趙 輝 王喜英 盧志宏 譚智勇

（銅仁學(xué)院經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，貴州銅仁 554300）

設(shè)施蔬菜是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集約化發(fā)展的一個(gè)重要分支，具有集約化程度高、收益大等特點(diǎn)，在許多地區(qū)已經(jīng)成為支柱產(chǎn)業(yè)（王學(xué)霞 等，2018）。截止到2018 年，我國設(shè)施蔬菜面積達(dá)到了400 萬hm2（6 000萬畝）左右，位居世界第一，占蔬菜種植總面積的19.1%（王學(xué)霞 等，2021）。然而，設(shè)施蔬菜具有種植指數(shù)高、農(nóng)業(yè)投入（如殺菌劑、化肥、塑料薄膜）大、封閉或半封閉環(huán)境導(dǎo)致棚內(nèi)溫濕度較高且無雨水淋溶等特點(diǎn)。因此，設(shè)施蔬菜長期種植已經(jīng)引起了人們對土壤質(zhì)量退化、土壤和蔬菜潛在污染以及對人類健康的負(fù)面影響的擔(dān)憂（寧德富 等，2016；Sun et al.，2016）。氮（N）是作物生長的主要限制因子，土壤氮有效性在決定作物氮素吸收和產(chǎn)量方面起著重要作用（李生秀，2008）。鑒于氮素對作物生長的顯著貢獻(xiàn)，設(shè)施栽培中大量氮肥被施入土壤，氮肥大量施用雖然提高了設(shè)施蔬菜的產(chǎn)量，但也造成了土壤養(yǎng)分氮的大量積累，加劇了土壤次生鹽漬化和酸化，導(dǎo)致病原菌不斷積累，土壤質(zhì)量逐漸退化，溫室氣體排放加劇等問題，蔬菜品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約了設(shè)施蔬菜高效可持續(xù)發(fā)展（王倩姿，2019）。

硝化作用是自然界土壤氮素循環(huán)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，土壤氨態(tài)氮在微生物作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮（）和硝酸鹽氮（）的過程，同時(shí)連接固氮作用、氨化作用和反硝化作用，直接影響氮素利用和環(huán)境質(zhì)量（Vitousek et al.，1997）。硝化過程可以分為兩步完成，第一步為氨態(tài)氮在亞硝化微生物下氧化成亞硝酸鹽氮（）的過程，也稱為氨氧化過程；第二步為亞硝酸鹽氮在亞硝酸鹽氧化酶下氧化為硝酸鹽氮（）。在硝化過程中，亞硝態(tài)氮不穩(wěn)定，易被氧化為硝態(tài)氮；因此，氨氧化過程的限速步驟，主要由氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）催化完成。研究表明，土壤pH、水分、有機(jī)質(zhì)含量、施氮量和土地利用方式等對AOB、AOA 數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)有影響（Chen et al.，2014；Zhong et al.，2016）。可知，隨著設(shè)施蔬菜種植年限的延長，土壤理化性質(zhì)的變化將不可避免地導(dǎo)致硝化微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（方明 等，2019）。

前人研究認(rèn)為，在氮充足的草地和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，硝化作用主要由AOB 驅(qū)動(dòng)（Di et al.，2009；Jia & Conrad，2009）。Gubry-Rangin 等（2010）研究認(rèn)為，在酸性低營養(yǎng)農(nóng)田土壤中，硝化作用主要由AOA 驅(qū)動(dòng)。Zhong 等（2016）研究表明，設(shè)施蔬菜土壤中AOB 和AOA 數(shù)量隨施氮量增加呈現(xiàn)下降趨勢，且AOB 群落結(jié)構(gòu)變化較大。然而，關(guān)于設(shè)施蔬菜長期種植對土壤硝化微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的研究鮮見報(bào)道。

