段雅婕 陳經(jīng)燁 陳晶晶

摘? 要：以威廉斯香蕉（Musa spp. AAA group）‘8818及其突變體‘8818-1的假莖為試材，同源克隆MaGA20ox4和MaGA20ox5基因的gDNA及啟動(dòng)子序列，比較它們?cè)诨蚪M測(cè)序品種以及‘8818和‘8818-1中的序列差異。序列比對(duì)結(jié)果表明：MaGA20ox4和MaGA20ox5基因的gDNA相似性達(dá)93.82%，而二者的啟動(dòng)子序列相似性僅有40%，威廉斯品種與基因組測(cè)序品種間MaGA20ox4和MaGA20ox5基因無論gDNA還是啟動(dòng)子序列均存在較大差異，特別是啟動(dòng)子序列。威廉斯‘8818和‘8818-1間MaGA20ox4基因gDNA也存在一定的堿基序列差異，但啟動(dòng)子序列基本相同，MaGA20ox5結(jié)果同MaGA20ox4類似。啟動(dòng)子分析推測(cè)2個(gè)基因的啟動(dòng)子屬于誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，存在較多光響應(yīng)和激素響應(yīng)元件。進(jìn)一步構(gòu)建了MaGA20ox4和MaGA20ox5的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體，定位結(jié)果顯示，MaGA20ox4和MaGA20ox5蛋白均定位于細(xì)胞核上，可能定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。在不同品種香蕉果實(shí)的不同發(fā)育時(shí)期qRT-PCR結(jié)果表明，MaGA20ox4和MaGA20ox5具有品種特異性，在威廉斯香蕉品種果實(shí)中可能不是主要的赤霉素合成調(diào)控基因。

關(guān)鍵詞：香蕉;赤霉素20氧化酶;基因克隆;亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：S668.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning， Expression and Subcellular Localization Analysis of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 Gene from Banana

DUAN Yajie， CHEN Jingye， CHEN Jingjing^*

Institute of South Subtropical Crop Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / National Field Genebank for Tropical Fruit / Key Laboratory of Hainan Province for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： Using the false stem of Musa spp. AAA Group ‘8818 and its mutant ‘8818-1 as the materials， the gDNA and promoter sequences of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 genes were cloned homogeneously， and the sequence differences in the genome-sequencing variety， ‘8818 and ‘8818-1 were compared. The results of sequence alignment showed that the gDNA similarity of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 genes reached 93.82%， while the promoter sequence similarity of the two genes was only 40%. There were large differences in gDNA and promoter sequences of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 genes between Williams varieties and genome-sequencing variety， especially the promoter sequence. The gDNA of MaGA20ox4 gene of Williams ‘8818 and ‘8818-1 also had difference in base sequence， but the promoter sequence was basically the same， and the result of MaGA20ox5 was similar to MaGA20ox4. Promoter analysis suggested that the promoters of the two genes belonged to inducible promoters， and there were more light response and hormone response elements. The subcellular localization vectors of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 were further constructed. The localization results showed that MaGA20ox4 and MaGA20ox5 proteins were localized on the nucleus and might be localized on the cell membrane or cytoplasm. Quantitative RT-PCR results at different developmental stages of different banana fruits showed that MaGA20ox4 and MaGA20ox5 were species-specific， and may not be the main gene regulating gibberellin synthesis in Williams banana fruits.

Keywords： banana; GA20ox; gene clone; subcellular localization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.001

