吸道疾病，在國內(nèi)流行甚廣。傳染性支氣管炎病毒（IBV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員之一，其基因組為單股線狀正鏈RNA，含有3種主要結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白S、膜蛋白M和核蛋白N。S1基因是IBV基因組中最易發(fā)生變異的部位，其編碼蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IBV特異的中和抗體和血凝抑制抗體，S1蛋白在進(jìn)化上比M蛋白和N蛋白都表現(xiàn)活躍，因此可不斷導(dǎo)致IBV新的血清型、亞型和變異株的產(chǎn)生，致使IBV疫苗免疫失敗，給雞傳染性支氣管炎的防制帶來新的困難。

由于傳染性支氣管炎病毒血清型和變異株眾多，各型之間無交叉反應(yīng)或交叉反應(yīng)差。因此，對于傳染性支氣管炎的防控，首先需明確當(dāng)?shù)亓餍袀魅拘灾夤苎椎难逍秃妥儺愔?。從分子水平揭示近年來IBV的變異情況以及不同毒株之間的進(jìn)化關(guān)系，對我國今后開展傳染性支氣管炎的監(jiān)測和綜合防控具有重要的指導(dǎo)意義。因此，本研究針對2020年以來從不同地區(qū)分離的44株IBV毒株進(jìn)行S1基因序列測定，比較分析了分離毒株的遺傳演化，明確流行的基因型與變異趨勢，對疫苗選擇和疾病防控具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 IBV毒株

2020年至今實(shí)驗(yàn)室分離保存的IBV毒株，詳細(xì)背景見表1。

1.2 RT-PCR擴(kuò)增、克隆與測序

按常規(guī)RT-PCR方法擴(kuò)增不同IBV毒株的S1基因。將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，鑒定為陽性的重組子送北京博尚有限公司完成測序。

1.3 S1基因序列分析

分別對測定的毒株進(jìn)行S1基因核苷酸序列分析，用Boot-strap法（Replication值為1000）計(jì)算遺傳距離并繪制N-J進(jìn)化樹，其中Bootstrap值小于50%的數(shù)值未顯示，分析當(dāng)前國內(nèi)IBV的流行情況及不同毒株核苷酸的變異程度。

2 結(jié)果

2.1 IBV S1基因的擴(kuò)增與克隆

利用自行設(shè)計(jì)的引物對分離毒株的RNA模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果分離毒株均能擴(kuò)增出1600 bp左右的目的片段，見圖1（只列出其中7個(gè)代表株）;將PCR產(chǎn)物純化后克隆至pMD18-T載體中，菌液PCR鑒定陽性的重組子送測序。

2.2 IBV S1基因的核苷酸序列相似性與遺傳進(jìn)化分析

通過對44個(gè)IBV分離株與代表毒株的S1基因測序分析發(fā)現(xiàn)，分離株共占據(jù)5個(gè)分支（圖2）。其中，第一分支為Mass型，包括2個(gè)分離株，與疫苗株的序列相似性為98.9%;第二分支為LDT3型，包括3個(gè)分離株，與LDT3毒株的序列相似性均為84.5%～95.5%;第三分支為TW型，包括2個(gè)分離株，與臺(tái)灣型代表毒株的序列相似性為82%～84.7%;第四分支為4/91型，包括12個(gè)分離株，與4/91毒株的序列相似性為89.1%～99.3%;第五分支為QX型，包括25個(gè)分離株，與QX毒株的序列相似性為90.9%～96.6%，QX型分離株又分為ClusterⅠ亞分支（7個(gè)）和ClusterⅡ亞分支（18個(gè)）。

3 討論與分析

本研究通過對2020年以來分離的44株傳染性支氣管炎病毒的測序分析，發(fā)現(xiàn)不同分離株之間序列相似性及遺傳進(jìn)化差異較大，提示我國IBV分離株S1基因在不斷進(jìn)化過程中已出現(xiàn)亞分支甚至更細(xì)分支，該特點(diǎn)對當(dāng)?shù)豂B的防控造成更大挑戰(zhàn)。

遺傳進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，QX型仍是我國IBV的主流基因型，約占56.8%。25株QX型毒株進(jìn)化為兩個(gè)亞分支，其中ClusterⅠ分離株與QX代表株在同一亞分支，ClusterⅡ分離株與經(jīng)典參考株LX4在同一亞支上，這可能與ClusterⅠ分支IBV S1基因的核苷酸發(fā)生了多個(gè)點(diǎn)突變有關(guān);其次是4/91型的IBV毒株，約占27.3%，LDT3分支毒株僅占6.8%。盡管有報(bào)道國內(nèi)臺(tái)灣型大陸分離株的分離率逐年升高[5-6]，但2020年以來本實(shí)驗(yàn)室僅分到2株TW型毒株，而且這兩個(gè)毒株均來源于江蘇地區(qū)，山東地區(qū)未分離到該型毒株，但應(yīng)引起大家對TW型毒株的重視。這兩個(gè)毒株的致病性有待進(jìn)一步深入研究。

由于不同的血清型之間交叉僅有部分或完全沒有交叉免疫保護(hù)，因此在免疫過傳染性支氣管炎疫苗的雞群中，仍然會(huì)出現(xiàn)免疫失敗現(xiàn)象，這可能與現(xiàn)有疫苗（H120、H52、Ma5、4/91、LDT3、

QX）的種類較多、疫苗搭配不合理導(dǎo)致疫苗基因型與分離株基因型不能完全匹配造成的。此外，弱毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)是能有效刺激肉雞的體液與細(xì)胞免疫，但病毒可在免疫雞群中持續(xù)存在，從而成為IBV重組變異的供體。因此，傳染性支氣管炎的防控應(yīng)優(yōu)先選用與當(dāng)?shù)亓餍谢蛐拖嘁恢碌囊呙?，這樣可以盡量減少本地區(qū)IBV重組變異的概率。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cavanagh D. Coronavirus avian infectious bronchitis virus[J]. Vet. Res，2007， 38： 281-297.

[2] Zhao Y， Zhang H， Zhao J，et al. Evolution of infectious bronchitis virus in China over the past two decades[J]. J. Gen. Virol，2016，97： 1566-1574.

[3] Xu G， Liu XY， Zhao Y，et al. Characterization and analysis of an infectious bronchitis virus strain isolated from southern China in 2013[J]. Virol. J，2016， 13： 1-9.

[4] 陳彤，劉金，封柯宇，等. 2016～2017年廣西雞傳染性支氣管炎病毒S1基因進(jìn)化分析[J].中國家禽，2019，41（12）：22-25。

[5] Zhao Y， Zhang H， Zhao J， et al. Evolution of infectious bronchitis virus in China over the past two decades[J]. J. Gen. Virol，2016，97： 1566-1574.

[6] Xu G，Liu XY，Zhao Y，et al. Characterization and analysis of an infectious bronchitis virus strain isolated from southern China in 2013[J]. Virol. J，2016，13： 1-9.