為此，本試驗(yàn)運(yùn)用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)和熒光定量PCR 技術(shù)對不同種植年限設(shè)施菜地土壤硝化微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，以揭示硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度隨設(shè)施種植年限的變化規(guī)律及其主要驅(qū)動(dòng)環(huán)境因子，從硝化微生物的角度來解析土壤氮素利用效率，定向調(diào)控土壤氮素轉(zhuǎn)化過程，為實(shí)現(xiàn)設(shè)施栽培蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)在貴州省銅仁市碧江區(qū)和平鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)園區(qū)（109°07′44″E，27°46′46″N）進(jìn)行。試驗(yàn)點(diǎn)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年均溫18 ℃，年降水量1 313 mm，土壤類型為黃壤。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2017 年7 月在和平鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)園區(qū)日光溫室基地選取種植年限分別為3、5、7 a 的設(shè)施蔬菜大棚各3 個(gè)，大棚長40 m，寬8 m，以周圍種植的露地蔬菜為對照（CK）。每個(gè)設(shè)施種植年限設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，即每個(gè)大棚為1 個(gè)重復(fù)，露地蔬菜（CK）也設(shè)置3個(gè)重復(fù)。設(shè)施大棚每年蔬菜種植類型一致，輪作茄子、黃瓜、西葫蘆、豇豆等，每年種植2 茬。設(shè)施蔬菜基肥長期施用氮磷鉀復(fù)合肥1 200～1 500 kg ·hm-2，追施氮肥600～750 kg·hm-2。露地蔬菜主要種植茄子、南瓜、豇豆等，長期施用氮磷鉀復(fù)合肥600～750 kg·hm-2，追施氮肥300～450 kg·hm-2。在整個(gè)試驗(yàn)處理中，除種植年限差異外，其余生產(chǎn)管理措施一致。

1.3 土樣采集

在各樣地內(nèi)按“S”形（5 點(diǎn)法）采集0～10 cm 土層土壤樣品，混合成1 個(gè)土樣，用低溫冰盒保存并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。土樣在室內(nèi)去除石塊和植物根系并過2 mm 篩后，分為2 份，一份-80 ℃冰箱保存，用于amoA基因群落結(jié)構(gòu)和豐度分析；一份新鮮土壤用于銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量測定，余下部分室內(nèi)風(fēng)干過篩用于土壤化學(xué)指標(biāo)測定。

1.4 測定項(xiàng)目

1.4.1 土壤化學(xué)指標(biāo)測定 土壤化學(xué)性質(zhì)采用鮑士旦（2000）的方法進(jìn)行測定：土壤pH 值采用電位法測定，有機(jī)碳（SOC）含量采用重鉻酸鉀氧化法測定，全氮（TN）含量采用凱氏定氮法測定，銨態(tài)氮含量采用靛酚藍(lán)比色法測定，硝態(tài)氮含量采用酚二磺酸比色法測定。

1.4.2 土壤DNA 提取及熒光定量PCR 稱取0.5 g 土壤，按照E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega，GA，USA）試劑盒操作步驟提取土壤DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，用核酸定量儀（Nanodrop-NC2000）檢測DNA 濃度和純度。PCR 產(chǎn)物純化回收后，將其連接至pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選陽性克隆，提取amoA基因重組質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度經(jīng)核酸定量儀測定后，計(jì)算基因拷貝數(shù)，按照10倍梯度稀釋至103～108拷貝數(shù)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR 反應(yīng)在ABI7500 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×SYBR Green，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，ROX 0.5 μL，DNA 模板2 μL（1～10 ng），最后用ddH2O補(bǔ)至20 μL。熒光定量PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95℃ 5 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.4.3 高通量測定 AOA 擴(kuò)增引物為amoA-23F（5′-ATGGTCTGGYTWAGACG-3′）和amoA-616R（5′-GCCATCCATCTGTATGTCCA-3′）。AOB 擴(kuò)增引物為amoA-1F（5′-GGGGTTTCTACTGGTGG T-3′）、amoA-2R（5′-CCCCTCKGSAAAGC CTTCTTC-3′）（Wessén et al.，2011）。PCR體系25 μL：5×Ex Taq緩沖液5.0 μL，dNTP（2.5 μmol ·L-1）2.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，DNA 模 板2.0 μL（1～10 ng），Ex Taq（5 U ·μL-1）0.25 μL，最后用ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 1 min，27 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。樣品送至上海派森諾生物科技股份有限公司，運(yùn)用Illumina MiSeq 測序平臺(tái)進(jìn)行測序。測序樣品數(shù)據(jù)下機(jī)后，根據(jù)barcode標(biāo)簽序列和前引物序列篩選出有效序列，去除接頭和barcode 序列，利用FLASH 軟件對通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進(jìn)行配對連接，同時(shí)利用USEARCH 軟件檢查并剔除嵌合體序列，從而獲得高質(zhì)量有效序列。使用QIIME 軟件調(diào)用UCLUST 序列比對工具，按照97%的序列相似度進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Unit）劃分和歸并，并選取豐度最高的序列作為該OTU 的代表序列。利用QIIME 軟件將OTU 的代表序列與功能基因數(shù)據(jù)庫（FunGene）進(jìn)行比對，獲取每個(gè)OTU 對應(yīng)的分類學(xué)信息。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行土壤化學(xué)性質(zhì)、氨氧化微生物α 多樣性指數(shù)、豐度和群落組成相對豐度的差異顯著性分析（P＜0.05）和相關(guān)性分析。采用R 軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 種植年限對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