赤霉素（GA）作為調(diào)控植物發(fā)育的重要激素，最明顯的生理作用是促進(jìn)伸長，但不增加節(jié)間^[1]。赤霉素氧化酶是調(diào)控赤霉素代謝的關(guān)鍵酶，其中GA-20氧化酶（GA20ox）和GA3氧化酶（GA3ox）能將GA₁₂和GA₅₃催化合成有活性的GA₁和GA₄;而GA2氧化酶（GA2ox）能通過β-羥基化作用將活性GA₁和GA₄催化形成無活性的GA₈和GA₃₄，這些關(guān)鍵基因的表達(dá)同時(shí)受到活性赤霉素的反饋和前饋調(diào)節(jié)^[1-3]。赤霉素氧化酶屬于多基因家族，研究發(fā)現(xiàn)，水稻中存在8個(gè)GA20ox、2個(gè)GA3ox、11個(gè)GA2ox基因;擬南芥中存在5個(gè)GA20ox、4個(gè)GA3ox、8個(gè)GA2ox基因;大豆中存在8個(gè)GA20ox、6個(gè)GA3ox、10個(gè)GA2ox基因^[4]。赤霉素氧化酶基因家族一般可分為GA20ox、GA3ox、C19-GA2ox、C20-GA2ox 4個(gè)亞類^[3-5]，但近年來通過進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)有些基因不屬于上面4個(gè)亞類，Huang等^[3]提出了增加GAox-A、GAox-B、GAox-C和GAox-D 4個(gè)亞類的劃分，例如水稻OsGA20ox5、OsGA20ox6、OsGA20ox7和OsGA20ox8分別屬于這4類。對(duì)于GA20ox、GA3ox、C19-GA2ox、C20-GA2ox 4個(gè)亞類中的基因，均具有赤霉素氧化酶基因典型功能的特征，如GA20ox和GA3ox催化合成活性赤霉素，GA2ox降解活性赤霉素為無活性的形式，并且這4類基因的功能研究最多，其中與調(diào)控株高最相關(guān)的赤霉素基因在這4類基因中都有研究，而對(duì)于GAox-A、GAox-B、GAox-C、GAox-D等4個(gè)亞類的基因還沒有很多的研究，對(duì)于其明確的基因功能還沒有相關(guān)的研究報(bào)道。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)香蕉威廉斯矮化突變體（8818-1）大部分器官中的GA含量均低于親本（8818）的水平，且含量差異較大;用不同濃度的GA₃對(duì)8818-1植株進(jìn)行外源噴施處理，發(fā)現(xiàn)外源的GA₃處理后對(duì)突變體8818-1株高有明顯恢復(fù)作用，因此推測(cè)8818-1的矮化是由赤霉素含量降低引起^[5-6]。在香蕉A基因組^[7]查找了赤霉素所有合成代謝的基因，經(jīng)同源進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)了10個(gè)GA20ox-like （MaGA20ox 1-10）、4個(gè)GA3ox-like （MaGA3ox1-3）、14個(gè)GA2ox-like （MaGA2ox1-15）基因，并篩選出了在假莖中起主要調(diào)節(jié)作用的赤霉素氧化酶基因?yàn)?em>MaGA20ox基因家族的MaGA20ox4、MaGA20ox5、MaGA20ox7和MaGA2ox基因家族的MaGA2ox7、MaGA2ox12、MaGA2ox14^[5]。其中在假莖中明顯差異表達(dá)的MaGA20ox4、MaGA20ox5和OsGA20ox5聚為一類，屬于GAox-A亞類^[5]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過qRT-PCR方法分析這2個(gè)基因MaGA20ox4和MaGA20ox5在不同香蕉品種果實(shí)發(fā)育不同階段的表達(dá)模式，并克隆其在親本和突變體中g(shù)DNA序列和啟動(dòng)子，分析其表達(dá)差異是否是突變體堿基序列存在突變引起，或是啟動(dòng)子元件存在差異導(dǎo)致。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實(shí)驗(yàn)材料? 4個(gè)香蕉品種威廉斯香蕉‘8818（‘8818，AAA）、突變體‘8818-1（‘8818-1，AAA）、巴西香蕉（‘BX，AAA）、貢蕉（‘GJ，AA）由本研究室提供，成年植株種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所香蕉種質(zhì)資源圃。果實(shí)取樣：取同一生長時(shí)期的4個(gè)香蕉品種果實(shí)發(fā)育的3個(gè)不同生長階段，即極幼果、幼果、七分熟果的果肉為材料。同時(shí)取‘8818和‘8818-112葉期的假莖部位作為克隆基因的材料。取樣后放?80?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2? 試劑 ?RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒、DH5α感受態(tài)大腸桿菌，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化（北京）有限公司;Qiagen植物DNA提取試劑盒購自北京綠源伯德生物科技有限公司;pMD19-T克隆載體、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit和PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser），LA Taq、dNTPs、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司;Dynamo Color Flash SYBR Green qPCR Kit（Thermo Fisher）購自廣州賽哲生物公司;內(nèi)切酶AarI和BsaI購自廣州萃本生物科技有限公司;酵母提取物、蛋白胨、瓊脂糖、IPTG、X-Gal、氨芐青霉素等從上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司購買。

