折勝利 宋興華 周楊 何園 賈晶 劉彥博 王良華

(1.西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院骨科，陜西 西安 710012；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨病/骨腫瘤科，新疆 烏魯木齊 830054；3.陜西省新安中心醫(yī)院骨科，陜西 西安 710048；4.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

骨肉瘤是常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，多發(fā)病于青少年，表現(xiàn)為成骨細(xì)胞分化并產(chǎn)生惡性類骨質(zhì)，具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、侵襲性高等特點(diǎn)，容易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[1-2]。骨肉瘤的治療主要是根治性腫瘤切除和新輔助化療的結(jié)合，雖然新輔助化療能夠?qū)侨饬銎鸬矫黠@的治療效果，但是治療后患者的生存率低于20%[3-5]，所以研究更多用于骨肉瘤治療的靶點(diǎn)對于其臨床治療至關(guān)重要。

外泌體是一類由多數(shù)活細(xì)胞分泌的納米級囊泡，粒徑約50～100 nm，內(nèi)含多種RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)，可隨體液轉(zhuǎn)移至靶組織和靶器官而發(fā)揮調(diào)控作用[6-7]。研究表明，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可攜帶腫瘤細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、血管新生、免疫逃逸等過程[8-10]。已有研究表明，肝癌細(xì)胞外泌體可調(diào)控腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的激活而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[9]，但骨肉瘤細(xì)胞外泌體是否具有此作用尚無明確報(bào)道。本研究通過骨肉瘤細(xì)胞外泌體對成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，旨在為骨肉瘤的臨床治療和研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、MG-63，人成骨細(xì)胞hFoB1.19(中科院上海細(xì)胞庫)；人肺成纖維細(xì)胞MRC-5(普諾賽生物技術(shù)有限公司)；cDNA合成試劑盒、qRT-PCR試劑盒(福麥斯生物技術(shù)有限公司)，p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、GAPDH(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，Transwell小室(福麥斯生物技術(shù)有限公司)，無外泌體胎牛血清(愛必信生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) U2-OS、MG-63、hFoB1.19細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%非必需氨基酸的MEM培養(yǎng)基中，所有細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率達(dá)70%～80%時(shí)，使用胰蛋白酶溶液消化并傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 外泌體的提取 差速離心法提取hFoB1.19、U2-OS、MG-63細(xì)胞外泌體，具體步驟為：將細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含10%無外泌體胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，然后將上清液3000×g，4 ℃離心15 min；收集上清液6000×g離心40 min；收集上清液10000×g離心1 h，取上清；100000×g離心1 h，收集沉淀即為外泌體，用400 μL PBS重懸外泌體，并放在-80 ℃保存。

1.4 外泌體的鑒定 透射電鏡觀察外泌體的結(jié)構(gòu)，主要步驟為：取透射電鏡專用的銅網(wǎng)，滴加20 μL外泌體溶液，使用紅外燈烘烤銅網(wǎng)10 min，繼續(xù)向銅網(wǎng)滴加2滴磷鎢酸，繼續(xù)使用紅外燈下烘烤10 min，用濾紙吸取多余的液體，在透射電鏡下拍照，并觀察外泌體的結(jié)構(gòu)。

1.5 細(xì)胞增殖 將MRC-5細(xì)胞稀釋至50000個(gè)/mL，將上述細(xì)胞接種至96孔板，每孔100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入外泌體，使外泌體終濃度為10 μg/mL，在培養(yǎng)箱中共孵育，分別于24、48、72 h取出對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處的吸光度，OD值越大，細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.6 細(xì)胞遷移 用DMEM空白培養(yǎng)基重懸MRC-5細(xì)胞，細(xì)胞接種至Transwell小室中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，體積為200 μL，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μL DMEM完全培養(yǎng)基，然后將24孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h，Transwell小室底部用結(jié)晶紫染色10 min，然后在顯微鏡下觀察并拍照，比較各組細(xì)胞遷移數(shù)。