由表1 可知，設(shè)施蔬菜長期種植對土壤理化性質(zhì)有顯著影響（P＜0.05）。不同設(shè)施菜地種植年限土壤pH 值、有機(jī)碳含量和碳氮比均顯著小于CK，且隨種植年限延長逐漸降低。種植3、5、7 a土壤全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量均高于CK，且隨種植年限延長逐漸增加。由此可知，設(shè)施蔬菜長期種植土壤酸性增強(qiáng)，土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量積累。

表1 不同種植年限設(shè)施菜地土壤理化性質(zhì)

2.2 種植年限對氨氧化菌amoA 基因豐度的影響

由圖1 可知，不同設(shè)施菜地種植年限土壤AOA-amoA和AOB-amoA基因拷貝數(shù)變化范圍分別為2.02 × 107～3.28 × 107個(gè)·g-1（干土）和0.53 ×106～1.91 × 106個(gè)·g-1（干土）。AOA-amoA拷貝數(shù)隨種植年限延長逐漸下降，種植3 a 和5 a 處理土壤AOA-amoA拷貝數(shù)均顯著高于7 a 和CK（P＜0.05），其中種植3 a 和5 a 處理之間差異不顯著；種植7 a 土壤AOA-amoA拷貝數(shù)低于CK，但差異不顯著（P＞0.05）。AOA-amoA和AOB-amoA拷貝數(shù)在各處理中變化趨勢相同，且AOA-amoA拷貝數(shù)在不同處理中均高于AOB-amoA。AOA/AOB值為17.33～39.16，大小順序表現(xiàn)為CK ＞7 a ＞5 a ＞3 a，且7 a 處理分別與3 a 和5 a 處理間差異顯著（P＜0.05）。

圖1 不同種植年限設(shè)施土壤AOA-amoA 和AOB-amoA 基因豐度及AOA/AOB

2.3 種植年限對氨氧化微生物α 多樣性的影響

種植年限對AOA 群落的Chao1 指數(shù)、ACE指數(shù)和Simpson 指數(shù)有極顯著影響（P＜0.01）；對Shannon 指數(shù)有顯著影響（P＜0.05）（表2）。Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)范圍分別為97.65～221.13和98.80～228.65，其中種植3 a 處理顯著高于其他處理。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)范圍為2.87～4.26 和0.83～0.94，大小順序?yàn)? a ＞5 a ＞CK ＞7 a（表3）。

種植年限對AOB 群落的ACE 指數(shù)和Simpson指數(shù)有顯著影響（P＜0.05）（表2）。Chao1 指數(shù) 和ACE指數(shù)范圍分別為192.15～415.53 和195.63～424.68，其中3 a 和5 a 處理分別是CK 的2.16、2.03 倍和2.17、2.04 倍。Shannon 指數(shù)范圍為3.38～4.60，3 a 和5 a 處理分別是CK 的1.11 倍和1.08 倍。Simpson 指數(shù)范圍為0.68～0.88，大小順序?yàn)? a ＞CK ＞3 a ＞7 a，7 a 分別與CK、3 a和5 a 處理間差異顯著（表3）。