1.2 方法

1.2.1? 香蕉MaGA20ox4和MaGA20ox5gDNA和啟動(dòng)子克隆? 參照Qiagen植物DNA提取試劑盒（DNeasy plant）的方法，提取威廉斯香蕉‘8818和‘8818-1假莖DNA。

在香蕉A基因數(shù)據(jù)庫中下載小果野蕉（Musa acuminata，DH Pahang，AA）MaGA20ox4（GSMUA_Achr7T08230_001）和MaGA20ox5（GSMUA_Achr7T08240_001）的基因序列（包含內(nèi)含子區(qū)和UTRs區(qū)），設(shè)計(jì)gDNA全長和啟動(dòng)子同源克隆的上下游引物（表1）。PCR模板為‘8818和‘8818-1假莖DNA，體系為25?μL（DNA 1?μL;上下引物各1?μL;dNTPs 0.5?μL;ddH₂O 18.80?μL;Buffer 2.5?μL;LATaq0.2?μL）。擴(kuò)增參數(shù)為：95?℃預(yù)變性4?min;95?℃變性40?s，50?℃退火40?s，72?℃延伸2?min，35個(gè)循環(huán);72?℃延伸7?min。最后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，產(chǎn)物純化后連接pMD-19T載體，陽性菌液送公司測(cè)序。

1.2.2? 基因序列的生物信息學(xué)分析? 將測(cè)序結(jié)果拼接獲得MaGA20ox4和MaGA20ox5基因gDNA和上游啟動(dòng)子序列，利用DNAMAN（Ver. 6.0.3.99）軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用NCBI中的BLAST（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/）對(duì)MaGA20ox4和MaGA20ox5蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析;利用PlantCARE軟件（http：//bioinfor?matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析。

1.2.3 ?亞細(xì)胞定位分析 ?表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定：根據(jù)MaGA20ox4和MaGA20ox5的ORF設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物（表1），以MaGA20ox4和MaGA20ox5基因開放閱讀框（ORF）正確的克隆產(chǎn)物提取質(zhì)粒，基因用AarI進(jìn)行酶切，載體用BsaI進(jìn)行酶切，用T₄DNA連接酶連接到pBWA（V） HS-ccdb-GLosgfp載體上，將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切篩選和測(cè)序驗(yàn)證正確后，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒，獲得GFP與目的基因的融合表達(dá)載體pBWA（V） HS-MaGA20ox4-GLosgfp和pBWA（V）HS-MaGA?? 20ox5-GLosgfp。

煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化及激光共聚焦顯微觀察：將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，30?℃培養(yǎng)2?d;將農(nóng)桿菌從固體接于10?mL YEB液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，懸浮液重懸菌體，調(diào)OD₆₀₀至0.6左右;注射煙草下表皮，弱光培養(yǎng)2?d，取標(biāo)記的農(nóng)桿菌注射的煙草葉片制作成玻片，用Nikon C2-ER激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4? 香蕉MaGA20ox4和MaGA20ox5基因在果實(shí)中的表達(dá)分析? 參照RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒中的方法，提取‘8818和‘8818-1不同品種香蕉果實(shí)中總RNA。采用TaKaRa公司PrimeScript?RT reagent Kit（用于基因克?。┖蚉rimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（用于qRT-PCR）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照其說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。

采用SYBR Green I染料法，利用熒光定量qRT-PCR探討MaGA20ox4和MaGA20ox5基因在果實(shí)中的表達(dá)情況。根據(jù)克隆獲得的香蕉MaGA20ox4和MaGA20ox5 CDS序列，在二者序列不一致區(qū)域設(shè)計(jì)定量引物（表1）。內(nèi)參為Actin（AB022041）。qRT-PCR反應(yīng)體系為：2×DyNAmo color Flash SYBR Green master mix 10?μL、模板cDNA 0.5?μL，上下游引物各0.6?μL，ddH₂O補(bǔ)至20?μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5?℃ 5?min;95?℃ 10?s，58?℃ 20?s，72?℃ 25?s（real time 熒光采集），40個(gè)循環(huán);95?℃ 5?s，65?℃ 1?min，97?℃（熒光采集結(jié)束），40?℃ 30?s（冷卻）。每個(gè)樣品在同一板中重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2 ?結(jié)果與分析

