李玉杰 盛媛 魏秀麗 徐恩民 吳靜 劉娜 馬秀麗

摘 要：本研究測定了2020年以來本實驗室從不同地區(qū)分離的44個IBV毒株的S1基因序列，并與參考株序列進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn)分離的44個IBV毒株共占據(jù)5個分支。其中：第一分支為QX型，包括25個分離株，QX型分離株又分為ClusterⅠ亞分支（7個）和ClusterⅡ亞分支（18個）;第二分支為4/91型，包括12個分離株;第三分支為LDT3型，包括3個分離株;第四分支為Mass型，包括2個分離株;第五分支為TW型，包括2個分離株。從毒株遺傳進化分析結果可以看出，QX型仍是我國IBV流行的主要基因型。

關鍵詞：傳染性支氣管炎病毒;S1基因;遺傳變異;進化變異

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B文章編號：1673-1085（2021）6-0005-05

傳染性支氣管炎（IB）是雞的一種急性、高度接觸性的病毒性呼吸道疾病，在國內(nèi)流行甚廣。傳染性支氣管炎病毒（IBV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員之一，其基因組為單股線狀正鏈RNA，含有3種主要結構蛋白，即纖突蛋白S、膜蛋白M和核蛋白N。S1基因是IBV基因組中最易發(fā)生變異的部位，其編碼蛋白可誘導機體產(chǎn)生IBV特異的中和抗體和血凝抑制抗體，S1蛋白在進化上比M蛋白和N蛋白都表現(xiàn)活躍，因此可不斷導致IBV新的血清型、亞型和變異株的產(chǎn)生，致使IBV疫苗免疫失敗，給雞傳染性支氣管炎的防制帶來新的困難。

由于傳染性支氣管炎病毒血清型和變異株眾多，各型之間無交叉反應或交叉反應差。因此，對于傳染性支氣管炎的防控，首先需明確當?shù)亓餍袀魅拘灾夤苎椎难逍秃妥儺愔辍姆肿铀浇沂窘陙鞩BV的變異情況以及不同毒株之間的進化關系，對我國今后開展傳染性支氣管炎的監(jiān)測和綜合防控具有重要的指導意義。因此，本研究針對2020年以來從不同地區(qū)分離的44株IBV毒株進行S1基因序列測定，比較分析了分離毒株的遺傳演化，明確流行的基因型與變異趨勢，對疫苗選擇和疾病防控具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 IBV毒株

2020年至今實驗室分離保存的IBV毒株，詳細背景見表1。

1.2 RT-PCR擴增、克隆與測序

按常規(guī)RT-PCR方法擴增不同IBV毒株的S1基因。將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，鑒定為陽性的重組子送北京博尚有限公司完成測序。

1.3 S1基因序列分析

分別對測定的毒株進行S1基因核苷酸序列分析，用Boot-strap法（Replication值為1000）計算遺傳距離并繪制N-J進化樹，其中Bootstrap值小于50%的數(shù)值未顯示，分析當前國內(nèi)IBV的流行情況及不同毒株核苷酸的變異程度。

2 結果

2.1 IBV S1基因的擴增與克隆

利用自行設計的引物對分離毒株的RNA模板進行RT-PCR擴增，結果分離毒株均能擴增出1600 bp左右的目的片段，見圖1（只列出其中7個代表株）;將PCR產(chǎn)物純化后克隆至pMD18-T載體中，菌液PCR鑒定陽性的重組子送測序。

2.2 IBV S1基因的核苷酸序列相似性與遺傳進化分析

通過對44個IBV分離株與代表毒株的S1基因測序分析發(fā)現(xiàn)，分離株共占據(jù)5個分支（圖2）。其中，第一分支為Mass型，包括2個分離株，與疫苗株的序列相似性為98.9%;第二分支為LDT3型，包括3個分離株，與LDT3毒株的序列相似性均為84.5%～95.5%;第三分支為TW型，包括2個分離株，與臺灣型代表毒株的序列相似性為82%～84.7%;第四分支為4/91型，包括12個分離株，與4/91毒株的序列相似性為89.1%～99.3%;第五分支為QX型，包括25個分離株，與QX毒株的序列相似性為90.9%～96.6%，QX型分離株又分為ClusterⅠ亞分支（7個）和ClusterⅡ亞分支（18個）。

3 討論與分析

本研究通過對2020年以來分離的44株傳染性支氣管炎病毒的測序分析，發(fā)現(xiàn)不同分離株之間序列相似性及遺傳進化差異較大，提示我國IBV分離株S1基因在不斷進化過程中已出現(xiàn)亞分支甚至更細分支，該特點對當?shù)豂B的防控造成更大挑戰(zhàn)。

遺傳進化關系分析發(fā)現(xiàn)，QX型仍是我國IBV的主流基因型，約占56.8%。25株QX型毒株進化為兩個亞分支，其中ClusterⅠ分離株與QX代表株在同一亞分支，ClusterⅡ分離株與經(jīng)典參考株LX4在同一亞支上，這可能與ClusterⅠ分支IBV S1基因的核苷酸發(fā)生了多個點突變有關;其次是4/91型的IBV毒株，約占27.3%，LDT3分支毒株僅占6.8%。盡管有報道國內(nèi)臺灣型大陸分離株的分離率逐年升高[5-6]，但2020年以來本實驗室僅分到2株TW型毒株，而且這兩個毒株均來源于江蘇地區(qū)，山東地區(qū)未分離到該型毒株，但應引起大家對TW型毒株的重視。這兩個毒株的致病性有待進一步深入研究。

由于不同的血清型之間交叉僅有部分或完全沒有交叉免疫保護，因此在免疫過傳染性支氣管炎疫苗的雞群中，仍然會出現(xiàn)免疫失敗現(xiàn)象，這可能與現(xiàn)有疫苗（H120、H52、Ma5、4/91、LDT3、

QX）的種類較多、疫苗搭配不合理導致疫苗基因型與分離株基因型不能完全匹配造成的。此外，弱毒疫苗的優(yōu)點是能有效刺激肉雞的體液與細胞免疫，但病毒可在免疫雞群中持續(xù)存在，從而成為IBV重組變異的供體。因此，傳染性支氣管炎的防控應優(yōu)先選用與當?shù)亓餍谢蛐拖嘁恢碌囊呙?，這樣可以盡量減少本地區(qū)IBV重組變異的概率。

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