葉長文，李 璐，賀 琛，李 棟，陳連芳，范 黎，陳 宸，魏雪團*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢市洪山區(qū)獅子山街1號 430070

雪茄煙是一種傳統(tǒng)的煙草制品，通常以晾曬煙葉為原料，經(jīng)多次發(fā)酵達到雪茄煙特殊的吸食品質(zhì)。在發(fā)酵過程中微生物起著至關(guān)重要的作用［1-2］。李寧等［3］、杜佳等［4］采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒別法，分別對雪茄煙葉葉面和茄衣發(fā)酵過程中微生物區(qū)系的變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中細菌為主要微生物，真菌含量較少，其中芽胞桿菌屬為優(yōu)勢菌群。由于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)本身的局限，即使選擇多種培養(yǎng)基和分離條件，也僅能從樣品中分離出少量優(yōu)勢菌群，不能全面反映其微生物群落的真實組成［5-8］。近年來，基于細菌16SrRNA基因及真菌rRNA基因間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）區(qū)域的高通量測序技術(shù)已廣泛用于微生物多樣性分析。該方法不僅省去了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法的繁瑣過程，并且為大量未培養(yǎng)微生物的研究提供了有效手段，促使煙草微生物多樣性和優(yōu)勢菌群研究取得了新進展［5-11］。張鴿等［8］采用高通量測序和傳統(tǒng)分離2種方法對比分析雪茄煙茄衣原料表面細菌的多樣性及不同發(fā)酵時期的演替，證實了高通量測序法可更全面揭示微生物的多樣性和演替規(guī)律。

由于雪茄煙葉原料、發(fā)酵工藝和生產(chǎn)環(huán)境等因素不同，各地區(qū)生產(chǎn)的雪茄煙中微生物種類組成可能存在較大差異。微生物群落的差異可能影響雪茄煙的發(fā)酵過程，進而影響雪茄煙產(chǎn)品品質(zhì)。目前，基于高通量測序技術(shù)對比分析不同雪茄煙成品微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究尚未見報道。因此，通過高通量測序分析技術(shù)對細菌16S rRNA和真菌ITS基因進行擴增及測序，對比分析國內(nèi)外雪茄煙的微生物群落多樣性，旨在更加準確、全面地掌握其菌群結(jié)構(gòu)，明確優(yōu)勢菌群，為提高雪茄煙產(chǎn)品質(zhì)量和吸食品質(zhì)，并為后續(xù)雪茄煙生產(chǎn)工藝的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

10個雪茄煙樣品均從市場直接購買，其中1#～7#樣品為國產(chǎn)雪茄煙，8#～10#樣品為進口雪茄煙，樣品編號、產(chǎn)地國、煙支規(guī)格、茄芯形態(tài)和卷制工藝等具體信息見表1，涵蓋了國內(nèi)4個雪茄煙廠及國外主流品牌的產(chǎn)品，卷制工藝包括手工卷制、半機制和機制等3種方式。

表1 10個雪茄煙樣品信息表Tab.1 Information of 10 cigar samples

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取和PCR擴增

使用無菌剪刀將雪茄煙樣品剪碎，根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit（美國Omega Bio-tek公司）說明書對樣品中微生物總DNA進行抽提，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的DNA提取液于離心管中，使用無菌水稀釋至1 ng/μL，各樣品做3個生物學(xué)重復(fù)。

選用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（美國New England Biolabs公司）和高效高保真酶進行PCR擴增，PCR擴增區(qū)域、所用引物及序列信息見表2。

表2 PCR擴增區(qū)域、所用引物及其序列信息表Tab.2 Information of PCR amplification regions,primers and sequences

1.2.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

使用2%濃度（質(zhì)量分數(shù)）的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，根據(jù)電泳檢測結(jié)果將PCR產(chǎn)物調(diào)節(jié)為相同濃度，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，再用GeneJET膠（美國Thermofisher Scientific公司）剪切回收目標條帶。

1.2.3 文庫構(gòu)建和上機測序

使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒（美國Thermofisher Scientific公司）進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Ion S5TMXL測序平臺（美國Thermofisher Scientific公司）進行上機測序。測序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行。

