黃學者, 崔宗巖, 葛 娜, 紀涌彥, 曹彥忠

(秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004)

我國中藥材種類繁多，常用植物源中藥材有600多種，每年有大量的中藥材出口到日本、美國等近100個國家和地區(qū)[1]。原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的2013—2016年全國藥品質(zhì)量抽驗監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，國內(nèi)中藥材與飲片總體合格率分別為64%、68%、75%和77%，合格率雖呈逐年提升，但不合格率依然較高，其中農(nóng)藥殘留和重金屬超標是最主要的風險因素，占80%以上[2]。究其原因，首先，我國中藥材生產(chǎn)科技水平不夠發(fā)達，現(xiàn)有登記用于中藥材的農(nóng)藥產(chǎn)品數(shù)量有限[3]，農(nóng)民存在濫用、誤用農(nóng)藥現(xiàn)象，易導致農(nóng)藥殘留風險。其次，目前國內(nèi)雖然有一些中藥材的生產(chǎn)管理規(guī)定，但缺乏統(tǒng)一標準，可操作性較差。我國藥用和芳香植物生產(chǎn)管理規(guī)范 (GAP) 標準還沒有推行[4]，GAP種植基地較少，規(guī)范化種植的中藥材僅50多種。因此，亟需建立一種廣泛適用于各種類型植物源中藥材農(nóng)藥殘留的篩查方法。

關(guān)于中藥材中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法主要有：固相萃取 (SPE)[5]、在線凝膠滲透色譜(GPC)[6]、基質(zhì)固相分散 (MSPD)[7]、QuEChERS[8]等，其中QuEChERS方法具有快速、簡單、廉價、有效、可靠和安全等特點，得到了越來越多檢測機構(gòu)的認可和廣泛應(yīng)用，食品安全國家標準[9]即采用QuEChERS方法作為農(nóng)藥殘留的前處理方式。儀器檢測方法主要包括：氣相色譜-電子捕獲檢測法 (GC-ECD)[10]、大氣壓氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法 (APGC-QTof)[11]、超高效液相色譜-四極桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法 (UPLC-Q-Orbitrap HRMS)[12]、氣相色譜-質(zhì)譜法 (GC-MS)[13]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (GC-MS/MS)[14-15]、高效液相色譜法(HPLC)[16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (LC-MS/MS)[17]等。其中GC-MS/MS具有高抗干擾能力、高通量和高選擇性等優(yōu)點，適用于分析背景干擾嚴重、定性困難、樣品組分含量低的情況，能夠滿足中藥材中農(nóng)藥多殘留的檢測。

現(xiàn)有中藥材農(nóng)藥殘留檢測方法的不足在于：1) 檢測目標物種類有限，高通量多殘留檢測方法較少；2) 檢測樣品多集中在一種或一類中藥材上，不能滿足涵蓋各種類型植物源中藥材的快速和高通量檢測要求。

本研究建立了460種農(nóng)藥殘留的GC-MS/MS方法數(shù)據(jù)庫，結(jié)合QuEChERS檢測方法，分別對5類代表性植物源中藥材的提取凈化條件進行了考察和優(yōu)化，并將其應(yīng)用于市售中藥材樣品的篩查檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 (TSQ 8000型，美國Thermo Fisher公司)，高速冷凍離心機 (3-30K型，美國Sigma公司)，振蕩器 (SA300型，日本Yamato公司)，氮吹儀 (N-EVAPTM112型，美國Organomation公司)，超純水發(fā)生器 (Mili-Q型，美國Millipore公司)，分析天平 (XP105型，瑞士Mettler Toledo公司) 等。

460種農(nóng)藥(見表1)標準品 (純度≥97%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH、美國Strem Chemicals及美國Sigma Aldrich等公司)。準確稱取適量標準品，分別用甲苯等溶劑配制成1 mg/mL的標準儲備液，于 ?20 ℃保存。標準工作溶液采用甲苯稀釋，配制質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL。

甲苯、正己烷和乙腈 (均為色譜純，Dikma公司)；乙酸 (色譜純，美國TEDIA公司)；無水硫酸鎂和氯化鈉 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；N-丙基乙二胺 (PSA) 和C18(Dikma公司)；石墨化碳黑 (GCB，CNW公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取中藥材樣品2.50 g于50 mL離心管中，加入15 mL去離子水浸泡2 h；加入20.0 mL 0.1%乙酸-乙腈(0.1%為體積分數(shù)，下同)、6.00 g無水硫酸鎂和2.50 g氯化鈉，渦旋混勻2 min，振蕩提取20 min，于3 500 r/min下離心5 min；取10.0 mL上清液于40 mL塑料具塞離心管中，管內(nèi)預(yù)先裝有1.50 g無水硫酸鎂(150 mg/mL)、0.50 g PSA (50 mg/mL)和0.50 g C18(50 mg/mL)，渦旋2 min，于10 000 r/min下離心5 min；取5 mL上清液于15 mL玻璃試管中，在45 ℃下氮吹至近干，加入100 μL 7 μg/mL的環(huán)氧七氯正己烷溶液，渦旋混勻，過0.22 μm有機相濾膜，待GC-MS/MS檢測。