表2 設(shè)施栽培年限對AOA 和AOB 多樣性指數(shù)的影響方差分析

表3 不同種植年限設(shè)施土壤AOA 和AOB 群落ɑ 多樣性指數(shù)的影響

2.4 種植年限對AOA 和AOB 群落的影響

在門水平上，AOA 群落由奇古菌門（Thaumarchaeota）、變形菌門（Proteobacteria）、unidentified 組成（圖2-A）。奇古菌門為主要優(yōu)勢類群，各處理相對豐度分別為55.03%～71.90%；其中種植3 a 處理相對豐度為55.06%，極顯著低于其他處理。變形菌門相對豐度為6.36%～24.26%；其中種植3 a 處理最高，隨設(shè)施種植年限延長逐漸減低，且處理間差異顯著。在屬水平上，共檢測到6個(gè)類群（圖2-B），分別為Candidatus Nitrosotalea、亞硝化暖菌屬（Nitrososphaera）、亞硝化單胞菌（Nitrosomonas）、Archaea-unidentified、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）和氣單胞菌屬（Aeromonas）。其中Candidatus Nitrosotalea、亞硝化暖菌屬和亞硝化單胞菌屬為優(yōu)勢類群，各處理相對豐度分 別 為30.23%～58.76%、12.12%～33.54% 和3.68%～18.91%。Candidatus Nitrosotalea相對豐度大小順序?yàn)镃K ＞5 a ＞3 a ＞7 a，說明設(shè)施年限延長對其有抑制作用。亞硝化暖菌屬、亞硝化單胞菌屬相對豐度在3、5 a 和7 a 處理中均顯著高于CK，說明設(shè)施栽培對其有促進(jìn)作用。硝化螺旋菌屬在5 a 處理中相對豐度為5.33%，高于其他處理，但各處理間差異不顯著。Archaea-unidentified在CK 中相對豐度為11.48%，高于其他處理。氣單胞菌屬在5 a 處理中相對豐度最低，但與其他處理間差異不顯著。

圖2 設(shè)施種植年限土壤氨氧化古菌門和屬水平組成

AOB 群落在門水平上共獲得3 個(gè)類群（圖3-A），分別為變形菌門（Proteobacteria）、奇古菌門（Thaumarchaeota）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）。變形菌門為主要優(yōu)勢類群，相對豐度范圍為73.57%～87.55%，3 a 和5 a 處理分別是CK 的1.12倍和1.03 倍。奇古菌門相對豐度在CK 中最低，隨設(shè)施種植年限延長呈先增加后降低趨勢。硝化螺旋菌門相對豐度在CK 最高，隨設(shè)施種植年限延長表現(xiàn)出先降低后增加趨勢。在屬水平上，共檢測到5 個(gè)類群（圖3-B），分別為亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、Candidatus Nitrosotalea、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）和亞硝化暖菌屬（Nitrososphaer）。亞硝化螺菌屬為優(yōu)勢類群，相對豐度范圍為77.21%～86.55%。亞硝化螺菌屬的相對豐度在3 a 和5 a 處理中較高，分別是CK 的1.10 倍和1.05 倍，隨設(shè)施種植年限延長逐漸降低。Candidatus Nitrosotalea相對豐度在7 a 處理中最低，顯著低于其他處理。亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌屬相對豐度在CK 中最高。亞硝化暖菌屬相對豐度在3 a 處理最高，隨設(shè)施種植年限延長表現(xiàn)出先減少后增加的趨勢。

圖3 不同種植年限設(shè)施土壤氨氧化細(xì)菌門和屬水平組成

2.5 氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)及其與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

通過對AOA 和AOB 群落進(jìn)行主成分分析可知（圖4），不同設(shè)施種植年限土壤AOA 和AOB群落結(jié)構(gòu)差異明顯。AOA 的PC1 和PC2 分別為56.79%和18.60%，二者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到75.39%。3、5 a 和7 a 處理分別與CK 在PC1 和PC2 上分離都較大，說明設(shè)施蔬菜種植年限導(dǎo)致AOA 群落結(jié)構(gòu)變化較大；3 a 和7 a 處理相聚較近，群落相似度較大。AOB 的PC1 和PC2 分別為55.30%和27.38%。3、5 a 和7 a 處理在PC1 和PC2 上分離都較大，說明設(shè)施蔬菜種植年限對AOB 群落結(jié)構(gòu)影響較大。總體看來，種植年限對AOA 群落的影響強(qiáng)于AOB。