1.2.4 測序數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt軟件（V1.9.1,http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）先對原始序列（Reads）進行低質(zhì)量部分剪切，再根據(jù)Barcode從得到的Reads中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)（Raw reads）。經(jīng)過以上處理后得到的Reads需要進行去除嵌合體序列的處理，Reads序列通過UCHIME Algorithm與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Clean reads）。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

對有效數(shù)據(jù)在97%水平上進行操作分類單元（Operational taxonomic unit,OTU）聚類，并利用Greengene數(shù)據(jù)庫進行物種注釋。通過對OTU進行豐度、α多樣性以及物種在各個分類水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成，并分別利用Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Coverage指數(shù)公式計算細菌生態(tài)多樣性指數(shù)；利用Excel 2013做柱形圖；利用HemI（Heatmap Illustrator,version 1.0）做熱圖；利用SPSS 17.0做統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S r RNA和ITS序列豐度分析

對10個雪茄煙樣品中的微生物進行Illumina MiSeq高通量測序，分別得到2 085 050條和2 354 038條高質(zhì)量的16S rRNA序列和ITS序列（Clean Reads），平均每個樣品分別高達69 502條和78 468條，所得的ITS序列數(shù)目稍高于16S rRNA。通過繪制稀釋曲線發(fā)現(xiàn)，10個樣品的稀釋曲線在97%相似性水平下已趨于平坦，雖未達到完全飽和，但可涵蓋樣品中絕大多數(shù)微生物物種，基本能反映所測雪茄煙樣品的細菌和真菌微生物群落組成。

2.2 α多樣性分析

在97%分類水平上，雪茄煙樣品微生物的α多樣性指數(shù)如表3所示。所有樣品微生物Coverage指數(shù)均大于0.99，說明樣品文庫中序列基本上都被測出，即樣品測序結(jié)果可反映樣品的真實情況。

從表3中10個樣品的細菌和真菌多樣性分析結(jié)果可見，不同樣品細菌和真菌的多樣性存在較大差異。對于細菌的α多樣性，CCSS樣品中的微生物Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在所有的雪茄煙樣品的微生物中均為最低，且OTU數(shù)量也最少，表明CCSS樣品中的細菌物種最少，物種豐富度最低。而HNL9樣品中的微生物Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)與OTU數(shù)量均是最高的，Shannon指數(shù)也較高，說明HNL9樣品中的細菌群落多樣性最為豐富。

表3 雪茄煙樣品中細菌和真菌多樣性指數(shù)及檢測的OTU數(shù)量Tab.3 Index of bacterial and fungal diversities in cigar samples and number of OTUs detected

對于真菌的α多樣性，由表3可知，HNL9樣品的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和OTU數(shù)量在所有雪茄煙樣品的微生物中均為最低，說明HNL9樣品中真菌群落多樣性和豐富度是最低的，而細菌群落多樣性結(jié)果在10個樣品中則是最高的。此外，在10個雪茄煙樣品的微生物中，WG樣品中的微生物Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)均為最高，表明WG樣品的真菌群落多樣性和豐富度最高，其OTU數(shù)量也印證了該結(jié)論。TS樣品的Chao1指數(shù)為517.32，在所有的雪茄煙樣品的微生物中是最高的，其OTU數(shù)量達到433個，僅次于WG樣品，說明TS樣品的真菌群落多樣性也較為豐富。

2.3 細菌群落結(jié)構(gòu)分析

對10個雪茄煙樣品中微生物的細菌群落組成進行了分析，共檢出36個細菌門和360個細菌屬。表4列舉了10個雪茄煙樣品中的細菌在各分類水平的種類數(shù)目，其中HNL9樣品中的細菌在各分類水平的種類數(shù)量均為最高，這也印證了16SrRNA序列豐度分析和α多樣性分析結(jié)果。

表4 雪茄煙樣品中細菌在各分類水平的種類數(shù)量Tab.4 Number of species of each bacterial classification in cigar samples （個）