1.2.2 儀器檢測條件

色譜條件：DB-5MS型5%苯基-95%甲基聚硅氧烷固定相的弱極性色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度290 ℃，不分流進樣，載氣為高純氦氣 (≥99. 999%)，采用恒流進樣模式，流速1.5 mL/min，進樣體積為1.0 μL。升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持1 min，以 20 ℃/min的速率升至100 ℃，然后再以10 ℃/min 的速率升至290 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：EI離子源，溫度250 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，多離子反應(yīng)監(jiān)測 (SRM) 模式。460種農(nóng)藥的保留時間和質(zhì)譜條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器檢測方法數(shù)據(jù)庫的建立

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 選擇最常用的DB-5MS型5%苯基-95%甲基聚硅氧烷固定相的弱極性色譜柱，該色譜柱耐高溫，適用于不同沸點和極性農(nóng)藥殘留化合物的分離和檢測。由于串聯(lián)質(zhì)譜對目標物的選擇性檢測能力大大提高，對分離的要求相對降低，因而主要考慮了低沸點和高沸點化合物的特性，以及異構(gòu)體的分離特征，對升溫程序進行了選擇和優(yōu)化，50 ℃保持1 min后對比了3種升溫速率：① 20 ℃/min升至290 ℃；② 10 ℃/min升至290 ℃；③ 20 ℃/min升至100 ℃，然后10 ℃/min升至290 ℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：升溫程序①分析時間短，但部分同分異構(gòu)體分離效果不好；升溫程序②分離效果較好，但分析時間較長。升溫程序③既保證了分離效果又節(jié)約了分析時間，在1.2.2節(jié)色譜條件下實現(xiàn)了460種農(nóng)藥在色譜柱上較好的分離 (圖1)，通過色譜不能分開的則依據(jù)其特征性質(zhì)譜參數(shù)再進行分離。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化 采用自動化選擇反應(yīng)監(jiān)測 (AutoSRM) 功能對化合物的特征離子對 (母離子、子離子) 及對應(yīng)碰撞能量等進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。實際樣品檢測采用SRM方式，通過二級選擇，使得目標物檢測的特異性大大提高，一方面降低了噪音，提高了檢測靈敏度，另一方面也避免了復(fù)雜基質(zhì)的干擾，提高了定性定量的準確性。

表1 460種農(nóng)藥的保留時間和定量離子對、輔助定性離子對及碰撞能量Table 1 Retention time, quantitative ion, confirming ion and collision energy of 460 pesticides

2.2 QuEChERS方法的選擇和優(yōu)化

針對不同類型的植物源中藥材基質(zhì)，結(jié)合國家相關(guān)標準[18-22]，選擇和優(yōu)化了QuEChERS前處理條件，主要優(yōu)化了提取溶劑體系和凈化條件。

2.2.1 提取條件選擇 乙腈是農(nóng)藥殘留常用提取試劑，QuEChERS方法提取體系通常分為3種：單一乙腈體系[23]、加乙酸鹽緩沖體系[24](美國化學家分析家協(xié)會-AOAC標準方法) 以及加檸檬酸鹽體系[25]等，其中乙酸鹽緩沖體系在實際操作中抗基質(zhì)效應(yīng)更強，為了提高對酸堿敏感農(nóng)藥的回收率，本研究選定乙酸-乙腈作為提取溶劑，分別考察了乙腈、0.1%乙酸-乙腈和1%乙酸-乙腈3個提取體系對5種類型植物源中藥材的提取效果。結(jié)果表明：在100 μg/kg添加水平下，根莖類、花葉類、籽實類、全草類和皮類5種類型中藥材基質(zhì)均表現(xiàn)出相似的變化趨勢。以根莖類為例 (圖2A)，相對純乙腈，當提取溶劑為0.1%乙酸-乙腈時，均可使得目標物的回收率及相對標準偏差提高，且對大多數(shù)樣品而言，0.1%和1%乙酸加入量之間無顯著差異，因而最終選用0.1%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 凈化條件選擇 參考QuEChERS方法常用凈化條件[14,17]，本研究選擇分散固相萃取法清除樣品中的水分和干擾基質(zhì)，在用無水硫酸鎂清除水分的條件下分別考察了PSA、PSA + C18和PSA + C18+GCB 3種凈化體系對5種類型中藥材基質(zhì)的凈化效果。結(jié)果表明：在100 μg/kg添加水平下，根莖類、花葉類、籽實類、全草類和皮類5種類型中藥材基質(zhì)同樣均表現(xiàn)出相似的變化趨勢，代表性根莖類樣品的凈化條件對比見圖2B。相對于PSA，PSA + C18對基質(zhì)較為復(fù)雜的花葉類、全草類和皮類樣品的凈化效果明顯增強，對基質(zhì)相對簡單的根莖類和籽實類樣品的凈化效果略有增強；與PSA + C18相比，PSA + C18+ GCB對部分顏色較深的花葉類和全草類樣品的凈化效果 (祛除顏色)雖有一定程度增強，但GCB對部分農(nóng)藥 (七氯、五氯苯胺、五氯硝基苯和六氯苯等) 吸附作用過強，導致其回收率大大降低，因而本方法未采用PSA + C18+ GCB的凈化組合；PSA中加入C18雖然在視覺上對根莖類和籽實類樣品凈化效果增強不明顯，但在不影響回收率的前提下，考慮到盡量減輕連續(xù)及大量進樣對色譜柱和儀器造成的污染和損害，最終決定選用PSA + C18凈化組合。