1.7 細(xì)胞侵襲 用Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲能力，主要步驟為：取Matrigel膠融化后，20 μL平鋪于Transwell小室中，小室置于37 ℃培養(yǎng)箱中1 h，使Matrigel膠充分凝固，用DMEM空白培養(yǎng)基重懸MRC-5細(xì)胞，細(xì)胞接種至Transwell小室中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，體積為200 μL，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μL DMEM完全培養(yǎng)基，然后將24孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h，Transwell小室底部用結(jié)晶紫染色10 min，然后在顯微鏡下觀察并拍照，比較各組細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.8 qRT-PCR 將MRC-5細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，共孵育24 h后，使用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞的RNA，使用核酸定量儀定量后，根據(jù)cDNA試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，使用2-△△CT法計(jì)算基因相對表達(dá)量。所用引物序列見表1。

表1 IL-1β、IL-6、 IL-8、GAPDH引物序列

1.9 Western blot 取與外泌體共孵育24 h后的MRC-5細(xì)胞1×107個(gè)消化于離心管中，使用RIPA蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒定量，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，每孔上樣量為10 μg，轉(zhuǎn)膜，用5%BSA封閉2 h，然后以1∶1000比例稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果 透射電鏡鑒定外泌體結(jié)果顯示，差速離心法提取到的外泌體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)呈“杯托”樣，粒徑約為50～100 nm，符合外泌體的形態(tài)特征，見圖1。Western blot檢測外泌體標(biāo)志結(jié)果顯示，差速離心法提取到的外泌體表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白TSG101、HSP70、CD63、CD9，符合外泌體生物學(xué)特征，可用于后續(xù)研究，見圖2。

圖1 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)結(jié)果

圖2 Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白結(jié)果

2.2 骨肉瘤外泌體促進(jìn)MRC-5細(xì)胞增殖能力 CCK8檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，與PBS組相比，hFoB1.19 exo組細(xì)胞的增殖能力無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.01)，說明骨肉瘤外泌體能夠顯著促進(jìn)MRC-5細(xì)胞的增殖能力，見圖3。

圖3 CCK8法檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 骨肉瘤外泌體促進(jìn)MRC-5細(xì)胞遷移能力 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，與PBS組相比，hFoB1.19 exo組細(xì)胞遷移數(shù)無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細(xì)胞遷移數(shù)目顯著高于PBS組(P<0.001)，說明U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細(xì)胞遷移能力顯著增加，提示骨肉瘤外泌體可顯著促進(jìn)MRC-5細(xì)胞遷移能力，見圖4。

圖4 Transwell小室法檢測骨肉瘤外泌體對細(xì)胞遷移能力影響結(jié)果(20×)

2.4 骨肉瘤外泌體促進(jìn)MRC-5細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示，與PBS組相比，hFoB1.19 exo組細(xì)胞侵襲數(shù)無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細(xì)胞侵襲能力顯著增加(P<0.001)，提示骨肉瘤外泌體可顯著促進(jìn)MRC-5細(xì)胞侵襲能力，見圖5。

圖5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測骨肉瘤外泌體對細(xì)胞侵襲能力影響結(jié)果(20×)

2.5 骨肉瘤外泌體促進(jìn)MRC-5細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-8表達(dá) QRT-PCR檢測與外泌體共孵育后MRC-5細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8表達(dá)，結(jié)果顯示，與hFoB1.19細(xì)胞外泌體共孵育后，MRC-5細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)與PBS組相比無顯著差異(P>0.05)，

與U2-OS和MG-63細(xì)胞分泌的外泌體共孵育后，MRC-5細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8表達(dá)顯著增加(P<0.001)，說明骨肉瘤外泌體能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，即骨肉瘤外泌體促進(jìn)成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，見圖6。