10個樣品細菌群落在門分類水平上的分布見圖1。10個樣品中平均相對豐度大于1%的細菌門有4個，分別為厚壁菌門（Firmicutes，6.86%～67.42%），變 形 菌 門（Proteobacteria，3.39%～61.25%），放 線 菌 門（Actinobacteria，2.52%～34.20%）和 擬 桿 菌 門（Bacteroidetes，0.17%～4.04%）。其中，厚壁菌門在TS，GXB，MT和DWDF樣品中的相對豐度均大于50%，變形菌門在JJ樣品中的相對豐度也超過了50%。在門水平上將各樣品的微生物組成進行對比分析，平均相對豐度大于1%的細菌門類中各樣品間的微生物組成相同，但各門類間的相對豐度具有一定的差異，其中3個國外雪茄煙中厚壁菌門細菌豐度明顯高7個國產(chǎn)雪茄煙。

圖1 雪茄煙樣品中主要細菌門的相對豐度Fig.1 Relative abundances of major bacterial phyla in cigar samples

在屬分類水平下，圖2列舉了10個樣品平均相對豐度前20的細菌屬，其中平均相對豐度大于1%的細菌屬有7個，分別是葡萄球菌屬（Staphylococcus，1.12%～57.68%），不動桿菌屬（Acinetobacter，0.28%～39.32%），假 單 胞 菌 屬（Pseudomonas，0.62%～18.20%），氣 球 菌 屬（Aerococcus，0.16%～19.57%），鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，0.31%～12.19%），芽 胞 桿 菌 屬（Bacillus，0.11%～6.07%）和 四 聯(lián) 球 菌 屬（Tetragenococcus，0.03%～4.63%）。由圖2可知，不同樣品細菌菌落結(jié)構(gòu)存在較大差異。葡萄球菌屬在TS、GXB、MT和DWDF樣品中相對豐度均超過50%，而不動桿菌屬在JJ樣品中的相對豐度達到39.24%，假單胞菌屬在CCMZ樣品中相對豐度達到18.20%?？梢娖咸亚蚓鷮購V泛存在于10個雪茄煙樣品中，并在大部分樣品中占有較大的相對豐度比重，屬于雪茄煙樣品中主要優(yōu)勢細菌屬。不動桿菌屬和假單胞菌屬也存在于各個樣品中，且在個別樣品中相對豐度占比較大，也屬于雪茄煙樣品中優(yōu)勢細菌屬。在屬水平上將各樣品的細菌微生物組成進行對比分析，7個國產(chǎn)雪茄煙樣品的相關(guān)優(yōu)勢細菌屬的相對豐度差異較大，而3個進口雪茄煙樣品的相關(guān)優(yōu)勢細菌屬的相對豐度差異較小，其中3個國外雪茄煙中葡萄球菌屬細菌豐度明顯高于除TS外的6個國產(chǎn)雪茄煙。

圖2 雪茄煙樣品中主要細菌屬的相對豐度Fig.2 Relative abundances of major bacterial genera in cigar samples

2.4 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

對10個雪茄煙樣品中微生物的真菌群落組成進行了鑒定，共檢出7個真菌門和49個真菌屬。表5列舉了樣品中真菌在各分類水平的種類。與雪茄煙樣品中細菌在各分類水平上的種類相比，真菌的種類數(shù)量均顯著低于細菌。

表5 雪茄煙樣品中細菌在各分類水平的種類數(shù)量Tab.5 Number of species of each fungal classification in cigar samples （個）

10個樣品中真菌群落在門分類水平上主要有子 囊 菌 門 （Ascomycota） 和 擔(dān) 子 菌 門（Basidiomycota），平均相對豐度大于1%的真菌門僅有子囊菌門（1.6%～10.9%），圖3表明該菌門在10個樣品中均為優(yōu)勢菌門，這與調(diào)制期煙葉［10］和自然醇化片煙［11］中優(yōu)勢真菌門結(jié)果一致。擔(dān)子菌門僅在WG樣品中的相對豐度大于1%，而其他的真菌門相對豐度均不足1%。3種進口雪茄煙樣品優(yōu)勢菌門的相對豐度差異較小，而7種國產(chǎn)雪茄煙樣品的優(yōu)勢菌門相對豐度差異較大，其中WG，SBL和TS樣品中擔(dān)子菌門的相對豐度明顯高于其他樣品。

圖3 雪茄煙樣品中主要真菌門的相對豐度Fig.3 Relative abundances of major fungal phyla in cigar samples