2.1? MaGA20ox4和MaGA20ox5 gDNA序列差異及保守結(jié)構(gòu)域分析

MaGA20ox4基因CDS區(qū)包含1077?bp，外顯子加內(nèi)含子的gDNA序列有1223?bp。同源克隆‘8118和‘8818-1中MaGA20ox4gDNA序列。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖1），三者MaGA20ox4gDNA序列長度一致，其中‘8818和‘8818-1MaGA20ox4gDNA序列有13處堿基序列不一致，小果野蕉核苷酸序列與‘8818有27處，與‘8818-1有21處不一致，與‘8818和‘8818-1均不一致堿基序列有16處。

MaGA20ox5基因CDS區(qū)包含1057?bp，外顯子加內(nèi)含子的gDNA序列有1205?bp。同源克隆‘8818和‘8818-1中MaGA20ox5gDNA序列，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖2），‘8818和‘8818-1MaGA20ox5序列有5處堿基序列不一致;小果野蕉核苷酸序列與‘8818有8處，與‘8818-1有8處不一致，與‘8818和‘8818-1均不一致序列有6處。

對(duì)MaGA20ox4和MaGA20ox5gDNA核苷酸序列進(jìn)行比較，二者cDNA序列相似性93.41%，gDNA序列相似性93.82%。前期對(duì)香蕉赤霉素氧化酶基因家族進(jìn)行進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，MaGA20ox4，

MaGA20ox5和水稻OsGA20ox5聚為一類，屬于GAox-A亞類^[5]。在NCBI上進(jìn)行MaGA20ox4、MaGA20ox5和OsGA20ox5蛋白結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)三者均有3個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖3），包括2-酮戊二酸作為輔因子的含非血紅素鐵的氧化酶超家族（2OG-Fe（II） oxygenase superfamily），PLN02750（oxidoreductase， 2OG-Fe（II） oxygenase family protein，2-酮戊二酸作為輔因子的含非血紅素鐵的氧化酶家族蛋白），次級(jí)代謝合成相關(guān)的PcbC（Isopenicillin N synthase and related dioxygenases）。像OsGA20ox5蛋白一樣，MaGA20ox4和MaGA20ox5均不具有典型赤霉素氧化酶基因與底物結(jié)合的的LPWKET基元，在分類上屬于GAox-A亞類^{[3， 5]}，而對(duì)于這類赤霉素氧化酶基因的功能尚需要明確。

2.2? MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動(dòng)子序列和順式作用元件分析

根據(jù)小果野蕉GA20ox4基因啟動(dòng)子序列同源克隆‘8818和‘8818-1MaGA20ox4啟動(dòng)子1574?bp。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)‘8818和‘8818-1之間有1處堿基序列不一致;小果野蕉基因組測(cè)序序列與‘8818和‘8818-1有25處1～2個(gè)堿基不一致，4處超過6個(gè)堿基不一致，其中2處超過80個(gè)堿基不一致。小果野蕉與威廉斯品種GA20ox4啟動(dòng)子堿基序列差異較大，而‘8818和‘8818-1間差異很小（圖4）。同源克隆MaGA20ox5啟動(dòng)子1585?bp，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)‘8818和‘8818-1啟動(dòng)子序列有3處堿基不一致;小果野蕉基因組測(cè)序序列與‘8818有29處，與‘8818-1有30處堿基序列不一致;小果野蕉與‘8818‘8818-1均不一致堿基序列28處（圖5）。比較MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)二者的啟動(dòng)子序列相似性僅有40%。

