易娜 ，袁李禮

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、居民生活方式轉(zhuǎn)變和人口老齡化加速，我國心血管疾病的患病率和死亡率呈逐年遞增趨勢［1］。研究顯示，心血管疾病的急性發(fā)作發(fā)病時(shí)間和嚴(yán)重程度具有晝夜變化的特點(diǎn)，生物鐘基因表達(dá)的改變參與心血管疾病的病理生理過程［2］。腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1（brain and muscle Ah receptor nuclear translocator protein-like-1，BMAL1）作為晝夜節(jié)律系統(tǒng)的核心基因之一，調(diào)控生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄［3］。因此，探討B(tài)MAL1 對心血管疾病的調(diào)控機(jī)制有助于尋找新的心肌細(xì)胞保護(hù)策略和靶點(diǎn)。氧化應(yīng)激是心血管疾病的發(fā)病機(jī)制之一，心血管疾病發(fā)作時(shí)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，因此抑制氧化應(yīng)激有助于改善心肌損傷［4］。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號軸是調(diào)控氧化應(yīng)激性疾病的重要靶點(diǎn)［5］。目前，BMAL1 是否通過調(diào)控NRF2/HO-1 信號軸而改善心血管疾病發(fā)作時(shí)的細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激尚不清楚。本研究構(gòu)建了過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)的H9C2 大鼠心肌細(xì)胞損傷模型，探討節(jié)律基因BMAL1對心肌細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激以及NRF2/HO-1 信號軸的影響，為揭示BMAL1在心血管疾病中的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 H9C2大鼠心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、胰酶和雙抗購自Gibco 公司；CCK-8檢測試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技有限公司；超氧化物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）和 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BMAL1過表達(dá)慢病毒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；NRF2 抑制劑 ML385 和 HO-1 抑制劑 Znpp 購自selleck 公司；兔抗 BMAL1、NRF2、HO-1 和 GAPDH 抗體以及羊抗兔二抗購自Abcam公司；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量 PCR（qPCR）試劑盒購自 TAKARA 公司；BMAL1和GAPDH引物購自湖南擎科生物技術(shù)有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱為 Thermo 產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為 Biotek 產(chǎn)品；qPCR 儀為Applied Biosystems 產(chǎn)品；蛋白電泳分離、轉(zhuǎn)膜和成像系統(tǒng)為Bio-Rad產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和模型構(gòu)建 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2 心肌細(xì)胞，選取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)。用終濃度為0.2 mmol/L的H2O2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞構(gòu)建損傷模型，處理24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 BMAL1 穩(wěn)定過表達(dá)的 H9C2 細(xì)胞構(gòu)建 將 1×106個(gè)H9C2 細(xì)胞接種于直徑60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)24 h 后加入30 μL BMAL1 慢病毒進(jìn)行感染，48 h 后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，用含2 mg/L 嘌呤霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每隔2～3 d 進(jìn)行細(xì)胞傳代，培養(yǎng)2 周后獲得BMAL1 穩(wěn)定過表達(dá)的H9C2細(xì)胞。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

1.4.1 實(shí)驗(yàn)1 取對數(shù)生長期H9C2細(xì)胞分為對照組、H2O2組（0.2 mmol/L 的H2O2處理24 h）、BMAL1 過表達(dá)（BMAL1-OE）組（過表達(dá)BMAL1病毒感染）、BMAL1過表達(dá)+H2O2（BMAL1-OE+H2O2）組（過表達(dá) BMAL1 病毒感染，再用 0.2 mmol/L 的H2O2處理24 h）。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)2 取對數(shù)生長期的H9C2 細(xì)胞分為H2O2組（0.2 mmol/L 的 H2O2處 理 24 h）、BMAL1 過 表 達(dá) +H2O2（BMAL1-OE+H2O2）組（過表達(dá) BMAL1 病毒感染，再用0.2 mmol/L 的 H2O2處理 24 h）、BMAL1 過表達(dá)+抑制 NRF2+H2O2（BMAL1-OE+ML385+H2O2）組（過表達(dá) BMAL1 病毒感染，用 NRF2 抑制劑 2 μmol/L 的 ML385 預(yù)處理 24 h 后用0.2 mmol/L 的 H2O2處理 24 h）、BMAL1 過表達(dá)+抑制 HO-1+H2O2（BMAL1-OE+Znpp+H2O2）組（過表達(dá)BMAL1 病毒感染，用HO-1抑制劑5 μmol/L的Znpp預(yù)處理24 h后用0.2 mmol/L的H2O2處理24 h）。

