宋 鑫，崔明暉，張朵朵，張 杰，林麗梅，邢朝斌

刺五加基因的篩選及其表達(dá)對(duì)皂苷含量的影響

宋 鑫，崔明暉，張朵朵，張 杰，林麗梅，邢朝斌*

華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210

篩選和鑒定刺五加中的細(xì)胞色素基因（），分析其進(jìn)化特征，探究其與刺五加總皂苷含量的相關(guān)性。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選得到基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析與適應(yīng)性進(jìn)化分析，采用qRT-PCR法檢測基因的表達(dá)量，采用分光光度計(jì)測定刺五加的總皂苷含量。篩選得到了18條基因。刺五加P450蛋白不存在跨膜區(qū)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主。基因不存在正選擇位點(diǎn)。各間的表達(dá)量差異顯著，部分基因表達(dá)量差值在10倍以上，7條基因的表達(dá)與皂苷含量呈正相關(guān)關(guān)系（＜0.05）。鑒定出與刺五加總皂苷含量存在正相關(guān)關(guān)系的基因，基因在進(jìn)化中受到純凈選擇。

刺五加；細(xì)胞色素；生物信息學(xué)分析；基因表達(dá)量；qRT-PCR

刺五加(Rupr. et Maxim.) Maxim.是我國珍貴藥用植物，具有抗疲勞、抗缺氧、抗腫瘤等許多藥理作用，與人參一樣，被廣泛用作“適應(yīng)原”樣藥物[1]，三萜類化合物是其主要活性成分之一。三萜皂苷類化合物在生物體中均需通過依賴甲羥戊酸的類異戊二烯途徑進(jìn)行合成[2]，合成過程分為前體形成、骨架構(gòu)建以及后修飾3個(gè)階段。其中，后修飾過程是決定形成何種皂苷和其產(chǎn)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，細(xì)胞色素P450（cyctochrome P450 enzyme，P450）即在此過程中負(fù)責(zé)三萜烯骨架的羥基化、氧化和糖基化等復(fù)雜的后修飾作用，是三萜皂苷類化合物生物合成中的關(guān)鍵酶[3]。

P450是第一組被歸類于“超級(jí)家族”的酶類，在動(dòng)植物、細(xì)菌和真菌等細(xì)胞中廣泛分布[4]，它是自然界中最大且最古老的家族。自從1958年從小鼠肝臟微粒體中分離到第一個(gè)細(xì)胞色素P450，以及1989年從鱷梨Mill.中克隆出第1個(gè)植物基因序列[5]以來，基因就因其多樣化的功能成為了研究熱點(diǎn)。在植物中，P450主要參與植物體內(nèi)初級(jí)和次級(jí)代謝反應(yīng)，并發(fā)揮重要的催化作用[6]。迄今為止，利用功能缺失突變體法、差異篩選法、抗體或探選cDNA文庫、同源序列法等方法已成功地分離了多個(gè)基因，部分基因功能已經(jīng)被鑒定[7]。Vasav等[8]在番茄中鑒定出233個(gè)基因以及保守基序并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，為番茄中基因家族的功能和進(jìn)化提供具有重要價(jià)值的信息。

本研究通過刺五加轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選刺五加（）基因，利用BLAST工具對(duì)其序列進(jìn)行分析和鑒定，同時(shí)利用生物信息學(xué)方法來進(jìn)行分析，通過qRT-PCR分析基因的表達(dá)量與皂苷含量間的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究刺五加藥用成分生物合成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。為三萜生物合成途徑的進(jìn)一步解析與P450的功能研究提供借鑒。

1 材料與儀器

1.1 材料

刺五加樣本采自河北省承德市霧靈山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)華北理工大學(xué)邢朝斌教授鑒定為五加科植物刺五加(Rupr. et Maxim) Maxim.。選取刺五加植株的葉片，經(jīng)清水洗凈、濾紙吸干水分保存于?80 ℃，用作后續(xù)提取刺五加總RNA和測定總皂苷含量的樣本，根據(jù)總皂苷含量差異篩選4株同一產(chǎn)地、三年生、長勢相似的刺五加樣本（A、B、C、D），進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)錄本測序。