經(jīng)植物啟動(dòng)子元件分析軟件PlantCARE預(yù)測(cè)，MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動(dòng)子均存在大量順式作用元件，結(jié)果見表2。MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動(dòng)子序列都存在核心元件TATA-box和增強(qiáng)元件CAAT-box，符合真核生物基因啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)特征。在小果野蕉和威廉斯2個(gè)品種中，MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動(dòng)子中的TATA-box和CAAT-box的數(shù)量并不完全一致，但是威廉斯‘8818和‘8818-1中TATA-box和CAAT-box數(shù)量一樣。MaGA20ox4中CAAT-box在‘8818和‘8818-1中比小果野蕉中多4個(gè)，MaGA20ox5中CAAT-box在‘8818和‘8818-1中比小果野蕉中多1個(gè)。

除基本的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)元件外，MaGA20ox4和MaGA20ox5基因啟動(dòng)子中還存光調(diào)控元件、激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件和其他響應(yīng)元件。其他響應(yīng)元件包括晝夜節(jié)律、MYB結(jié)合位點(diǎn)、MYC結(jié)合位點(diǎn)、胚乳表達(dá)順式作用元件等。在光調(diào)控元件中，2個(gè)品種中的MaGA20ox4啟動(dòng)子中都含有Box 4、Box II、GATA-motif、TCT-motifG-box、GT1-motif元件。AE-box存在小果野蕉中，在威廉斯中不存在;ACE只存在威廉斯中，在小果野蕉中不存在。2個(gè)品種中的MaGA20ox5啟動(dòng)子中都含有Box 4、I-box、G-box、GATA-motif、TCT-motif，小果野蕉中存在L-box，而威廉斯中不存在。在激素響應(yīng)元件中，2個(gè)品種的MaGA20ox4啟動(dòng)子都含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif、TGACG-motif;赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif;脫落酸響應(yīng)元件ABRE、乙烯響應(yīng)元件ERE;小果野蕉中存在生長素響應(yīng)元件 TGA-element，威廉斯‘8818-1中存在水楊酸響應(yīng)元件TCA-element。MaGA20ox5啟動(dòng)子僅含有茉莉酸甲酯、脫落酸以及乙烯響應(yīng)元件，其中威廉斯品種還含有水楊酸相應(yīng)元件。在脅迫誘導(dǎo)元件中，2個(gè)品種的MaGA20ox4啟動(dòng)子均存在厭氧誘導(dǎo)作用元件和響應(yīng)干旱調(diào)控的MYB結(jié)合位點(diǎn)。MaGA20ox5啟動(dòng)子存在厭氧誘導(dǎo)作用元件和抗病及脅迫誘導(dǎo)順式作用元件。除了基本啟動(dòng)子元件外，不同品種間均有的元件數(shù)量一致。

綜上分析認(rèn)為MaGA20ox4和MaGA20ox5基因啟動(dòng)子具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子特征，存著大量光響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件，推測(cè)其受光誘導(dǎo)及激素誘導(dǎo)的可能性較大。而二者啟動(dòng)元件數(shù)量和種類的不同暗示可能存在不同的誘導(dǎo)響應(yīng)模式。

2.3? MaGA20ox4和MaGA20ox5亞細(xì)胞定位分析

將構(gòu)建的植物融合表達(dá)載體pBWA（V）HS- MaGA20ox4-GLosgfp，pBWA（V）HS-MaGA20ox5- GLosgfp和空載體pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，注射煙草下表皮，弱光培養(yǎng)2?d，取標(biāo)記的農(nóng)桿菌注射的煙草葉片制作成玻片，在激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光信號(hào)的分布。結(jié)果顯示：MaGA20ox4-GFP融合蛋白（圖6A～圖6D）及帶有GFP的空載（圖6E～圖6H）在煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞核中均有表達(dá)，另外在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中可能有表達(dá)，因煙草細(xì)胞質(zhì)緊挨細(xì)胞膜，如果明確區(qū)分2個(gè)蛋白的是否細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)定位，還需進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的共定位分析。與MaGA20ox4蛋白類似，蛋白MaGA20ox5- GFP和帶有GFP的空載在煙草葉片的細(xì)胞核中均有表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中可能有表達(dá)（圖7）。表明MaGA20ox4和MaGA20ox5編碼的蛋白均確定定位在胞核上，是否定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜需要進(jìn)一步確定。

