丁云花 Holger Budahn 趙 泓 趙岫云*

（1 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蔬菜種質(zhì)改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2 德國(guó)JKI 栽培植物聯(lián)邦研究中心園藝作物育種研究所，Quedlinburg D-06484）

蘿卜（Raphanus）與蕓薹（Brassica）是十字花科中兩個(gè)非常重要的近緣屬。早在1924年Karpechenko 就開(kāi)始進(jìn)行蘿卜和蕓薹之間的雜交試驗(yàn)，以創(chuàng)造新的物種或?qū)崿F(xiàn)基因漸滲（Karpechenko，1924）。迄今，蘿卜中已有多個(gè)有益基因通過(guò)蘿卜與蕓薹屬作物之間的雜交而導(dǎo)入到蕓薹屬作物中，如細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因和細(xì)胞核育性恢復(fù)基因（Bannerot et al.，1974，1977；Heyn，1976；Budar & Pelletier，2001）、抗TuMV基因（Kr?mer et al.，2003）、抗甜菜根結(jié)線蟲(chóng)基因（Clauss，1978；Peterka et al.，2004）等。在前人研究基礎(chǔ)上，Budahn 等（2008）通過(guò)蘿卜附加系與甘藍(lán)型油菜回交開(kāi)發(fā)了一整套甘藍(lán)型油菜-蘿卜附加系，并利用染色體附加系定位了1 個(gè)抗甜菜胞囊線蟲(chóng)的QTL 位點(diǎn)（Budahn et al.，2009）。

利用甘藍(lán)型油菜-蘿卜附加系與白菜類(lèi)作物進(jìn)行回交，可將蘿卜染色體導(dǎo)入白菜類(lèi)作物，創(chuàng)制具有蘿卜優(yōu)異性狀的白菜類(lèi)新種質(zhì)。而在回交后代中，能否高效選擇附加蘿卜染色體的目標(biāo)材料將直接影響新種質(zhì)創(chuàng)制的效率。利用分子標(biāo)記技術(shù)可以在苗期進(jìn)行目標(biāo)基因型的高效選擇。本試驗(yàn)利用一套已知蘿卜染色體組成的甘藍(lán)型油菜-蘿卜附加系標(biāo)準(zhǔn)材料，參考Nakatsuji 等（2011）和Hashida 等（2013）構(gòu)建的蘿卜C 染色體錨定標(biāo)記的連鎖圖譜，建立能夠準(zhǔn)確鑒定甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系與普通白菜雜交后代中外源蘿卜C 染色體的特異SSR 標(biāo)記，以期應(yīng)用于將蘿卜C 染色體導(dǎo)入白菜基因組的回交過(guò)程中目標(biāo)材料的高效選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試材料均由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供。一套包含21 個(gè)已知蘿卜染色體組成的標(biāo)準(zhǔn)材料，包括蘿卜親本A24/2 和A107/1（兩者均含蘿卜9 對(duì)染色體A～I(xiàn)），甘藍(lán)型油菜親本A3/1 和A246/1（兩者均不含蘿卜染色體），一套甘藍(lán)型油菜-蘿卜多體附加系14/52（附加蘿卜染色體B、D 和G）、14/15-66（附加蘿卜染色體A、E 和I）、14/32（附加蘿卜染色體C 和F）、14/53（附加蘿卜染色體D）、14/35（附加蘿卜染色體B、C、F、H和I）、14/37（附加蘿卜染色體B 和H）、14/45（附加蘿卜染色體B、C、E 和G）、14/15-61（附加蘿卜染色體A、E 和I），一整套甘藍(lán)型油菜-蘿卜二體附加系A(chǔ)A（含蘿卜染色體A）、BB（含蘿卜染色體B）、CC（含蘿卜染色體C）、DD（含蘿卜染色體D）、EE（含蘿卜染色體E）、FF（含蘿卜染色體F）、GG（含蘿卜染色體G）、HH（含蘿卜染色體H）、II（含蘿卜染色體I）；普通白菜品種559（不含蘿卜染色體C）、甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 與普通白菜559 雜交獲得的F1。

2017 年9 月15 日在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心農(nóng)場(chǎng)日光溫室種植所有材料，分別播種于50 孔穴盤(pán)，每穴1 粒；F1播種10 穴，其余材料均播種5 穴。出苗30 d 后取完全展開(kāi)的心葉用于提取DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

DNA 提取采用SDS 法（李麗和鄭曉鷹，2003），濃度調(diào)整至8 ng·μL-1。

蘿卜染色體C 的SSR 引物：參考Nakatsuji 等（2011）和Hashida 等（2013）構(gòu)建的蘿卜染色體定位連鎖圖譜，選擇定位于蘿卜C 染色體連鎖群的2 條SSR 標(biāo)記引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 SSR 引物序列

PCR反應(yīng)體系（6 μL）：10× Buffer 0.6 μL，MgCl2（50 mmol·L-1）0.3 μL，dNTPs（12.5 mmol ·L-1）0.12 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.12 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，DNA（8 ng ·μL-1）1.6 μL，ddH2O 2.66 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；10℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳在自動(dòng)測(cè)序儀LI-COR 4300 上分離檢測(cè)。

熒光原位雜交鑒定：利用蘿卜基因組特異探針pURsN 檢測(cè)甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 與普通白菜559 雜交F1的遺傳背景中是否含有蘿卜基因組。其中，蘿卜基因組特異探針pURsN的制備參考Hirai 等（1995）的方法，酶解和制片參考趙泓等（2014）的方法，熒光原位雜交參考Schrader 等（2000）的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源蘿卜C 染色體SSR 標(biāo)記的建立