1.2 儀器

核酸定量儀（NanoDrop One，Thermo Fisher Scientific）；7900HT型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Thenmo scientific）；AC2-s型無菌操作臺(tái)（ESCO公司）；3K15型冷凍高速離心機(jī)（Sigma公司）；PCR擴(kuò)增儀（ProFlex PCR System，Life technologies）；核酸電泳儀、DYY-12型水平電泳槽（北京市六一儀器廠）；C300型凝膠成像儀（Azure biosystems）；2ZX-2型旋片式真空泵（臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司）；V-5100B型可見光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

2 方法

2.1 EsP450基因的篩選及生物信息學(xué)分析

使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取和純化刺五加葉片總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測所提取總RNA的完整性，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行高通量測序。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組拼接、組裝與功能注釋后，獲得unigene的注釋信息[9]。

根據(jù)unigene注釋信息篩選出刺五加轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中的，通過BLAST比對(duì)和人工鑒定，最終得到18條基因。使用ExPASy中的Protparam預(yù)測蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)（PI）等蛋白質(zhì)基本性質(zhì)。在NCBI中的Conserved Domain Database在線軟件中分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域。通過TMHMM Server（v2.0）軟件對(duì)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。在TargetP 1.1 Sever軟件中分析蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，Singalp 3.0 Sever進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測，使用SOPMA軟件對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。之后使用SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測。最后，在MEGA7.0軟件中使用鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 進(jìn)化分析與正選擇位點(diǎn)的確定

通過Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA7.0軟件中的臨近法，bootst rap值設(shè)為1000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析，在分子水平上度量選擇壓力時(shí)，可通過估算核苷酸序列非同義替換率（N）與同義替換率（S）的比值（）來推測出其進(jìn)化趨勢與所經(jīng)受的選擇壓力。當(dāng)N＝S，即＝1表現(xiàn)為中性選擇；當(dāng)N＜S，即＜1，表明受到負(fù)選擇；當(dāng)N＞S，即＞1，表明出現(xiàn)了正選擇，若顯著大于1可被視為蛋白質(zhì)發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化的證據(jù)[10]。使用PAML軟件中的Comdelc程序的位點(diǎn)模型對(duì)刺五加的基因在進(jìn)化過程中所受到的選擇壓力進(jìn)行分析。

位點(diǎn)模型假設(shè)不同位點(diǎn)的值不同，但進(jìn)化樹上各分支值相同。本研究采用M1a（近中性）對(duì)M2a（正選擇），M0（單一比值）對(duì)M3（離散）和M7（beta）對(duì)M8（beta&）3對(duì)模型進(jìn)行LRT檢驗(yàn)來驗(yàn)證模型之間是否存在差異。其中M0（單一比值）對(duì)M3（離散）的比較是為了驗(yàn)證不同位點(diǎn)的值是否不同，M7（beta）對(duì)M8（beta&ω）易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，所以選擇M1a（近中性）對(duì)M2a的檢測結(jié)果為可能的正選擇位點(diǎn)[10]。并將序列數(shù)據(jù)提交到Datamonkey（http://www. datamonkey.org/）和MEC（http:// selecton. tau.ac.il/）。使用Datamonkey Web服務(wù)器中的固定效應(yīng)似然模型（fixed effects likelihood model，F(xiàn)EL）和單一似然祖先計(jì)數(shù)法（single likelihood ancestor counting，SLAC）對(duì)位點(diǎn)的選擇壓力進(jìn)行在線分析，對(duì)于SLAC、FEL方法而言，處于＜0.1水平的位點(diǎn)即可認(rèn)為是受正選擇的影響[10]。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

使用RSEM得到每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)基因上的read count數(shù)目，以FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）來確定每個(gè)基因的表達(dá)水平。接著，使用EBSeq進(jìn)行差異分析，將FDR＜0.01且|log2(FC)|≥1作為篩選基因表達(dá)出現(xiàn)顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)old Change表示2樣品（組）間表達(dá)量的比值，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）是通過對(duì)差異顯著性值進(jìn)行校正得到的。

2.4 基因表達(dá)量的測定

以“2.1”項(xiàng)中的cDNA作為qRT-PCR模板，以刺五加基因?yàn)閮?nèi)參基因，并對(duì)篩選得到的9條差異表達(dá)的基因，設(shè)計(jì)qRT-PCR的特異性擴(kuò)增引物（表1）。進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本重復(fù)3次?？偡磻?yīng)體系為10 μL，上、下游引物各0.3 μL，cDNA模板0.5 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，RNase-Free ddH2O 2.9 μL，2×Talent qPCR PreMix 5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，5 s；退火55 ℃，10s；延伸72 ℃，15s，共40個(gè)循環(huán)?；??ΔΔCt方法計(jì)算各樣本中的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 EsP450基因及GAPDH基因qRT-PCR的引物序列