在屬分類水平，真菌屬共檢出49個，遠低于檢出的細菌屬種類。圖4列舉了10個樣品平均相對豐度前20的屬，其中平均相對豐度大于1%的真菌屬有2個，分別為曲霉屬（Aspergillus，1.36%～10.49%）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia，0.1%～1.36%）。其中曲霉屬在雪茄煙微生物中屬于絕對優(yōu)勢菌屬，這與陳善義等［11］采用高通量測序技術(shù)分析12份自然醇化片煙樣品的真菌優(yōu)勢菌屬結(jié)果、以及邱立友等［12］利用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法研究自然醇化片煙微生物區(qū)系結(jié)果較為一致。

圖4 雪茄煙樣品中主要真菌屬的相對豐度Fig.4 Relative abundances of major fungal genera in cigar samples

在屬水平上將各樣品中真菌組成進行分析，3個進口雪茄煙樣品的曲霉屬的相對豐度差異較小，而7個國產(chǎn)雪茄煙樣品的曲霉屬的相對豐度差異較大，其中CCMZ、CCSS、HNL9和JJ樣品中曲霉屬所占比例較高且與進口雪茄煙相對豐度相近。WG，SBL和TS樣品中節(jié)擔(dān)菌屬的相對豐度明顯高于其他樣品，三者均為國產(chǎn)雪茄煙產(chǎn)品，其中WG和SBL樣品為國內(nèi)半機制雪茄煙。

2.5 樣品間聚類分析

根據(jù)物種或樣品間豐度的相似性進行聚類分析，并將細菌和真菌群落結(jié)果呈現(xiàn)在群落結(jié)構(gòu)熱圖上（圖5和圖6），可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色變化與相似程度可反映不同樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。顏色越紅表示菌屬在樣品中的相對豐度越高，顏色越藍表示菌屬在樣品中的相對豐度越低。從圖5中細菌聚類分析結(jié)果可知，TS、DWDF、GXB和MT樣品聚集在1個小的分支，說明這4個樣品細菌屬的群落結(jié)構(gòu)比較相似，而JJ樣品與其他樣品未發(fā)生聚類，說明該樣品與其余9個樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。從圖6中真菌屬聚類分析結(jié)果可知，SBL和MT樣品聚集于1個小分支，JJ和GXB樣品聚集在旁邊的另1個小分支上，這2個小分支又聚集在一起，說明這4個樣品真菌屬的群落結(jié)構(gòu)相似度較高。綜合細菌屬和真菌屬聚類分析結(jié)果，可得出GXB和MT樣品中細菌屬和真菌屬的群落結(jié)構(gòu)最為相似，這可能是因為兩者均來自同一產(chǎn)地國古巴。

圖5 基于聚類分析的屬水平細菌群落結(jié)構(gòu)熱圖Fig.5 Heatmap of bacterial community structure at genus level based on cluster analysis

圖6 基于聚類分析的屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)熱圖Fig.6 Heatmap of fungal community structure at genus level based on cluster analysis

3 討論

從門分類水平分析各樣品中微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和子囊菌門分別是細菌和真菌的優(yōu)勢菌門。從屬分類水平分析，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬和曲霉屬是10個雪茄煙樣品中微生物的優(yōu)勢菌屬，這與張鴿等［8］采用高通量測序技術(shù)對墨西哥雪茄外包皮表面細菌主要種屬分析結(jié)果（棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬等）較為一致，且該研究發(fā)現(xiàn)細菌群落結(jié)構(gòu)隨發(fā)酵進程而變化，優(yōu)勢微生物由發(fā)酵前期的假單胞菌屬（40.88%）和棒狀桿菌屬（44.64%）演替為發(fā)酵后期的葡萄球菌屬（72.78%）。然而相關(guān)文獻［3-4］報道利用傳統(tǒng)微生物分離方法分析雪茄煙葉和茄衣表面微生物區(qū)系，卻發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌屬為優(yōu)勢菌株，與高通量測序結(jié)果不完全一致，這可能與傳統(tǒng)微生物分離鑒定手段的局限性有關(guān)［8］，因為不同種屬的微生物具有不同的生理生化特征，對營養(yǎng)基質(zhì)的需求不同，其分離純化受分離培養(yǎng)基的影響較大，故用不同的分離培養(yǎng)基可能得到不同的結(jié)果。

