趙 婷， 張芳菲， 尹建永， 汪年松,2， 王 鋒,2*

1. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200030 2. 上海市第八人民醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200235

糖尿病是一種常見的代謝性疾病，其特征為患者血糖長期高于標(biāo)準(zhǔn)值。2019年，全世界有4.63億成人患糖尿病；國際糖尿病聯(lián)合會(huì)估計(jì)，到2045年全世界范圍內(nèi)將有成年7億糖尿病患者[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，是終末期腎臟疾病的主要原因[2-3]。DN的早期病理變化涉及多種機(jī)制，包括小血管病變、腎小球肥大、腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)增厚和腎小管損害，隨著病程進(jìn)展，最終出現(xiàn)腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的關(guān)鍵組成部分，實(shí)驗(yàn)與臨床研究[4-5]均表明，腎小球足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致糖尿病腎小球硬化癥的主要機(jī)制。目前DN的治療措施有限，血糖控制和血壓控制只能部分緩解DN進(jìn)展，因此，迫切需要尋找DN的治療新靶點(diǎn)和藥物。

腎胺酶是2005年耶魯大學(xué)華人學(xué)者Xü等[6]發(fā)現(xiàn)的一種黃素蛋白，主要表達(dá)在腎臟和心臟，結(jié)構(gòu)中含有單胺氧化酶結(jié)構(gòu)域，可分解兒茶酚胺，調(diào)節(jié)血壓與心血管功能[7]。以往研究[8]表明，腎胺酶對(duì)嚙齒動(dòng)物有強(qiáng)大而快速的降壓作用，可降低心臟的收縮力和心率，提示腎胺酶這種作用可能通過降解循環(huán)兒茶酚胺而介導(dǎo)。

除了作為酶發(fā)揮作用，腎胺酶還有細(xì)胞與組織保護(hù)功能[9-10],在多種急性和慢性腎臟疾病的動(dòng)物模型中均顯示抗凋亡和抗炎作用，可減輕腎臟損傷[11-13]。腎胺酶在完全單側(cè)輸尿管梗阻模型和5/6腎切除模型中顯著減輕慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)纖維化[12,14]，參與局部和遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對(duì)急性腎損傷的保護(hù)作用[15-16]。腎胺酶缺失的腎缺血再灌注(ischemia/reperfusion, IR)的小鼠炎癥和細(xì)胞凋亡增加及顯著腎小管壞死；而重組腎胺酶能改善這些變化[17]。本課題組以往研究[18]發(fā)現(xiàn)，用腎胺酶進(jìn)行預(yù)處理，可減輕對(duì)比劑誘發(fā)的腎病大鼠(contrast-induced nephropathy，CIN)腎功能的惡化，減輕腎小管壞死、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥。另有研究[19]發(fā)現(xiàn)，腎胺酶可改善單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠的腎間質(zhì)纖維化，通過抑制氧化應(yīng)激來發(fā)揮抗纖維化作用。然而，腎胺酶對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷是否有減輕作用尚未明確。本研究通過高糖培養(yǎng)足細(xì)胞并補(bǔ)充腎胺酶，來探討腎胺酶對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 條件性永生的小鼠足細(xì)胞MPC5細(xì)胞系由復(fù)旦大學(xué)兒童醫(yī)院徐虹教授友情贈(zèng)送。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清(FPS，F(xiàn)etal Bovine Serum)購于美國Gibco公司；甘露醇購于美國Sigma-Aldrich公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase購于美國Promega公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司；Trizol購于美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR預(yù)混液購于TaKaRa公司；StepOnePlus PCR Systems購于美國Applied Biosystems公司；caspase-3活性檢測試劑盒購于碧云天公司；Ⅳ型膠原α酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于美國Cloud-Clone公司；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)及單核細(xì)胞趨化因子1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)ELISA試劑盒均購于美國R&D Systems公司；p21 ELISA試劑盒購于英國Abcam公司；重組腎胺酶由本實(shí)驗(yàn)室制備[20]。

1.3 細(xì)胞處理 足細(xì)胞先于33℃、5% CO2培養(yǎng)箱中擴(kuò)增性培養(yǎng)5 d：用含10 U/mL γ-干擾素的RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%滅活FBS、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素)培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)瓶內(nèi)鋪0.1 g/L Ⅰ型膠原并于37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，將上述擴(kuò)增性培養(yǎng)的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶，且培養(yǎng)基不含干擾素，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，促其分化成熟。具體培養(yǎng)方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[21-22]。