2.5 皂苷含量的測定及相關(guān)性分析

參考文獻(xiàn)的方法[11]，對(duì)樣品進(jìn)行烘干、研末、稱重、乙醇溶解超聲破碎提取后，進(jìn)行石油醚除色素，正丁醇萃取，通過香草醛-濃硫酸顯色法在543 nm的波長下測得其吸光度后，將其帶入齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（=0.185 6－0.011 7，2=0.996 4）進(jìn)行重復(fù)多次計(jì)算，得到刺五加樣本總皂苷含量。使用SPSS 18.0軟件分析基因表達(dá)量與皂苷含量間的相關(guān)性。

3 結(jié)果與分析

3.1 P450基因鑒定及其蛋白理化性質(zhì)

篩選轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)獲得的刺五加unigenes，將其中標(biāo)記為基因的序列調(diào)出，與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行逐一比對(duì)，之后借助Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域的鑒定，最終確定其中存在18條，其中TRINITY_DN41836_c0_g1、TRINITY_ DN5264_ c0_g2、TRINITY_DN10211_c0_g2和TRINITY_ DN1308_c0_g1均缺少了編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，推測為轉(zhuǎn)錄組拼接過程中丟失了前端部分序列，其余14條基因具有完整的開放閱讀框。

EsP450蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明（表2），各EsP450的長度、等電點(diǎn)方面有很大差異。編碼的氨基酸長度在122～746 aa；相對(duì)分子質(zhì)量介于13 629.50～83 620.79；等電點(diǎn)在5.78～9.55，堿性蛋白占據(jù)多數(shù)，共12個(gè)，酸性蛋白共6個(gè)；不穩(wěn)定系數(shù)介于31.88～64.80，平均值為42.22，總體上穩(wěn)定性較差；脂溶指數(shù)在83.09～102.21，平均值為95.21，親水系數(shù)均為負(fù)值，因此推測EsP450蛋白為親脂性蛋白質(zhì)。

表2 刺五加P450蛋白的基本理化特性

3.2 P450蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析

在刺五加P450蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（表3）中，α-螺旋（23.77%～54.35%）＞無規(guī)則卷曲（31.79%～49.18%）＞延伸鏈（9.24%～18.03%）＞β-轉(zhuǎn)角（3.24%～9.02%）。因此推測二級(jí)結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用的是α-螺旋。信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果表明，P450蛋白中含有信號(hào)肽的可能性較小，推測為胞內(nèi)蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果分析，1個(gè)位于細(xì)胞核，1個(gè)位于線粒體，2個(gè)位于質(zhì)膜，1個(gè)位于葉綠體類囊體膜，5個(gè)位于過氧化物酶體，8個(gè)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，推測P450蛋白在不同的位置實(shí)現(xiàn)氧化功能。

3.3 保守結(jié)構(gòu)域分析

為了進(jìn)一步探索的功能作用和進(jìn)化關(guān)系，使用篩選出的18條以及來自擬南芥的52條的氨基酸序列，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建了P450的ML系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。如圖1所示，分別屬于不同家族。其中，CYP72家族與CYP82家族各有3條；CYP81家族與CYP94家族各有1條為TRINITY_DN4544_c0_g1和TRINITY_DN6616_c0_ g1；而刺五加P450基因并未分布在CYP70家族和CYP76家族中；而4條（TRINITY_DN11618_c0_g1、TRINITY_DN3437_c0_g1、TRINITY_DN1436_c0_g1、TRINITY_DN3773_c0_g1）序列與代表序列的同源性過小，因此無法歸屬；其余序列全部分布在多基因簇CYP71家族中。根據(jù)刺五加核苷酸序列，使用鄰位相連法再次進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建（圖2），未鑒定出所在家族的4條基因，經(jīng)過BLAST比對(duì)與基因結(jié)構(gòu)分析后，確認(rèn)TRINITY_DN3437_c0_g1、TRINITY_DN1436_c0_g1和TRINITY_DN3773_c0_g1屬于CYP71家族，TRINITY_DN11618_c0_g1，除了dnak保守結(jié)構(gòu)域外，還包含了CYP71家族保守基序，因此將其歸屬為CYP71家族。

