李少星 余華 楊惠歡 劉戰(zhàn)立

(1.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,四川 成都 610500;2.新津縣人民醫(yī)院,四川 成都 611430)

子宮內膜癌(endometrial carcinoma，EC)是臨床常見生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率正逐年上升，死亡率已超過宮頸癌，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1]。正常子宮內膜演變?yōu)镋C是一個非常漫長的過程，而早發(fā)現(xiàn)、早治療對于EC的防治意義重大[2]。多種癌基因及抑癌基因參與調控EC的發(fā)生發(fā)展過程[3]。既往研究顯示，PTEN是抑癌基因，其高表達可明顯抑制腫瘤細胞的增長，且PTEN是EC中突變率最高的基因[4]。P27是近年來發(fā)現(xiàn)的一種熱穩(wěn)定蛋白，可能是PTEN通過PI3K/AKT途徑調節(jié)細胞分化增殖，誘導G1期阻滯過程的下游靶基因[5]。既往研究顯示，在包含胃癌、乳腺癌、膀胱癌等在內的多種腫瘤組織及腫瘤細胞中可檢測到PTEN及P27的異常表達，但是少見有關EC組織及癌前病變組織中PTEN及P27蛋白異常表達的相關報道[6-8]。因此，本研究采用免疫組織化學法對不同子宮內膜組織類型中PTEN及P27蛋白表達情況進行檢測，旨在探討抑癌基因PTEN及P27在EC及癌前病變中的診斷意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2015年6月～2020年1月成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院確診為EC患者的存檔癌組織蠟塊35例，同時選取同期存檔的39例內膜增生過長(不伴不典型)、26例子宮內膜不典型增生和35例正常子宮內膜組織蠟塊。按組織類型不同分為正常子宮內膜組、內膜增生過長組、子宮內膜不典型增生組和EC組。EC組按病理分級分：G1 14例，G2 16例，G3 5例；臨床分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期9例，Ⅲ期5例，Ⅳ期3例；肌層浸潤：無肌層浸潤12例，浸潤≤1/2肌層16例，浸潤>1/2肌層7例；淋巴轉移：無淋巴轉移29例，盆腔淋巴結轉移4例，腹主動脈旁淋巴結轉移2例；組織學類型：Ⅰ型(子宮內膜樣腺癌)27例，Ⅱ型8例(漿液性乳頭狀腺癌6例，透明細胞癌2例)。所有組織類型均經(jīng)病理結果證實，所有患者術前均未接受過化療或放療，各組患者之間年齡、身體狀況無明顯差異，具有可比性。

1.2 實驗試劑及儀器 SP試劑盒、PTEN及P27一抗均購于北京中杉金橋公司，光學顯微鏡購于德國徠卡公司。

1.3 免疫組織化學法檢測組織PTEN及P27表達 將收集的各組織蠟塊進行石蠟切片，厚度約為4 μm，經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水，抗原熱修復，去離子水孵育，滴加PTEN及P27一抗，置于4 ℃過夜后采用PBS清洗2次，滴加聚合酶輔助劑，37 ℃水浴持續(xù)孵育20 min；PBS沖洗2次，滴加IgG多聚體；37 ℃水浴孵育30 min；采用DBA溶液顯色。陰性對照為未加一抗的PBS緩沖液，陽性對照為正常的子宮內膜組織切片，每批染色均設置陰性和陽性對照。

1.4 結果判斷 將切片置于光學顯微鏡下，隨機選取5個高倍視野，統(tǒng)計各視野陽性細胞數(shù)。PTEN及P27的陽性表達細胞核、細胞漿染成棕黃色。陽性細胞數(shù)<10%為陰性(-)；陽性細胞數(shù)10%～50%為弱陽性(+)；陽性細胞數(shù)>50%為強陽性(++)。

2 結果

2.1 各組患者一般資料比較 4組患者年齡、BMI及合并癥比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 4組患者一般資料比較