將同步化處理(1% FBS培養(yǎng)24 h)的分化成熟的足細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(D-葡萄糖5 mmol/L培養(yǎng))、甘露醇組(D-葡萄糖5 mmol/L+甘露醇25 mmol/L培養(yǎng))、高糖組(D-葡萄糖30 mmol/L培養(yǎng))和腎胺酶處理組(重組腎胺酶蛋白60 μg/mL預(yù)處理6 h+D-葡萄糖30 mmol/L培養(yǎng))。腎胺酶使用濃度經(jīng)既往實(shí)驗(yàn)[13]及Wang等[23]測試為最適濃度。48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Ⅳ型膠原α、TGF-β1、MCP-1與F-actin mRNA檢測 收集各組細(xì)胞以Trizol提取總RNA，用M-MLV Reverse Transcriptase 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用StepOnePlus PCR系統(tǒng)和SYBER Green PCR master Mix實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照說明書配制和設(shè)置。以18s rRNA為內(nèi)參基因。各基因引物序列見表1。

1.5 Caspase-3活性檢測 用胰酶消化各組細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中。離心后收集細(xì)胞，按照每200萬細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰育裂解15 min后離心，取上清測定caspase-3酶的活性。依次加入底物和待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品。caspase-3催化底物Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA，pNA在405 nm附近有強(qiáng)吸收，通過測定吸光度來檢測caspase 3的活性。

表1 各基因引物序列

1.6 Ⅳ型膠原α、TGF-β1和MCP-1蛋白表達(dá)的檢測 細(xì)胞上清1 000×g離心20 min，取上清，分別在預(yù)先包被小鼠Ⅳ型膠原α、TGF-β1和MCP-1蛋白捕獲抗體的微孔中，依次加入待測樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育后徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中的蛋白含量正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度(A值)，計(jì)算樣品濃度。

1.7 p21活性的檢測 采用ELISA試劑盒檢測上清中p21活性，預(yù)先包被小鼠p21捕獲抗體的微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育后徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中的p21活性正相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 足細(xì)胞Ⅳ型膠原α表達(dá)水平 結(jié)果(圖1)表明，與對(duì)照組相比，高糖誘導(dǎo)使足細(xì)胞Ⅳ型膠原α的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；腎胺酶處理足細(xì)胞Ⅳ型膠原α表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。甘露醇組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 腎胺酶使高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞Ⅳ型膠原α表達(dá)水平下調(diào)

2.2 足細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平 結(jié)果(圖2)表明，與對(duì)照組相比，高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；腎胺酶處理使高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。甘露醇組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 足細(xì)胞MCP-1表達(dá)水平 結(jié)果(圖3)表明，與對(duì)照組相比，高糖誘導(dǎo)細(xì)胞MCP-1表達(dá)水平增高(P<0.05)；腎胺酶處理使高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞MCP-1表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。甘露醇組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 足細(xì)胞p21的活性 結(jié)果(圖4)表明，與對(duì)照組相比，高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞p21活性增強(qiáng)(P<0.05)；腎胺酶使高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞p21活性降低(P<0.05)。甘露醇組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 腎胺酶使高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平下調(diào)

圖3 腎胺酶使高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞MCP-1表達(dá)水平下調(diào)

圖4 腎胺酶下調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞p21活性

2.5 足細(xì)胞caspase-3活性 結(jié)果(圖5)表明，與對(duì)照組相比，高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞caspase-3活性顯著升高(P<0.05)；腎胺酶下調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞caspase-3活性(P<0.05)。甘露醇組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 足細(xì)胞F-actin表達(dá)比較 結(jié)果(圖6)表明，各組足細(xì)胞骨架蛋白F-actin mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 腎胺酶下調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞caspase-3活性

圖6 各組足細(xì)胞F-actin表達(dá)情況

3 討 論

DN已成為全球范圍內(nèi)終末期腎病的主要原因之一。臨床以蛋白尿、高血壓和腎功能的逐漸喪失為特征。DN一旦發(fā)展到終末期腎病甚至腎衰竭，將需要進(jìn)行替代治療，這對(duì)患者和社會(huì)來說都是非常大的負(fù)擔(dān)。因此，探尋其更加有效的治療方式極為迫切。