雪茄煙微生物中葡萄球菌屬、假單胞菌屬和曲霉屬等優(yōu)勢細菌屬具有豐富的代謝功能，不僅可能改善雪茄煙感官品質(zhì)，而且可分解代謝煙草本身的一些有害成分。國內(nèi)外雖暫無葡萄球菌屬在雪茄煙葉發(fā)酵過程作用機理的研究報道，但已有食品中代謝功能的相關(guān)研究，如葡萄球菌屬在臘肉和香腸發(fā)酵過程中可代謝支鏈氨基酸和含硫基氨基酸形成培根風(fēng)味［13］。而假單胞菌屬細菌能夠分解多種環(huán)境污染物，被認為是環(huán)境中主要的有機物分解者，產(chǎn)堿假單胞菌屬（Pseudomonas alcaligenes）具有降解多環(huán)芳烴的能力［14］，假單胞菌屬中部分菌種能降解煙草中有害物質(zhì)，如煙草特有亞硝胺［15-16］。雪茄煙優(yōu)勢真菌屬中曲霉屬的很多菌也具有改善煙葉品質(zhì)的能力，如高文霞等［17］從煙葉中分離到一株曲霉屬菌株SZ14，用該菌處理煙葉后，煙葉有機酸和石油醚提取物含量明顯增加，感官評吸得分顯著提高。然而，曲霉屬也是片煙倉儲和養(yǎng)護過程中導(dǎo)致霉變的主要菌屬［11,18-19］，可關(guān)注和警惕該類真菌，對于可能導(dǎo)致雪茄煙霉變的曲霉屬的具體種類和含量可進行篩選和針對性控制，以便更有效地提升雪茄煙產(chǎn)品質(zhì)量。

雪茄煙中的微生物具有豐富的群落多樣性和特色的菌群組成結(jié)構(gòu)，可將微生物高通量測序結(jié)果作為參考，按照所剖析的優(yōu)勢菌群，同時結(jié)合代謝組學(xué)、培養(yǎng)組學(xué)等技術(shù)手段和方法，從中篩選出更多有益的微生物菌株，對其在雪茄煙發(fā)酵過程中的功能進行準確的定位，以便深入研究其在雪茄煙發(fā)酵中的作用，探尋其作用機理，挖掘功能性菌株，進一步改變雪茄煙發(fā)酵工藝，從而提升雪茄煙品質(zhì)。高通量測序技術(shù)在食品微生物生態(tài)學(xué)研究中已得到了應(yīng)用，極大加深了對食品微生物多樣性的認識，但該技術(shù)需要專業(yè)的分析測試平臺，同時所產(chǎn)出的巨大測序數(shù)據(jù)需要熟練的生物信息學(xué)分析能力，限制了其在煙草微生物研究中的廣泛應(yīng)用和推廣。此外，高通量測序結(jié)果的序列讀長有限（1 000 bp以下），對序列進行分析時通常只能鑒定到屬水平，很難在種水平上對微生物區(qū)系進行研究。

4 結(jié)論

本研究中發(fā)現(xiàn)10個雪茄煙樣品的微生物群落組成豐富，共檢出36個細菌門和360個細菌屬，其中平均相對豐度大于1%的細菌門和細菌屬分別為4個和7個；共檢出7個真菌門和49個真菌屬，其中平均相對豐度大于1%的真菌門和真菌屬分別有1個和2個，其中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門和子囊菌門，優(yōu)勢菌屬為葡萄球菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬和曲霉屬；細菌群落多樣性水平最高和最低的樣品分別為HNL9和CCSS樣品，而真菌群落多樣性水平最高和最低的樣品分別是WG和HNL9樣品。另外，不同樣品中細菌和真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)存在顯著差異，7個國產(chǎn)雪茄煙樣品的相關(guān)優(yōu)勢菌屬的相對豐度差異較大，而3個進口雪茄煙樣品的相關(guān)優(yōu)勢菌屬的相對豐度差異較小，聚類分析顯示來自同一產(chǎn)地國的GXB和MT樣品菌群分布比較相似。