圖4 不同種植年限設(shè)施土壤AOA 和AOB 群落主成分分析

RDA 反應(yīng)基于屬分類水平上土壤化學(xué)性質(zhì)對AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)的影響（圖5）。AOA 的RDA1 和RDA2 軸分別為61.29%和19.59%。土壤pH 對AOA 群落結(jié)構(gòu)有顯著影響（P＜0.05），銨態(tài)氮和硝態(tài)氮對AOA 群落結(jié)構(gòu)有極顯著影響（P＜0.01）。AOB 的RDA1 和RDA2 軸 分 別 為39.64%和25.24%。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮對AOB群落結(jié)構(gòu)有顯著影響（P＜0.05）。

圖5 AOA、AOB 與土壤化學(xué)性質(zhì)的冗余分析

3 討論

3.1 種植年限對設(shè)施土壤AOA 和AOB 數(shù)量的影響

AOA 和AOB 是氨氧化作用的主要承擔(dān)者，在土壤氮轉(zhuǎn)化過程中具有重要作用，影響植物對氮素的吸收利用，且與過量施肥導(dǎo)致土壤酸化、硝酸鹽淋失和溫室氣體排放等關(guān)系密切（Wang et al.，2017）。本試驗(yàn)中不同處理土壤AOA 數(shù)量高于AOB，AOA/AOB 值為17.33～39.16，與其他研究者結(jié)果相符（Xu et al.，2012；張苗苗 等，2015），進(jìn)一步證實(shí)了酸性土壤中AOA 占主導(dǎo)優(yōu)勢（楊亞東 等，2017）。設(shè)施蔬菜土壤中AOA 和AOB 數(shù)量均高于CK，可能與設(shè)施土壤氮含量較高有關(guān)。Di等（2010）研究表明，無機(jī)氮作為氨氧化細(xì)菌的能量來源，可促進(jìn)土壤氨氧化細(xì)菌生長。

相關(guān)研究表明，AOA 和AOB 數(shù)量受多種土壤環(huán)境因子影響（Yao et al.，2013）。Pernes-Debuyser和Tessier（2004）研究認(rèn)為，長期氮肥添加通過氨氧化作用可導(dǎo)致土壤中質(zhì)子積累，從而降低土壤pH。Chen 等（2013）研究認(rèn)為，土壤pH 與AOB數(shù)量顯著負(fù)相關(guān)，與AOA 數(shù)量沒有顯著相關(guān)關(guān)系。然而，楊亞東等（2017）研究認(rèn)為，土壤pH 與AOA 數(shù)量顯著正相關(guān)，與AOB 數(shù)量沒有顯著相關(guān)關(guān)系。Chen 等（2011）研究也認(rèn)為，土壤pH 是影響AOA 種群數(shù)量變化的主要因素，較低pH 不適合AOB 生長。AOB 利用的底物為氨分子（NH3），土壤pH 降低將導(dǎo)致NH3轉(zhuǎn)變?yōu)?，?dǎo)致底物NH3濃度降低。本試驗(yàn)中，隨種植年限延長，土壤pH 值逐漸降低，驅(qū)動(dòng)NH3轉(zhuǎn)化為-N，可能是造成AOB 數(shù)量減少的主要因素（Macqueen & Gubry-Rangin，2016）。然而，AOA 對底物氨分子（NH3）的親和力強(qiáng)于AOB（Willm et al.，2009），且適應(yīng)較低pH 環(huán)境（He et al.，2012）。由此可知，在設(shè)施蔬菜長期種植中AOA 可能在氨氧化過程發(fā)揮重要作用。

然而，本試驗(yàn)中AOA 和AOB 數(shù)量級低于楊亞東（2018）在農(nóng)田土壤的研究結(jié)果，設(shè)施蔬菜長期種植降低了AOA 和AOB 數(shù)量。AOA 和AOB 數(shù)量變化趨勢一致，隨設(shè)施種植年限延長逐漸降低，均高于CK。AOA 數(shù)量在不同種植年限中有顯著變化，與陳秋會(huì)（2014）研究結(jié)果相反。Shen 等（2011）通過研究不同氮水平下我國菜地土壤AOB 數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)氮肥顯著提高菜地土壤AOB 數(shù)量。以上研究結(jié)果的差異，可能與研究區(qū)域施肥組成、施肥水平、取樣時(shí)間和立地條件等因素有關(guān)。由此可知，AOA 和AOB 數(shù)量對不同土壤環(huán)境因子的差異響應(yīng)，將導(dǎo)致AOA 和AOB 生態(tài)位發(fā)生分離。

