亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        BMAL1對H2O2誘導的H9C2心肌細胞損傷的影響及機制探討

        2021-08-26 08:03:08易娜袁李禮
        天津醫(yī)藥 2021年8期
        關鍵詞:心肌細胞氧化應激活力

        易娜 ,袁李禮

        隨著經濟發(fā)展、居民生活方式轉變和人口老齡化加速,我國心血管疾病的患病率和死亡率呈逐年遞增趨勢[1]。研究顯示,心血管疾病的急性發(fā)作發(fā)病時間和嚴重程度具有晝夜變化的特點,生物鐘基因表達的改變參與心血管疾病的病理生理過程[2]。腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1(brain and muscle Ah receptor nuclear translocator protein-like-1,BMAL1)作為晝夜節(jié)律系統(tǒng)的核心基因之一,調控生物鐘基因的轉錄[3]。因此,探討B(tài)MAL1 對心血管疾病的調控機制有助于尋找新的心肌細胞保護策略和靶點。氧化應激是心血管疾病的發(fā)病機制之一,心血管疾病發(fā)作時機體會產生大量的氧自由基,導致氧化應激損傷,因此抑制氧化應激有助于改善心肌損傷[4]。核因子E2 相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,NRF2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)信號軸是調控氧化應激性疾病的重要靶點[5]。目前,BMAL1 是否通過調控NRF2/HO-1 信號軸而改善心血管疾病發(fā)作時的細胞損傷和氧化應激尚不清楚。本研究構建了過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導的H9C2 大鼠心肌細胞損傷模型,探討節(jié)律基因BMAL1對心肌細胞損傷、氧化應激以及NRF2/HO-1 信號軸的影響,為揭示BMAL1在心血管疾病中的分子機制提供實驗依據。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料和儀器 H9C2大鼠心肌細胞購自中國科學院上海細胞庫,DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、胰酶和雙抗購自Gibco 公司;CCK-8檢測試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司;超氧化物 歧 化 酶(superoxide dismutase,SOD)和 丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;BMAL1過表達慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司;NRF2 抑制劑 ML385 和 HO-1 抑制劑 Znpp 購自selleck 公司;兔抗 BMAL1、NRF2、HO-1 和 GAPDH 抗體以及羊抗兔二抗購自Abcam公司;RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、熒光定量 PCR(qPCR)試劑盒購自 TAKARA 公司;BMAL1和GAPDH引物購自湖南擎科生物技術有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱為 Thermo 產品;酶標儀為 Biotek 產品;qPCR 儀為Applied Biosystems 產品;蛋白電泳分離、轉膜和成像系統(tǒng)為Bio-Rad產品。

        1.2 細胞培養(yǎng)和模型構建 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2 心肌細胞,選取狀態(tài)良好的對數生長期細胞開展實驗。用終濃度為0.2 mmol/L的H2O2誘導H9C2細胞構建損傷模型,處理24 h后進行后續(xù)實驗。

        1.3 BMAL1 穩(wěn)定過表達的 H9C2 細胞構建 將 1×106個H9C2 細胞接種于直徑60 mm 細胞培養(yǎng)皿,待培養(yǎng)24 h 后加入30 μL BMAL1 慢病毒進行感染,48 h 后更換細胞培養(yǎng)液,用含2 mg/L 嘌呤霉素的細胞培養(yǎng)液進行篩選,每隔2~3 d 進行細胞傳代,培養(yǎng)2 周后獲得BMAL1 穩(wěn)定過表達的H9C2細胞。

        1.4 實驗分組

        1.4.1 實驗1 取對數生長期H9C2細胞分為對照組、H2O2組(0.2 mmol/L 的H2O2處理24 h)、BMAL1 過表達(BMAL1-OE)組(過表達BMAL1病毒感染)、BMAL1過表達+H2O2(BMAL1-OE+H2O2)組(過表達 BMAL1 病毒感染,再用 0.2 mmol/L 的H2O2處理24 h)。

        1.4.2 實驗2 取對數生長期的H9C2 細胞分為H2O2組(0.2 mmol/L 的 H2O2處 理 24 h)、BMAL1 過 表 達 +H2O2(BMAL1-OE+H2O2)組(過表達 BMAL1 病毒感染,再用0.2 mmol/L 的 H2O2處理 24 h)、BMAL1 過表達+抑制 NRF2+H2O2(BMAL1-OE+ML385+H2O2)組(過表達 BMAL1 病毒感染,用 NRF2 抑制劑 2 μmol/L 的 ML385 預處理 24 h 后用0.2 mmol/L 的 H2O2處理 24 h)、BMAL1 過表達+抑制 HO-1+H2O2(BMAL1-OE+Znpp+H2O2)組(過表達BMAL1 病毒感染,用HO-1抑制劑5 μmol/L的Znpp預處理24 h后用0.2 mmol/L的H2O2處理24 h)。