續(xù)表1Table 1 (Continued)

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2.3 方法性能評價

目前，國內(nèi)外關(guān)于中藥材中農(nóng)藥最大殘留限量 (MRLs) 的標準主要以藥典為準[26]?！稓W洲藥典》 (EP 8.0)、《美國藥典》 (USP 38) 和《英國藥典》 (BP 2015) 共涉及中草藥中76種農(nóng)藥殘留，其中《英國藥典》對植物源中藥材中的農(nóng)藥進行了概括性限制：有機氯類農(nóng)藥的MRL值為0.05 mg/kg，其他農(nóng)藥MRL值為0.5 mg/kg 或1.0 mg/kg；《中國藥典》規(guī)定了22種有機氯類農(nóng)藥的MRL值。本研究考察了QuEChERS-GC-MS/MS方法在5種類型中藥材基質(zhì)中的定量限 (LOQ) (信噪比為10時對應(yīng)的目標物濃度)，表2中僅列出了其中至少在一種基質(zhì)中LOQ大于50 μg/kg的農(nóng)藥品種。

表2 QuEChERS-GC-MS/MS測定5種類型中藥材基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的定量限 (僅列出LOQ大于50 μg/kg的農(nóng)藥)Table 2 Limits of quantification (LOQ) for determination of pesticide residues in different types of Chinese medicinal materials by QuEChERS-GC-MS/MS (Only pesticides of LOQ > 50 μg/kg were listed) (μg/kg)

總體而言，對不同類型中藥材樣品，本方法的LOQ整體上在0.006～221 μg/kg之間，其中80%以上目標物LOQ不高于50 μg/kg，對于根莖類和籽實類樣品，60%以上農(nóng)藥LOQ低于10 μg/kg，說明本篩查檢測方法在高通量基礎(chǔ)上具有較高的靈敏度；針對不同類型植物源中藥材樣品所測得的回收率和相對標準偏差數(shù)據(jù)表明，72%以上目標物的回收率在60%～120%之間，77%以上農(nóng)藥的相對標準偏差在20%以內(nèi)，方法的準確度良好。

與現(xiàn)有國家標準GB 23200.10—2016[18]及其他相關(guān)文獻方法相比，本研究建立的QuEChERSGC-MS/MS方法更加全面適用于不同類型植物源中藥材基質(zhì) (根莖類、花葉類、籽實類、全草類、皮類等)，可實現(xiàn)一次進樣同時檢測400種以上農(nóng)藥殘留，且大多數(shù)農(nóng)藥的靈敏度和準確度均可滿足方法學要求[27]，具有簡便、快速和高通量的優(yōu)點，適用于不同類型植物源中藥材中農(nóng)藥殘留的篩查測定。

2.4 實際樣品檢測

為了驗證本研究方法的實用性并系統(tǒng)了解市售植物源中藥材中農(nóng)藥殘留狀況，采用本研究方法對從藥店及藥材市場等地采集的215批中藥材樣品進行了篩查檢測。結(jié)果表明，有17批樣品未檢出任何農(nóng)藥殘留，其余198批樣品均檢出1種以上農(nóng)藥殘留，占檢測樣品總數(shù)的92%。其中所有花葉和全草類樣品均檢出了農(nóng)藥殘留，可能與這些類型的中藥材為農(nóng)藥直接施用部位有關(guān)。從檢出農(nóng)藥種類來看，所有樣品共檢出72種農(nóng)藥殘留，檢出率最高的3種農(nóng)藥分別為毒死蜱 (20.7%)、氟氯氰菊酯 (16.0%) 和六氯苯 (15.3%)，其中毒死蜱最高殘留量達到355 μg/kg，氟氯氰菊酯最高殘留量達到1 014 μg/kg，應(yīng)當引起關(guān)注和重視，可以作為其質(zhì)量安全評價重點關(guān)注的風險物質(zhì)。

3 結(jié)論

建立了植物源中藥材中農(nóng)藥多殘留高通量篩查檢測的QuEChERS-GC-MS/MS。樣品在用0.1%乙酸-乙腈提取、氯化鈉鹽析分層、PSA + C18分散固相萃取凈化條件下，針對根莖類、花葉類、籽實類、全草類和皮類5種類型中藥材基質(zhì)，實現(xiàn)了一次進樣同時檢測400多種農(nóng)藥殘留。該方法具有快速、靈敏和高通量的優(yōu)勢，將其運用于市售215批植物源中藥材樣品檢測，發(fā)現(xiàn)毒死蜱、氟氯氰菊酯等農(nóng)藥檢出率較高，應(yīng)當重點關(guān)注和防控。