2.2 不同組織中PTEN表達情況比較 免疫組織化學結果顯示，PTEN在正常子宮內膜中的陽性率為100%，而在內膜增生過長組和內膜不典型增生組中PTEN陽性率分別降低為79.49%和69.23%。EC組PTEN陽性率為42.86%，顯著低于其他組(2=28.000，P<0.001；2=10.523，P=0.001；2=4.179，P=0.041)，見表2、圖1。

表2 不同組織中PTEN表達情況比較

2.3 不同組織中P27表達情況比較 不同內膜組織中P27陽性表達存在顯著性差異(P<0.05)。正常子宮內膜和內膜增生過長中P27陽性表達率較高，在內膜不典型增生和EC組中P27陽性表達率較低。EC組P27陽性表達率顯著低于正常子宮內膜及內膜增生過長組(2=30.688，P<0.001；2=21.941，P<0.001)，見表3、圖1。

圖1 不同子宮內膜組織中PTEN及P27表達情況(免疫組化，100×)

表3 不同組織中P27表達情況比較

2.4 EC組織中PTEN及P27的陽性表達與病理參數(shù)的關系 隨著EC病理分級升高，其PTEN及P27陽性率顯著降低(P<0.05)；內膜樣癌組織中PTEN及P27陽性率明顯低于非內膜樣癌組織(P<0.05)。EC臨床分期、肌層浸潤和有無淋巴結轉移對EC中PTEN及P27的陽性表達無明顯影響(P>0.05)，見表4。

表4 EC組織中PTEN及P27的陽性表達與病理參數(shù)的關系[n(×10-2)]

2.5 子宮內膜不典型增生中PTEN及P27蛋白表達相關性 子宮內膜不典型增生組織中，PTEN及P27蛋白共同陽性表達10例，共同陰性表達7例，子宮內膜不典型增生組織中PTEN及P27蛋白表達正相關(r=0.402，P=0.042)，見表5。

表5 PTEN及P27蛋白在子宮內膜不典型增生中表達相關性(n)

2.6 EC組織中PTEN及P27蛋白表達相關性 EC組織中，PTEN及P27蛋白共同陽性表達11例，共同陰性表達19例，EC組織中PTEN及P27蛋白表達正相關(r=0.712，P<0.001)，見表6。

表6 EC組織中PTEN及P27蛋白表達相關性(n)

3 討論

近年來，EC及癌前病變的發(fā)生率不斷上升，且日益年輕化，而早診斷早治療是提升EC防治效果的關鍵[9-10]。腫瘤疾病的發(fā)生是一個逐漸演變的過程，EC的發(fā)生也經(jīng)歷了一系列過程，包含子宮內膜細胞的異常增殖、瘤變及EC的形成，而周期調控機制異常是這一過程的內在原因[11]。機體內癌細胞的周期調控是由多種因素共同介導的，其中PTEN及P27等周期相關蛋白參與子宮內膜細胞的調控過程，與EC的發(fā)生與發(fā)展密切相關[12-13]。子宮內膜增生過長及內膜不典型增生均是子宮內膜癌前病變的過程，基于此，本研究通過分析正常子宮內膜、子宮內膜增生過長、內膜不典型增生及EC四種不同組織中PTEN、P27的表達情況，分析其與EC發(fā)生及發(fā)展過程的關系，旨在為臨床EC的診療提供理論參考。