圖6 qRT-PCR檢測骨肉瘤細(xì)胞外泌體對MRC-5細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響

2.6 骨肉瘤外泌體促進(jìn)MRC-5細(xì)胞α-SMA、Vimentin、FAP表達(dá) Western blot檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細(xì)胞α-SMA、Vimentin、FAP表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與PBS組相比，hFoB1.19 exo組MRC-5細(xì)胞α-SMA、Vimentin、FAP表達(dá)無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細(xì)胞α-SMA、Vimentin、FAP表達(dá)顯著增加(P<0.001)，見圖7。α-SMA、Vimentin、FAP是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白，說明骨肉瘤外泌體能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

圖7 Western blot檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細(xì)胞α-SMA、Vimentin、FAP表達(dá)的影響

2.7 骨肉瘤外泌體激活JAK2/STAT3信號通路 Western blot檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路的影響，結(jié)果(圖8)顯示，相比于PBS組，hFoB1.19 exo組MRC-5細(xì)胞JAK-2和STAT3磷酸化水平無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細(xì)胞JAK-2和STAT3磷酸化水平顯著增加(P<0.001)，說明骨肉瘤外泌體能夠顯著激活MRC-5細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路，提示骨肉瘤外泌體能夠激活JAK2/STAT3信號通路而促進(jìn)成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

圖8 Western blot檢測骨肉瘤外泌體對JAK2/STAT3信號通路激活的影響

3 討論

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。研究表明，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞并非獨(dú)立存在，而是伴隨在腫瘤微環(huán)境中，調(diào)控腫瘤的生長與存活，并且可維持腫瘤的惡性傾向[11]。而大多數(shù)的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是由局部組織固有的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化受腫瘤微環(huán)境調(diào)控[12-14]。腫瘤細(xì)胞可將外泌體分泌至腫瘤微環(huán)境，并且可通過外泌體將腫瘤自身的遺傳信息轉(zhuǎn)移至腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。研究表明，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的激活受腫瘤外泌體的調(diào)控[17-18]，如肺癌細(xì)胞外泌體可通過激活NF-κB信號通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，肝癌細(xì)胞亦通過外泌體促進(jìn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究主要探討了骨肉瘤外泌體對腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，將骨肉瘤細(xì)胞分泌的外泌體和成骨細(xì)胞分泌的外泌體分別與成纖維細(xì)胞共孵育后，骨肉瘤細(xì)胞外泌體能夠顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，而成骨細(xì)胞外泌體則無此功能，說明骨肉瘤細(xì)胞外泌體具有調(diào)控成纖維細(xì)胞的功能。

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可通過分泌IL-1β、IL-6、IL-8而調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)。α-SMA、Vimentin、FAP是表達(dá)于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中的標(biāo)志蛋白。為了探討骨肉瘤細(xì)胞外泌體是否能調(diào)控成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，將外泌體分別與成纖維細(xì)胞共孵育后檢測成纖維細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)和α-SMA、Vimentin、FAP的表達(dá)，結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞外泌體可顯著上調(diào)成纖維細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)和標(biāo)志蛋白α-SMA、Vimentin、FAP的表達(dá)，這說明骨肉瘤外泌體可促進(jìn)成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

JAK/STAT信號通路是眾多細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同途徑，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程，JAK2蛋白的激活觸發(fā)STAT3的磷酸化。磷酸化的STAT3二聚化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，然后與靶基因分子結(jié)合并激活特定的基因翻譯[19-22]。JAK/STAT信號通路的激活可促進(jìn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的激活，進(jìn)而促進(jìn)黑色素瘤血管新生。本研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞外泌體可促進(jìn)成纖維細(xì)胞中JAK和STAT的磷酸化，即激活JAK/STAT信號通路。

4 結(jié)論

骨肉瘤細(xì)胞外泌體能夠通過激活JAK/STAT信號通路，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，但外泌體中何種物質(zhì)發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步研究。