2.4? MaGA20ox4和MaGA20ox5在果實(shí)中的表達(dá)分析

除了‘8818和‘8818-1，選取具有A基因組的巴西香蕉（‘BX）及貢蕉（‘GJ），分析MaGA20ox4基因在果實(shí)發(fā)育的3個(gè)不同時(shí)期（圖 <！--[if gte vml 1]> <！[endif]--><！--[if ！vml]--><！--[endif]-->8A）的表達(dá)模式，4種香蕉果指長度比較為‘BX≥‘8818>‘8818-1>‘GJ，其中‘GJ以其果指短為主要特點(diǎn)，‘8818-1果指也明顯低于親本‘8818。

結(jié)果如8B所示，除了‘BX，MaGA20ox4在‘GJ‘8818和‘8818-1果實(shí)從小到大3個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，MaGA20ox4在極幼果期表達(dá)量最高;而在‘BX中，在幼果和七分熟果中的表達(dá)量高于極幼果;整體而言，MaGA20ox4在‘GJ中的表達(dá)量最高，而在‘8818-1中的表達(dá)量最低。MaGA20ox5在‘BX‘GJ和‘8818中基本呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，同樣在極幼果期表達(dá)量最高。而在‘8818-1中呈現(xiàn)波動(dòng)表達(dá)，表達(dá)量低于‘BX‘GJ和‘8818的極幼果時(shí)期。MaGA20ox5基因在4種香蕉果實(shí)中的整體表達(dá)量均高于MaGA20ox4。以上結(jié)果表明MaGA20ox4和MaGA20ox5的表達(dá)不僅存在品種差異，在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期也存在差異，暗示其可能與MaGA20ox4和MaGA20ox5基因家族其他成員一起協(xié)同調(diào)控果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的赤霉素含量，其中MaGA20ox5的調(diào)控作用可能強(qiáng)于MaGA20ox4。在‘GJ果實(shí)發(fā)育過程中MaGA20ox4、MaGA20ox5或許是起主要作用的MaGA20ox基因。

而對(duì)比MaGA20ox4和MaGA20ox5在‘8818和‘8818-1中的表達(dá)，MaGA20ox4在‘8818-1中整體表達(dá)低于‘8818，MaGA20ox5在‘8818-1中的表達(dá)低于‘8818的極幼果時(shí)期，結(jié)合前期研究，在威廉斯香蕉果實(shí)的幼果中MaGA20ox3表達(dá)量最高，MaGA20ox4、MaGA20ox9、MaGA20ox6表達(dá)量其次^[5]，表明MaGA20ox4、MaGA20ox5可能協(xié)同其他MaGA20ox一起發(fā)揮作用，或許不是威廉斯香蕉果實(shí)中主要MaGA20ox基因。而前期對(duì)MaGA20ox基因家族在假莖中的表達(dá)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)MaGA20ox4在威廉斯香蕉假莖中表達(dá)量最高，其中‘8818-1假莖中的表達(dá)也明顯低于‘8818^[5]，結(jié)合2個(gè)結(jié)果分析本研究認(rèn)為MaGA20ox4在‘8818和‘8818-1果實(shí)和假莖表達(dá)中存在差異，其中MaGA20ox4是威廉斯香蕉假莖中起主要作用的MaGA20ox，可能是造成‘8818和‘8818-1假莖中赤霉素含量差異的原因;而在果實(shí)中MaGA20ox4可能參與了果實(shí)赤霉素含量的調(diào)控，但可能不是主要的基因。