1.5 qPCR 法 驗(yàn) 證 BMAL1-OE 組BMAL1mRNA 表 達(dá) 情況 另取 H9C2 細(xì)胞按 5×105個(gè)/孔接種于 6 孔板，按 1.4.1對照組和BMAL1-OE 組方案分組進(jìn)行干預(yù)，24 h 后收集細(xì)胞，經(jīng)RNAiso Plus 裂解后提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，分別使用特異性引物進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增分析。BMAL1引物：上游5'-GCCACTGACTACCAAGAAAG-3'，下游5'-GTTCATTTTGTCCCGACGCC-3'；GAPDH引物：上游 5'-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3'，下游 5'-ATGAAGGGGTCGTTGATGGC-3'。以GAPDH為內(nèi)參，使用相對定量 2-ΔΔCT法計(jì)算BMAL1的相對表達(dá)水平。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 H9C2細(xì)胞按8 000個(gè)/孔接種于96 孔板，按照2 種實(shí)驗(yàn)方案分別對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，24 h 后每孔中加入 10 μL 的 CCK-8 試劑，于 37 ℃孵育 1 h 后測定450 nm 吸光度（A450）值，計(jì)算各組細(xì)胞相對活力（%）=［A450（實(shí)驗(yàn)組）-A45（0空白）］［/A45（0對照組）-A45（0空白）］×100%。

1.7 細(xì)胞上清SOD 和MDA 氧化應(yīng)激狀態(tài)檢測 另取H9C2細(xì)胞按8 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，按照2種實(shí)驗(yàn)方案分別對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，24 h 后收集細(xì)胞上清液，采用羥胺法檢測SOD活性、TBA法檢測MDA含量，所有操作均按試劑說明書進(jìn)行。

1.8 Western blot 法檢測實(shí)驗(yàn)1中各組細(xì)胞BMAL1、NRF2和HO-1 蛋白表達(dá) 另取 H9C2 細(xì)胞按 5×105個(gè)/孔接種于 6 孔板，按照1.4.1分組干預(yù)，24 h后收集各組H9C2細(xì)胞用PBS清洗3次，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量后煮沸變性。配置12%的SDS-PAGE，各泳道加入30 μg總蛋白電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗鼠一抗（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，羊抗兔二抗（1∶4 000）室溫孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光后成像系統(tǒng)采集，用Image J V1.5 分析條帶灰度值（V），以GAPDH作為內(nèi)參，分析目的蛋白相對表達(dá)水平，各組目的蛋白相對表達(dá)水平=［V（各組目的蛋白灰度值）/V（各組GAPDH 灰度值）］÷［V（對照組目的蛋白灰度值）/V（對照組GAPDH灰度值）］。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用表示，2 組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)1

2.1.1 H9C2細(xì)胞BMAL1過表達(dá)效果 與Control組相比，BMAL1-OE 組BMAL1mRNA 表達(dá)水平升高（1.02±0.07和4.21±0.25；n=6，t=29.660，P＜0.01）。

2.1.2 BMAL1 過表達(dá)對各組細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激的影響 與Control 組相比，H2O2組H9C2 細(xì)胞活力和細(xì)胞上清液SOD 活性降低，MDA 含量增加（P＜0.05）；與 H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組 H9C2 細(xì)胞活力和細(xì)胞上清液SOD活性增加，MDA含量降低（P＜0.05）；與BMAL1-OE組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9C2 細(xì)胞活力和細(xì)胞上清液SOD 活性降低，而MDA含量增加（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of cell viability,SOD activity and MDA content between the four groups表1 實(shí)驗(yàn)1中各組細(xì)胞活力、SOD活性、MAD含量的比較（n=6，）