PTEN，又稱為MMACI基因，由9個外顯子組成，主要是通過PIP3脫磷酸降低細胞內的PIP3水平，進而阻斷Akt-蛋白激酶B(PKB)途徑，影響其下游通路，包括通過抑制基因P27、BAD等的磷酸化水平將細胞周期阻斷在G1期，進而顯著抑制細胞增殖，并誘導凋亡的發(fā)生[14]。此外，PTEN還能使局部粘附激酶(foca 1 adhesion kinase，F(xiàn)AK)脫磷酸，進而影響細胞增殖及浸潤介導的細胞鋪展及局部粘附的形成[15]。祁曉莉等[16]研究顯示，采用免疫組織化學染色可觀察到PTEN在EC中的陽性表達率明顯低于其他子宮內膜組織。而本研究結果顯示，在正常子宮內膜、內膜增生過長、內膜不典型增生及EC組織中PTEN陽性表達率分別為100.00%、79.49%、69.23%和42.86%，PTEN在癌及內膜不典型增生中的表達缺失與內膜增生過長及正常子宮內膜組織相比，具有顯著性差異，說明PTEN表達被抑制或缺失則可能會使子宮內膜生長失控，導致癌變的發(fā)生。Black等[17]證實PTEN在基因水平的改變與EC的發(fā)生和發(fā)展顯著相關。在本研究中，PETN的陽性表達率與病理分級明顯相關，組織病理分級越高其陽性表達率越低，提示腫瘤惡性程度越高，PTEN蛋白表達量越低，其對應的預后越差，其在非內膜樣癌組織中陽性表達率明顯低于內膜樣癌組織也進一步證實這一觀點，而這一結論對于臨床評估子宮內膜癌患者預后意義重大。但本研究結果顯示，EC組織中PTEN蛋白陽性表達率隨著肌層浸潤深度加深、臨床分期升高及出現(xiàn)淋巴結轉移而降低，但差異并無統(tǒng)計學意義，這可能與本研究樣本量較少有關。由于肌層浸潤深度、臨床分期及淋巴結轉移情況均是影響EC患者預后的重要因素，對于其預后的判斷至關重要，因此在后續(xù)的研究中仍需進一步擴大樣本量，進一步分析PTEN與EC發(fā)生發(fā)展過程的關系。

P27定位于染色體12pI3，屬于CDKI中KIP/CIP家族中的一員，其與cyclinE-CDK2復合物結合，能有效抑制cyclinE-CDK2復合物活性，而高濃度cyclinE-CDK2是細胞通過G1到S限制點最關鍵的因素[18]。此外，P27是潛在的腫瘤抑制基因，P27的下調和CDK2的激活都能誘導細胞惡變，形成腫瘤細胞，保持機體內P27正常濃度是抵抗細胞惡變的基礎[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常子宮內膜、內膜增生過長、內膜不典型增生及EC組織中P27陽性表達率分別為97.14%、87.18%、42.31%和34.29%，提示P27表達的缺失是誘發(fā)EC及癌前病變的關鍵因素之一，與楊玉敏等[20]研究結果一致。P27蛋白在病理分級G1、G2及G3組織中陽性表達率分別為64.29%、18.75%及0.00%，三者間具有顯著性差異，且其在內膜樣癌組織中的陽性表達率明顯低于非內膜樣癌組織，提示P27可能介導EC的演變過程，對P27進行檢測可為早期診斷EC和臨床綜合治療提供參考。本研究證實在EC系列病變中，P27呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，提示P27表達下降可能在子宮內膜細胞病變中起著重要作用，為子宮內膜癌變的早期信號。此外，在EC及癌前病變組織中PTEN與P27間存在正相關關系，其原因可能在于PTEN表達缺失會導致P27表達異常，從而導致細胞周期失控，誘導EC的發(fā)生。因此，采用免疫組織化學法聯(lián)合檢測PTEN、P27有助于EC以及癌前病變的早期診斷。

4 結論

由PTEN及P27基因突變和缺失導致的PTEN、P27功能喪失是EC發(fā)生的早期事件，在子宮內膜不典型增生組織及EC組織中PTEN與P27蛋白表達量呈正相關，兩者共同作用介導子宮內膜過度增生發(fā)展至EC的過程，采用免疫組織化學法檢測PTEN及P27基因有助于鑒別EC及癌前病變，且對EC的癌變程度具有一定的評估作用。