        1.5 qPCR 法 驗 證 BMAL1-OE 組BMAL1mRNA 表 達 情況 另取 H9C2 細胞按 5×105個/孔接種于 6 孔板,按 1.4.1對照組和BMAL1-OE 組方案分組進行干預,24 h 后收集細胞,經RNAiso Plus 裂解后提取細胞總RNA,逆轉錄成cDNA 后,分別使用特異性引物進行qPCR 擴增分析。BMAL1引物:上游5'-GCCACTGACTACCAAGAAAG-3',下游5'-GTTCATTTTGTCCCGACGCC-3';GAPDH引物:上游 5'-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3',下游 5'-ATGAAGGGGTCGTTGATGGC-3'。以GAPDH為內參,使用相對定量 2-ΔΔCT法計算BMAL1的相對表達水平。

        1.6 CCK-8法檢測細胞活力 H9C2細胞按8 000個/孔接種于96 孔板,按照2 種實驗方案分別對細胞進行干預,24 h 后每孔中加入 10 μL 的 CCK-8 試劑,于 37 ℃孵育 1 h 后測定450 nm 吸光度(A450)值,計算各組細胞相對活力(%)=[A450(實驗組)-A45(0空白)][/A45(0對照組)-A45(0空白)]×100%。

        1.7 細胞上清SOD 和MDA 氧化應激狀態(tài)檢測 另取H9C2細胞按8 000個細胞/孔接種于96孔板,按照2種實驗方案分別對細胞進行干預,24 h 后收集細胞上清液,采用羥胺法檢測SOD活性、TBA法檢測MDA含量,所有操作均按試劑說明書進行。

        1.8 Western blot 法檢測實驗1中各組細胞BMAL1、NRF2和HO-1 蛋白表達 另取 H9C2 細胞按 5×105個/孔接種于 6 孔板,按照1.4.1分組干預,24 h后收集各組H9C2細胞用PBS清洗3次,RIPA裂解液提取總蛋白,BCA蛋白定量后煮沸變性。配置12%的SDS-PAGE,各泳道加入30 μg總蛋白電泳分離,轉印至PVDF 膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h,加入兔抗鼠一抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜,羊抗兔二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h,ECL 化學發(fā)光后成像系統(tǒng)采集,用Image J V1.5 分析條帶灰度值(V),以GAPDH作為內參,分析目的蛋白相對表達水平,各組目的蛋白相對表達水平=[V(各組目的蛋白灰度值)/V(各組GAPDH 灰度值)]÷[V(對照組目的蛋白灰度值)/V(對照組GAPDH灰度值)]。

        1.9 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量數據用表示,2 組間比較用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用Bonferroni校正的t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 實驗1

        2.1.1 H9C2細胞BMAL1過表達效果 與Control組相比,BMAL1-OE 組BMAL1mRNA 表達水平升高(1.02±0.07和4.21±0.25;n=6,t=29.660,P<0.01)。

        2.1.2 BMAL1 過表達對各組細胞損傷和氧化應激的影響 與Control 組相比,H2O2組H9C2 細胞活力和細胞上清液SOD 活性降低,MDA 含量增加(P<0.05);與 H2O2組相比,BMAL1-OE+H2O2組 H9C2 細胞活力和細胞上清液SOD活性增加,MDA含量降低(P<0.05);與BMAL1-OE組相比,BMAL1-OE+H2O2組H9C2 細胞活力和細胞上清液SOD 活性降低,而MDA含量增加(P<0.05),見表1。

        Tab.1 Comparison of cell viability,SOD activity and MDA content between the four groups表1 實驗1中各組細胞活力、SOD活性、MAD含量的比較(n=6,)

        Tab.1 Comparison of cell viability,SOD activity and MDA content between the four groups表1 實驗1中各組細胞活力、SOD活性、MAD含量的比較(n=6,)

        **P<0.01;a與Control組比較,b與H2O2組比較,c與BMAL1-OE組比較,P<0.05;BMAL1-OE組與Control 組、H2O2組無需比較,未作標記;表2同

        組別Control組H2O2組BMAL1-OE組BMAL1-OE+H2O2組F細胞活力(%)101.30±2.65 60.01±2.58a 96.97±3.71 77.99±2.30bc 263.800**SOD活性(U/L)33.47±2.75 16.60±0.80a 35.81±4.87 24.26±2.45bc 64.700**MDA含量(μmol/L)4.14±0.80 6.92±0.83a 3.94±0.72 5.37±0.81bc 18.250**