Tab.1 Comparison of cell viability,SOD activity and MDA content between the four groups表1 實(shí)驗(yàn)1中各組細(xì)胞活力、SOD活性、MAD含量的比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與H2O2組比較，c與BMAL1-OE組比較，P＜0.05；BMAL1-OE組與Control 組、H2O2組無需比較，未作標(biāo)記；表2同

組別Control組H2O2組BMAL1-OE組BMAL1-OE+H2O2組F細(xì)胞活力（%）101.30±2.65 60.01±2.58a 96.97±3.71 77.99±2.30bc 263.800＊＊SOD活性（U/L）33.47±2.75 16.60±0.80a 35.81±4.87 24.26±2.45bc 64.700＊＊MDA含量（μmol/L）4.14±0.80 6.92±0.83a 3.94±0.72 5.37±0.81bc 18.250＊＊

2.1.3 各組NRF2 和HO-1 蛋白相對表達(dá)水平比較 與 Control 組相比，H2O2組 H9C2 細(xì)胞 BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；與 H2O2組 相 比 ，BMAL1-OE+H2O2組 H9C2 細(xì) 胞BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達(dá)水平增加（P＜0.05），見圖1、表2。

Fig.1 Comparison of BMAL1,NRF2 and HO-1 protein expression between the four groups圖1 各組BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達(dá)水平比較

Tab.2 Comparison of BMAL1,NRF2 and HO-1 protein expression between the four groups表2 各組細(xì)胞BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達(dá)水平比較 （n=6，）

Tab.2 Comparison of BMAL1,NRF2 and HO-1 protein expression between the four groups表2 各組細(xì)胞BMAL1、NRF2和HO-1蛋白相對表達(dá)水平比較 （n=6，）

組別Control組H2O2組BMAL1-OE組BMAL1-OE+H2O2組F蛋白相對表達(dá)水平BMAL1 1.00±0.13 0.61±0.10a 1.69±0.21 1.40±0.17b 53.260＊＊NRF2 1.00±0.23 0.56±0.13a 1.53±0.29 1.11±0.21b 19.980＊＊HO-1 1.00±0.19 0.49±0.11a 1.38±0.21 1.03±0.06b 33.650＊＊

2.2 實(shí)驗(yàn) 2 與 H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9C2 細(xì)胞活力和細(xì)胞上清液SOD 活性增加，MDA含量降低（P＜0.05）；與BMAL1-OE+H2O2組相比，BMAL1-OE+ML385+H2O2組和BMAL1-OE+Znpp+H2O2組H9C2 細(xì)胞活力和細(xì)胞上清液SOD 活性降低，MDA含量增加（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of cell viability,SOD activity and MDA content between the four groups表3 實(shí)驗(yàn)2中各組細(xì)胞活力、SOD活性、MAD含量的比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of cell viability,SOD activity and MDA content between the four groups表3 實(shí)驗(yàn)2中各組細(xì)胞活力、SOD活性、MAD含量的比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與H2O2組比較，b與BMAL1-OE+H2O2組比較，P＜0.05

組別H2O2組BMAL1-OE+H2O2組BMAL1-OE+ML385+H2O2組BMAL1-OE+Znpp+H2O2組F細(xì)胞活力（%）54.62±6.20 79.58±8.79a 65.33±4.58ab 65.09±3.72ab 16.750＊＊SOD活性（U/L）12.86±2.10 28.20±3.24a 21.45±2.52ab 20.58±1.42ab 40.720＊＊MDA含量（μmol/L）6.96±0.85 4.84±0.63a 6.16±0.31b 6.25±0.63b 11.600＊＊

3 討論

晝夜節(jié)律變化在生命體中廣泛存在，主要由生物鐘基因調(diào)控。研究顯示，生物鐘與心血管的生理功能關(guān)系密切，血壓和心率的周期變化受控于生物鐘，生物鐘的失調(diào)會(huì)對心血管功能產(chǎn)生不利影響［6］。生物鐘的疾病機(jī)制研究，對心血管疾病的防治是一個(gè)新的研究切入點(diǎn)［7］。BMAL1是生物鐘節(jié)律調(diào)控的核心基因之一，其基因敲除后會(huì)導(dǎo)致節(jié)律喪失，對血壓、心率和活動(dòng)度產(chǎn)生重要影響［8］。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，H9C2細(xì)胞感染BMAL1過表達(dá)慢病毒后BMAL1mRNA 表達(dá)水平升高，表明成功地構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)BMAL1的心肌細(xì)胞系。