3 ?討論

MaGA20ox 4和MaGA20ox 5基因在同源進(jìn)化分析上與水稻OsGA20ox5基因聚為一類，屬于新劃分的GAox-A亞類，不同于傳統(tǒng)分類GA20ox、GA3ox、C19-GA2ox、C20-GA2ox均具有赤霉素氧化酶基因典型功能的特征，GAox-A亞類的功能尚未明確。本研究對(duì)威廉斯香蕉‘8818和‘8818-1中MaGA20ox 4和MaGA20ox 5的gDNA和啟動(dòng)子序列進(jìn)行了克隆，與香蕉基因組測(cè)序序列進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)威廉斯品種與測(cè)序品種小果野蕉的MaGA20ox 4和MaGA20ox 5 gDNA序列有16處和6處堿基位點(diǎn)不一致，說明這2個(gè)基因在品種間存在著多態(tài)性。相對(duì)于gDNA，2個(gè)基因的啟動(dòng)子與基因組測(cè)序品種的啟動(dòng)子差異更大，特別是MaGA20ox 4基因的啟動(dòng)子，這種差異可能是基因組進(jìn)化的結(jié)果，不同品種間赤霉素氧化酶基因家族成員在進(jìn)化過程中功能逐漸進(jìn)行了區(qū)分。而對(duì)于威廉斯‘8818和其突變體‘8818-1間MaGA20ox 4和MaGA20ox 5 gDNA序列分別有13個(gè)和5堿基與基因組測(cè)序序列不一致，2個(gè)基因的啟動(dòng)子在‘8818和‘8818-1中基本一致，表明EMS誘變可能導(dǎo)致了這2個(gè)基因部分堿基在‘8818-1中發(fā)生了改變，這些改變有沒有影響其蛋白功能還未知，但是影響了其在‘8818和‘8818-1的表達(dá)量。其中MaGA20ox?4基因無論是品種間還是親本和突變體間變異最大，根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)MaGA20ox 4可能是造成‘8818和‘8818-1突變體中赤霉素含量差異的主要基因^[5]，推測(cè)其序列變異可能改變了其表達(dá)調(diào)控。啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)基因的光調(diào)控元件較多，許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明光質(zhì)和光周期可以調(diào)節(jié)GA的生物合成和代謝^[8-10]。在長日照下菠菜的GA20氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平高于短日照下的，當(dāng)擬南芥從短日照轉(zhuǎn)到長日照后，其GA20氧化酶活性增加^[11-12]，說明這2個(gè)基因可能也受光的調(diào)控。

典型的赤霉素氧化酶，如GA20ox和GA3ox催化合成活性赤霉素，GA2ox降解活性赤霉素為無活性的形式，其與赤霉素含量密切相關(guān)，其中與調(diào)控株高最相關(guān)的赤霉素基因在這4類基因中都有研究，擬南芥5個(gè)AtGA20ox基因均屬于GA20ox，研究發(fā)現(xiàn)AtGA20ox1在對(duì)株高的影響上起主要作用^[13-14];水稻中，OsGA20ox2與株高密切相關(guān)^[15-16]。而對(duì)GAox-A、GAox-B、GAox-C、GAox-D這4個(gè)亞類的赤霉素氧化酶基因功能尚未明確。在香蕉中，通過前期篩選得到在假莖中起主要調(diào)節(jié)作用的赤霉素氧化酶基因?yàn)?em>MaGA20ox基因家族的MaGA20ox4、MaGA20ox5，進(jìn)一步對(duì)其在不同品種果實(shí)中的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)基因均存在品種表達(dá)差異，均在極幼果期表達(dá)量最高，這與幼果期果實(shí)生長發(fā)育快速的事實(shí)相符，而隨后的表達(dá)量變化與其在不同品種間發(fā)揮作用的模式相關(guān)。結(jié)合在不同品種間的表達(dá)量以及MaGA20ox基因家族在威廉斯香蕉果實(shí)中的表達(dá)分析^[5]，MaGA20ox4和MaGA20ox5可能不是果實(shí)中主要的MaGA20ox基因。前期研究發(fā)現(xiàn)，MaGA2ox 12在‘8818和‘8818-1幼果中差異明顯，其可能是果指中調(diào)控赤霉素含量的主要基因^[5]。

在香蕉生產(chǎn)中，為了操作便利、防風(fēng)等的需求，需要矮化香蕉品種，而矮化香蕉品種往往果指較短，影響了其商品性，因此得到假莖矮化而果指不變短的香蕉品種是生產(chǎn)上需求的，因此選取在假莖中起主要調(diào)控作用，而在果實(shí)中不起主要作用的赤霉素氧化酶基因是我們的目標(biāo)，綜上分析MaGA20ox4和MaGA20ox5，特別是MaGA20ox4符合此特點(diǎn)，這為后續(xù)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

<！--[if ！supportLists]-->[1]?????? <！--[endif]-->Yang Y H， Zhang F M， Ge S. Evolutionary rate patterns of the gibberellin pathway genes[J]. BMC Evolutionary Biology， 2009， 9： 206.