3.2 AOA 和AOB 群落及其與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

種植年限3 a 和5 a 的AOA 和AOB 群落豐富度和多樣性指數(shù)均高于CK，但種植7 a 的AOA 和AOB 群落豐富度和多樣性指數(shù)低于CK。由此可知，適宜種植年限有利于增加AOA 和AOB 群落多樣性，長期種植將降低AOA和AOB群落多樣性；可能由于長期施用氮肥，特別是銨態(tài)氮是引起土壤AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要因素（Willm et al.，2009）。本試驗(yàn)中，種植年限對AOA 群落的影響最大，與Chen 等（2013）的研究結(jié)果相反。然而，Wang 等（2009）和Shen 等（2011）分別在水稻土壤和半干旱溫帶草原土壤中發(fā)現(xiàn)，施氮對AOA 群落組成沒有顯著影響。研究結(jié)果的差異原因可能包含：①本試驗(yàn)對象為設(shè)施蔬菜，具有獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，不同于農(nóng)田（水稻）和草原生態(tài)系統(tǒng)。② AOA 生長極其緩慢，需要經(jīng)過長期處理后才可檢測到變化（K?nneke et al.，2005）。Wang 等（2009）僅在施氮89 d 后就開始對AOA 數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，而本試驗(yàn)是設(shè)施蔬菜種植多年后才對其進(jìn)行檢測。

在門分類水平上，AOA 群落中奇古菌門為優(yōu)勢類群，與杜穎等（2014）研究表明渾善達(dá)克沙地的優(yōu)勢類群結(jié)果一致。與種植3 a 相比，種植5 a和7 a 顯著增加了奇古菌門的相對豐度，表明種植年限對其影響較大。AOB 群落中變形菌門的相對豐度占比較高，平均相對豐度達(dá)到整個(gè)AOB 群落門水平的79.89%。種植3 a 和5 a 的AOA 和AOB群落的變形菌門相對豐度高于7 a 處理，進(jìn)一步證實(shí)了變形菌門具有嗜營養(yǎng)的特點(diǎn)，但有其生態(tài)閾值（Fazi et al.，2005）；可知，隨設(shè)施蔬菜種植年限延長，土壤養(yǎng)分過量富集，超過變形菌門需要的閾值，將對其有抑制作用。土壤pH、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是土壤AOA 群落結(jié)構(gòu)的主要因素，與楊亞東（2018）研究結(jié)果一致。說明設(shè)施蔬菜種植過程中，土壤酸化和氮肥積累直接影響土壤AOA 群落變化。

土壤可利用性氮直接影響AOB 群落結(jié)構(gòu)變化（Hynes & Germida，2012）。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮對AOB 群落結(jié)構(gòu)影響較大，說明設(shè)施栽培通過改變銨態(tài)氮和硝態(tài)氮等指標(biāo)直接或者間接來影響AOB 群落組成結(jié)構(gòu)變化。為準(zhǔn)確評價(jià)設(shè)施蔬菜種植中土壤氨氧化作用發(fā)生規(guī)律，需要進(jìn)一步開展長期的試驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，AOA 和AOB 數(shù)量、群落的Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)和Shannon 指數(shù)，隨設(shè)施種植年限延長逐漸降低。門水平上，奇古菌門和變形菌門分別為AOA、AOB 群落的優(yōu)勢類群。設(shè)施蔬菜長期種植中，土壤pH 是一個(gè)重要指標(biāo)，土壤pH 與AOA 群落結(jié)構(gòu)有顯著關(guān)系，低pH 值可限制硝化微生物生長，不利于硝化過程進(jìn)行。在設(shè)施蔬菜酸性土壤中，硝化作用可能主要由AOA 驅(qū)動(dòng)完成。