H2O2作為構(gòu)建心肌細(xì)胞損傷體外模型的常用方法，也是心血管疾病研究的重要工具［9］。本研究結(jié)果顯示，與Control 組相比，H2O2組H9C2細(xì)胞活力降低，而BMAL1-OE+H2O2組細(xì)胞活力則顯著高于H2O2組，提示 BMAL1 可減輕 H2O2誘導(dǎo)的 H9C2 細(xì)胞損傷，BMAL1 能夠?qū)剐募p傷發(fā)揮保護(hù)作用，與既往在糖尿病大鼠心肌損傷中BMAL1 的研究結(jié)果一致［10］。

氧化應(yīng)激與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，其所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷是疾病發(fā)生重要機(jī)制之一［11］。SOD作為生物體內(nèi)存在的一種抗氧化酶，是清除自由基的重要分子；而MDA 則是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物之一，SOD和MDA被認(rèn)為是反映生物體氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)［12］。氧化應(yīng)激水平同樣具有晝夜節(jié)律性，生物鐘基因和氧化應(yīng)激均能參與調(diào)控心血管疾?。?3］。本研究結(jié)果顯示，與Control 組相比，H2O2組細(xì)胞上清液SOD 活性降低，MDA含量增加；與H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組細(xì)胞上清液SOD 活性增加，MDA 含量降低，提示BMAL1 能對抗H2O2所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，這與Xie等［14-15］報(bào)道的敲低BMAL1能促進(jìn)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化或胰島β 細(xì)胞凋亡的結(jié)果相類似，表明BMAL1能夠減輕氧化應(yīng)激損傷。

NRF2/HO-1 信號軸為氧化應(yīng)激調(diào)控中重要的信號通路，BMAL1能夠和NRF2協(xié)同作用，從而調(diào)控氧化還原穩(wěn)態(tài)［16］。本研究結(jié)果顯示，與Control 組相比，H2O2組 NRF2 和 HO-1 蛋白表達(dá)受到抑制，而BMAL1過表達(dá)則能促進(jìn)NRF2和HO-1的蛋白表達(dá)。因此，筆者認(rèn)為BMAL1可能通過NRF2/HO-1途徑，調(diào)控心肌細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激。為了證實(shí)BMAL1是否通過NRF2/HO-1 發(fā)揮調(diào)控作用，本研究采用NRF2 抑制劑 ML385 或 HO-1 抑制劑 Znpp 分別進(jìn)行干預(yù)。由于ML385和Znpp均為公認(rèn)的抑制劑，兩者對于NRF2和HO-1的抑制效果是明確的。因此，本研究未對各組中NRF2 和HO-1 的蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果表明，抑制NRF2 或HO-1 后，BMAL1 的細(xì)胞保護(hù)和抗氧化作用均減弱，提示BMAL1 可通過NRF2/HO-1 信號軸減輕H2O2誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激。這與既往研究報(bào)道中的巨噬細(xì)胞 BMAL1 能調(diào)控 NRF2 的結(jié)果相類似［17］。然而BMAL1 對于心血管疾病相關(guān)的心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的研究尚鮮見報(bào)道。研究顯示，BMAL1作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，能與E-Box 元件（nCACGTGn）相結(jié)合而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄；大鼠NRF2啟動(dòng)子序列中均含有該序列元件，其機(jī)制可能是BMAL1通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控NRF2使NRF2/HO-1 信號軸活化，從而抵抗氧化應(yīng)激損傷［18］。

綜上所述，節(jié)律基因BMAL1可減輕H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮其心肌細(xì)胞保護(hù)作用。其機(jī)制可能與調(diào)控NRF2/HO-1 信號軸有關(guān)。