<！--[if ！supportLists]-->[2]?????? <！--[endif]-->岳? 川， 曾建明， 曹紅利， 等. 高等植物赤霉素代謝及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2012， 48（2）： 118-128.

<！--[if ！supportLists]-->[3]?????? <！--[endif]-->Huang Y，Wang X，Ge S， et al. Divergence and adaptive evolution of the gibberellin oxidase genes in plants[J]. BMC Evolutionary Biology， 2015， 15： 207.

<！--[if ！supportLists]-->[4]?????? <！--[endif]-->Han F， Zhu B. Evolutionary analysis of three gibberellin oxidase genes in rice，Arabidopsis， and soybean[J]. Gene， 2011， 473（1）： 23-35.

<！--[if ！supportLists]-->[5]?????? <！--[endif]-->Chen J J， Xie J H， Duan Y J. Genome-wide identification and expression profiling reveal tissue-specific expression and differentially-regulated genes involved in gibberellin metabolism between Williams banana and its dwarf mutant[J]. BMC Plant Biology， 2016， 16（1）： 123.

<！--[if ！supportLists]-->[6]?????? <！--[endif]-->陳晶晶， 胡玉林， 龐振才， 等. 威廉斯香蕉矮化突變體矮化原因初探[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（11）： 2144-2150.

<！--[if ！supportLists]-->[7]?????? <！--[endif]-->DHont A， Denoeud F， Aury J M，et al. The banana （Musa acuminata） genome and the evolution of monocotyledonous plants[J]. Nature， 2012， 488： 213-217.

<！--[if ！supportLists]-->[8]?????? <！--[endif]-->Kamiya Y， Garcia-Martinez J. Regulation of gibberellin biosynthesis by light[J]. Current Opinion Plant Biology， 1999， 2（5）： 398-403.

<！--[if ！supportLists]-->[9]?????? <！--[endif]-->Olszewski N， Sun T P， Gubler F. Gibberellin signaling： biosynthesis， catabolism， and response pathways[J]. Plant Cell， 2002， 14（suppl）： S61-S80.

<！--[if ！supportLists]-->[10]??? <！--[endif]-->黃先忠， 蔣才富， 廖立力， 等. 赤霉素作用機(jī)理的分子基礎(chǔ)與調(diào)控模式研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)通報(bào)， 2006， 23（5）： 499-510.

<！--[if ！supportLists]-->[11]??? <！--[endif]-->談? 心， 馬欣榮. 赤霉素生物合成途徑及其相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2008， 14（4）： 571-577.

<！--[if ！supportLists]-->[12]??? <！--[endif]-->Phillips A L， Ward D A， Uknes S，et al. Isolation and expression of three gibberellin 20-oxidase cDNA clones fromArabidopsis[J]. Plant Physiology， 1995， 108（3）： 1049-1057.

<！--[if ！supportLists]-->[13]??? <！--[endif]-->Rieu I， Ruiz-Rivero O， Fernandez-Carcia N，et al. The gibberellin biosynthetic genesAtGA20ox1andAtGA20ox2act， partially redundantly， to promote growth and development throughout theArabidopsislife cycle[J]. Plant Journal， 2008， 53（3）： 488-504.

<！--[if ！supportLists]-->[14]??? <！--[endif]-->吳建明， 陳榮發(fā)， 黃? 杏， 等. 高等植物赤霉素生物合成關(guān)鍵組分GA20-oxidase氧化酶基因的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2016， 32（7）： 1-12.

<！--[if ！supportLists]-->[15]??? <！--[endif]-->Qin X， Liu J H， Zhao W S，et al. Gibberellin 20-oxidase geneOsGA20ox3 regulates plant stature and disease development in rice[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2013， 26（2）： 227-239.

<！--[if ！supportLists]-->[16]??? <！--[endif]-->Qiao F， Chen Z. Alteration of rice growth and development via antisense expression ofOsGA20ox2gene[J]. African Journal of Biotechnology， 2013， 12（25）： 3898-3904.

責(zé)任編輯：黃東杰