根據(jù)21 個(gè)甘藍(lán)型油菜-蘿卜附加系標(biāo)準(zhǔn)材料已知所含染色體的情況，可列出各標(biāo)準(zhǔn)材料中所含蘿卜C 染色體的信息（表2）。

利用2對(duì)SSR引物RsSA078 和RH148分別對(duì)21 個(gè)甘藍(lán)型油菜-蘿卜附加系標(biāo)準(zhǔn)材料的DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。從圖1 可以看出，RsSA078 和RH148 的擴(kuò)增結(jié)果一致，均在A24/2、A107/1、14/32、14/35、14/45 和CC 中擴(kuò)增出了特異片段，片段大小分別為170 bp 和190 bp，而其他15 份材料沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。該結(jié)果與表2 所列的21 個(gè)甘藍(lán)型油菜-蘿卜附加系標(biāo)準(zhǔn)材料所含蘿卜C 染色體的信息一致，說(shuō)明這2 個(gè)SSR 引物標(biāo)記RsSA078-170 和RH148-190 均為蘿卜C 染色體的特異標(biāo)記。

圖1 引物RsSA078 和RH148 對(duì)21 個(gè)甘藍(lán)型油菜-蘿卜附加系標(biāo)準(zhǔn)材料的SSR 擴(kuò)增結(jié)果

表2 21 個(gè)甘藍(lán)型油菜-蘿卜附加系標(biāo)準(zhǔn)材料中蘿卜C 染色體的信息

2.2 利用SSR 特異標(biāo)記鑒定F1 外源蘿卜C 染色體

利用上述建立的蘿卜C 染色體的SSR 特異標(biāo)記RsSA078-170 和RH148-190 對(duì)甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC、普通白菜559 及其雜交F1進(jìn)行外源蘿卜C 染色體的鑒定與篩選。從圖2 可以看出，2 對(duì)SSR 引物RsSA078 和RH148 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果一致，甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 的4 個(gè)單株和10 個(gè)F1單株均擴(kuò)增出大小為170 bp 和190 bp 的特異片段，而普通白菜559 沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)的特異片段。說(shuō)明甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 與普通白菜559 雜交后10 個(gè)F1單株均含有蘿卜C 染色體。

圖2 F1 外源蘿卜C 染色體的SSR 特異標(biāo)記鑒定結(jié)果

2.3 利用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)F1 蘿卜基因組

利用蘿卜基因組特異探針pURsN 分別與親本甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC、普通白菜559 及其雜交F1的基因組進(jìn)行熒光原位雜交鑒定。結(jié)果顯示（圖3），甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 和F1有綠色雜交信號(hào)，而普通白菜559 沒(méi)有雜交信號(hào)，說(shuō)明甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 和F1含有蘿卜基因組，普通白菜559 不含蘿卜基因組。

圖3 蘿卜基因組特異探針pURsN 對(duì)F1 基因組的熒光原位雜交檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

對(duì)于屬（種）間雜種的鑒定，除了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和同工酶方法之外，還有現(xiàn)代分子標(biāo)記和原位雜交等方法。利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法雖然也能對(duì)目標(biāo)材料進(jìn)行選擇，但是選擇效率低，尤其是對(duì)數(shù)量性狀或更復(fù)雜的多性狀選擇，其選擇效率和準(zhǔn)確率就更低了?，F(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，為復(fù)雜的多性狀在DNA 水平進(jìn)行早期、準(zhǔn)確、高效地選擇提供了可能。SSR 分子標(biāo)記是以1～6 個(gè)核苷酸為基本單位的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛存在于基因組中，為共顯性遺傳，重復(fù)性好，被廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇、作物遺傳多樣性的研究、基因挖掘、品種純度鑒定等植物種質(zhì)資源和育種領(lǐng)域（張?jiān)龃浜秃钕擦郑?004；Iniguez-Luy et al.，2008；顧愛(ài)俠 等，2009；鞏紅影 等，2014；王娟 等，2017；賴(lài)瑞強(qiáng) 等，2018；張潤(rùn)霖 等，2020；朱志成，2021）。

本試驗(yàn)參考Nakatsuji 等（2011）和Hashida 等（2013）構(gòu)建的蘿卜C 染色體錨定標(biāo)記的連鎖圖譜，利用21 個(gè)已知蘿卜染色體組成的標(biāo)準(zhǔn)材料確定了2 個(gè)甘藍(lán)型油菜-蘿卜附加系中外源蘿卜C染色體的特異SSR 標(biāo)記RsSA078-170 和RH148-190。應(yīng)用這2 個(gè)標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 與普通白菜559 雜交所得的F1進(jìn)行外源蘿卜C 染色體鑒定，結(jié)果表明10 個(gè)F1單株均附加了蘿卜C 染色體，說(shuō)明通過(guò)雜交可以將蘿卜C 染色體從甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系CC 導(dǎo)入普通白菜中。同時(shí)，利用蘿卜基因組特異探針pURsN 對(duì)F1的基因組進(jìn)行熒光原位雜交檢測(cè)，結(jié)果表明F1含有蘿卜基因組，該結(jié)果驗(yàn)證了2個(gè)SSR 標(biāo)記RsSA078-170 和RH148-190 的鑒定結(jié)果是準(zhǔn)確的。說(shuō)明SSR 特異標(biāo)記RsSA078-170 和RH148-190 可以用于甘藍(lán)型油菜-蘿卜C 染色體附加系與普通白菜559 雜交后代中外源蘿卜C 染色體的鑒定。