病理上，DN主要體現(xiàn)在細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、腎小球基底膜增厚、腎小球增殖性變化以及腎小管萎縮，最終導(dǎo)致不可逆的腎小球硬化和間質(zhì)纖維化，這也是多種腎臟疾病的最終共同途徑[24]。足細(xì)胞即腎小囊臟層上皮細(xì)胞，附著于腎小球基底膜的外側(cè)，連同血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基底膜構(gòu)成了腎小球血液濾過屏障。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的關(guān)鍵組成部分，也是產(chǎn)生膠原的重要細(xì)胞之一，容易受到多種因素的損傷[25-26]。足細(xì)胞損傷和凋亡在DN的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[27]。在DN中，足細(xì)胞損傷伴隨復(fù)雜的生物學(xué)變化，包括細(xì)胞代謝異常和細(xì)胞完整性丟失及凋亡。足細(xì)胞形態(tài)變化主要包括足細(xì)胞肥大、足細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、足細(xì)胞脫離和凋亡[28]。足細(xì)胞損傷最終導(dǎo)致蛋白尿，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)成分的積聚和腎小球硬化[29]。

本研究采用體外高糖培養(yǎng)足細(xì)胞，模擬了DN的生理環(huán)境，并用腎胺酶重組蛋白預(yù)處理足細(xì)胞以研究其作用。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，且Ⅳ型膠原是基底膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組成成分。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖刺激下，足細(xì)胞Ⅳ型膠原α表達(dá)水平顯著增加，而腎胺酶可降低足細(xì)胞Ⅳ型膠原α表達(dá)水平，減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚。本研究還證明腎胺酶可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，可顯著降低足細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活性，這與Wang等[23]的研究結(jié)果一致。

TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子β細(xì)胞因子超家族的多肽成員，具有控制細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞功能。以往研究[30]證明糖尿病環(huán)境增強(qiáng)氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)。TGF-β1誘導(dǎo)ECM的過量產(chǎn)生和抑制ECM的降解，是導(dǎo)致大多數(shù)慢性腎臟病纖維化的主要細(xì)胞因子[31]。TGF-β1還通過增加腎小球通透性和減少近段小管的重吸收來調(diào)節(jié)尿白蛋白排泄和誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[32-33]。此外，TGF-β1還是促進(jìn)足細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞因子之一[34]。與上述結(jié)論一致，本研究證明高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞TGF-β1表達(dá)顯著增加，而重組腎胺酶可抑制高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞TGF-β1表達(dá)。

單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是DN腎臟中最豐富的浸潤細(xì)胞[35]。趨化因子及其受體在免疫細(xì)胞向腎臟組織的遷移中起關(guān)鍵作用，其中重要的趨化因子之一為MCP-1。MCP-1趨化單核細(xì)胞到腎臟，介導(dǎo)腎臟炎癥和纖維化[36-37]，是識(shí)別腎纖維化危險(xiǎn)的潛在生物標(biāo)志物[38-39]。MCP-1可反映DN中腎小管損傷和腎臟炎癥的水平[40]，是預(yù)測DN進(jìn)展的重要因子[41-42]。同樣地，本研究證明腎胺酶可顯著降低高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞MCP-1表達(dá)水平。

足細(xì)胞肥大是糖尿病腎病最早的腎小球形態(tài)變化之一，在DN的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[43-44]。其中p21又叫p21Waf1/Cip1，也稱為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1，能夠抑制細(xì)胞周期蛋白，干擾細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞周期停滯，導(dǎo)致細(xì)胞肥大[45-46]。p21在DN的腎小球肥大中起關(guān)鍵作用[47]。p21還與腎臟纖維化密切相關(guān)。研究[48]表明p21基因敲除可顯著抑制腎臟纖維化，降低TGF-β表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞中p21活性增加，腎胺酶可顯著抑制該效應(yīng)。因此腎胺酶可能通過抑制p21活性恢復(fù)足細(xì)胞細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞肥大和減輕纖維化。

綜上所述，本研究利用體外試驗(yàn)證實(shí)腎胺酶可減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷和凋亡，可能與抑制炎癥、纖維化和p21活性有關(guān)。因此，腎胺酶可能具有保護(hù)腎功能的作用，為臨床治療DN提供了新的思路。然而，本研究僅限于體外試驗(yàn)，且暫時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)高糖和腎胺酶對(duì)足細(xì)胞骨架蛋白的影響，因此，腎胺酶對(duì)DN患者腎功能的保護(hù)作用以及其詳細(xì)機(jī)制尚需要進(jìn)一步探究。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。