        2.1.3 各組NRF2 和HO-1 蛋白相對表達水平比較 與 Control 組相比,H2O2組 H9C2 細胞 BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達水平均降低(P<0.05);與 H2O2組 相 比 ,BMAL1-OE+H2O2組 H9C2 細 胞BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達水平增加(P<0.05),見圖1、表2。

        Fig.1 Comparison of BMAL1,NRF2 and HO-1 protein expression between the four groups圖1 各組BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達水平比較

        Tab.2 Comparison of BMAL1,NRF2 and HO-1 protein expression between the four groups表2 各組細胞BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達水平比較 (n=6,)

        Tab.2 Comparison of BMAL1,NRF2 and HO-1 protein expression between the four groups表2 各組細胞BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達水平比較 (n=6,)

        組別Control組H2O2組BMAL1-OE組BMAL1-OE+H2O2組F蛋白相對表達水平BMAL1 1.00±0.13 0.61±0.10a 1.69±0.21 1.40±0.17b 53.260**NRF2 1.00±0.23 0.56±0.13a 1.53±0.29 1.11±0.21b 19.980**HO-1 1.00±0.19 0.49±0.11a 1.38±0.21 1.03±0.06b 33.650**

        2.2 實驗 2 與 H2O2組相比,BMAL1-OE+H2O2組H9C2 細胞活力和細胞上清液SOD 活性增加,MDA含量降低(P<0.05);與BMAL1-OE+H2O2組相比,BMAL1-OE+ML385+H2O2組和BMAL1-OE+Znpp+H2O2組H9C2 細胞活力和細胞上清液SOD 活性降低,MDA含量增加(P<0.05),見表3。

        Tab.3 Comparison of cell viability,SOD activity and MDA content between the four groups表3 實驗2中各組細胞活力、SOD活性、MAD含量的比較(n=6,)

        Tab.3 Comparison of cell viability,SOD activity and MDA content between the four groups表3 實驗2中各組細胞活力、SOD活性、MAD含量的比較(n=6,)

        **P<0.01;a與H2O2組比較,b與BMAL1-OE+H2O2組比較,P<0.05

        組別H2O2組BMAL1-OE+H2O2組BMAL1-OE+ML385+H2O2組BMAL1-OE+Znpp+H2O2組F細胞活力(%)54.62±6.20 79.58±8.79a 65.33±4.58ab 65.09±3.72ab 16.750**SOD活性(U/L)12.86±2.10 28.20±3.24a 21.45±2.52ab 20.58±1.42ab 40.720**MDA含量(μmol/L)6.96±0.85 4.84±0.63a 6.16±0.31b 6.25±0.63b 11.600**

        3 討論

        晝夜節(jié)律變化在生命體中廣泛存在,主要由生物鐘基因調控。研究顯示,生物鐘與心血管的生理功能關系密切,血壓和心率的周期變化受控于生物鐘,生物鐘的失調會對心血管功能產生不利影響[6]。生物鐘的疾病機制研究,對心血管疾病的防治是一個新的研究切入點[7]。BMAL1是生物鐘節(jié)律調控的核心基因之一,其基因敲除后會導致節(jié)律喪失,對血壓、心率和活動度產生重要影響[8]。本研究結果顯示,與Control組相比,H9C2細胞感染BMAL1過表達慢病毒后BMAL1mRNA 表達水平升高,表明成功地構建了穩(wěn)定過表達BMAL1的心肌細胞系。

        H2O2作為構建心肌細胞損傷體外模型的常用方法,也是心血管疾病研究的重要工具[9]。本研究結果顯示,與Control 組相比,H2O2組H9C2細胞活力降低,而BMAL1-OE+H2O2組細胞活力則顯著高于H2O2組,提示 BMAL1 可減輕 H2O2誘導的 H9C2 細胞損傷,BMAL1 能夠對抗心肌損傷發(fā)揮保護作用,與既往在糖尿病大鼠心肌損傷中BMAL1 的研究結果一致[10]。

        氧化應激與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系,其所導致的心肌細胞損傷是疾病發(fā)生重要機制之一[11]。SOD作為生物體內存在的一種抗氧化酶,是清除自由基的重要分子;而MDA 則是脂質過氧化的重要產物之一,SOD和MDA被認為是反映生物體氧化應激狀態(tài)的重要指標[12]。氧化應激水平同樣具有晝夜節(jié)律性,生物鐘基因和氧化應激均能參與調控心血管疾?。?3]。本研究結果顯示,與Control 組相比,H2O2組細胞上清液SOD 活性降低,MDA含量增加;與H2O2組相比,BMAL1-OE+H2O2組細胞上清液SOD 活性增加,MDA 含量降低,提示BMAL1 能對抗H2O2所誘導的氧化應激,這與Xie等[14-15]報道的敲低BMAL1能促進氧化應激,誘導動脈粥樣硬化或胰島β 細胞凋亡的結果相類似,表明BMAL1能夠減輕氧化應激損傷。

        NRF2/HO-1 信號軸為氧化應激調控中重要的信號通路,BMAL1能夠和NRF2協(xié)同作用,從而調控氧化還原穩(wěn)態(tài)[16]。本研究結果顯示,與Control 組相比,H2O2組 NRF2 和 HO-1 蛋白表達受到抑制,而BMAL1過表達則能促進NRF2和HO-1的蛋白表達。因此,筆者認為BMAL1可能通過NRF2/HO-1途徑,調控心肌細胞損傷和氧化應激。為了證實BMAL1是否通過NRF2/HO-1 發(fā)揮調控作用,本研究采用NRF2 抑制劑 ML385 或 HO-1 抑制劑 Znpp 分別進行干預。由于ML385和Znpp均為公認的抑制劑,兩者對于NRF2和HO-1的抑制效果是明確的。因此,本研究未對各組中NRF2 和HO-1 的蛋白表達進行驗證。本研究結果表明,抑制NRF2 或HO-1 后,BMAL1 的細胞保護和抗氧化作用均減弱,提示BMAL1 可通過NRF2/HO-1 信號軸減輕H2O2誘導的H9C2 細胞損傷和氧化應激。這與既往研究報道中的巨噬細胞 BMAL1 能調控 NRF2 的結果相類似[17]。然而BMAL1 對于心血管疾病相關的心肌細胞和內皮細胞的研究尚鮮見報道。研究顯示,BMAL1作為一種核轉錄因子,能與E-Box 元件(nCACGTGn)相結合而調控靶基因轉錄;大鼠NRF2啟動子序列中均含有該序列元件,其機制可能是BMAL1通過轉錄調控NRF2使NRF2/HO-1 信號軸活化,從而抵抗氧化應激損傷[18]。

        綜上所述,節(jié)律基因BMAL1可減輕H2O2誘導的大鼠心肌細胞損傷和氧化應激,從而發(fā)揮其心肌細胞保護作用。其機制可能與調控NRF2/HO-1 信號軸有關。

        猜你喜歡
        心肌細胞氧化應激活力
        左歸降糖舒心方對糖尿病心肌病MKR鼠心肌細胞損傷和凋亡的影響
        活血解毒方對缺氧/復氧所致心肌細胞凋亡的影響
        活力
        當代陜西(2020年9期)2020-08-04 06:25:33
        基于炎癥-氧化應激角度探討中藥對新型冠狀病毒肺炎的干預作用
        心肌細胞慢性缺氧適應性反應的研究進展
        改制增添活力
        氧化應激與糖尿病視網膜病變
        槲皮素通過抑制蛋白酶體活性減輕心肌細胞肥大
        收回編制 激發(fā)活力
        氧化應激與結直腸癌的關系
        国产乱了真实在线观看| 国产成人自拍视频在线观看网站| 精品中文字幕精品中文字幕| 水蜜桃在线观看一区二区| 少妇aaa级久久久无码精品片| 欧美成人三级一区二区在线观看| 狠狠亚洲超碰狼人久久老人| 香蕉久久福利院| 国产精品亚洲一区二区杨幂| 性感人妻av在线播放| 虎白女粉嫩粉嫩的18在线观看| 美女视频黄是免费| 天码人妻一区二区三区| 亚洲AV无码国产成人久久强迫| 日韩人妻免费一区二区三区| 亚洲一区在线观看中文字幕| 一本色综合久久| 亚洲成a∨人片在线观看无码| 国产在线视频一区二区三| 日韩欧美在线综合网另类| 最近中文字幕mv在线资源| 国产久视频| 一本色道久久88加勒比综合 | 国产激情无码一区二区三区| 亚洲人成网站免费播放| 亚洲黄片高清在线观看| 美女人妻中出日本人妻| 国产精品狼人久久久久影院 | 亚洲国产精品日韩av专区| 91精品国产91| 中文字幕午夜精品一区二区三区| 国产午夜手机精彩视频| 全免费a级毛片免费看视频| 青青草视频国产在线观看| 日本一区二区在线免费视频| 好屌草这里只有精品| 久久精品国产只有精品96| 国产麻豆一区二区三区在| 国产精品无码aⅴ嫩草| 亚洲一区二区在线| 伊人狼人激情综合影院|