表3 刺五加P450蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位

紅星為刺五加中的P450基因

在進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析時(shí)發(fā)現(xiàn)（圖2），基因的motif中存在典型的保守結(jié)構(gòu)域。這些典型的保守結(jié)構(gòu)域主要包括PERF結(jié)構(gòu)域（PXRX）、K螺旋（EXXR）和C末端的血紅素結(jié)合域（FXXGXXXCXG）。血紅素結(jié)合域存在鐵元素形成硫醇鹽離子鍵的絕對(duì)保守的半胱氨酸殘基，該結(jié)構(gòu)域也是P450蛋白的特征結(jié)構(gòu)，其中，血紅素結(jié)合域存在于motif 1，PERF結(jié)構(gòu)域存在于motif 7，K螺旋存在于motif 5。在全部序列中均較測到了motif 1與motif 7，除TRINITY_DN41836_c0_g1外，其他序列還共同擁有motif 3。但K螺旋所在的motif 5只存在于分支Ⅱ全部序列、分支Ⅰ除TRINITY_DN41836_c0_g1外全部序列、以及TRINITY_DN1051_c3_g1、TRINITY_DN6616_c0_ g1中，在進(jìn)行多序列比對(duì)確認(rèn)后，發(fā)現(xiàn)K螺旋確實(shí)存在于除TRINITY_DN41836_c0_g1外全部序列，而TRINITY_DN41836_c0_g1轉(zhuǎn)錄本序列為934 bp，但其編碼形成的多肽鏈僅有122 aa，因此推測為在轉(zhuǎn)錄組拼接時(shí)出現(xiàn)了丟失，從而證實(shí)了篩選得到的P450真實(shí)性。

A-P450基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 B-motif C-domain

3.4 選擇壓力分析

利用PLAM軟件中的Comedlc程序檢測EsP450家族中的每個(gè)位點(diǎn)的選擇壓力（表4）。單比率模型M0的參數(shù)np＝35，似然值ln＝?4 587.954 733；離散模型M3的參數(shù)np＝39，似然值ln＝?4 519.625 208，兩者之間的LRT檢驗(yàn)＜0.001。備擇假設(shè)模型M3成立，M3優(yōu)于M0，說明各個(gè)位點(diǎn)存在選擇嚴(yán)壓力的差異。M3的2小于1，說明不存在正選擇位點(diǎn)。模型M1a與M2a的2Δln＝0，＝1，說明備擇假設(shè)M2a不成立。在模型M7與M8比較中，df＝2，2Δln＝0.198 608，得到＝0.905 07，說明模型M8不成立基于Datamonkey檢測選擇壓力：分別以SLAC模型與IFEL模型進(jìn)行正選擇位點(diǎn)的鑒定。SLAC模型在＜0.1水平下檢測到6個(gè)（2E、34K、64K、125R、223L、334E）正選擇位點(diǎn)，14個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)；在＜0.05水平下，檢測到5個(gè)（160K、254E、308A、356H、437K）負(fù)選擇位點(diǎn)，未檢測到正選擇位點(diǎn)；在＜0.01水平下未檢測到選擇位點(diǎn)。在IFEL模型中，當(dāng)＜0.1時(shí)檢測到3個(gè)（13L、26K、45G）正選擇位點(diǎn)，19個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)；在＜0.01水平下檢測到2個(gè)（197F、310D）正選擇位點(diǎn)，6個(gè)（33K、171V、256K、343L、353L、380E）負(fù)選擇位點(diǎn)。

將刺五加18條基因序列上傳至在線服務(wù)器MEC內(nèi)，以Clustal W為對(duì)比方法，于TRINITY_DN11618_c0_g1一級(jí)結(jié)構(gòu)上標(biāo)注選擇壓力（圖3）。絕大部分的位點(diǎn)被標(biāo)注為紫色，其中深紫色位點(diǎn)有150個(gè)，占總位點(diǎn)的20.1%。不存在橙色標(biāo)記與黃色標(biāo)記。表明了純凈選擇在基因家族的進(jìn)化過程中占主導(dǎo)地位。

表4 刺五加P450基因基于PAML軟件的適應(yīng)性分析

黃色代表受到正選擇的位點(diǎn)，白色代表受到中性選擇，紅色代表受到負(fù)選擇的位點(diǎn)，顏色越深代表在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性越強(qiáng)

3.5 基因相對(duì)表達(dá)量與皂苷含量

從18條基因中篩選得到9條差異表達(dá)基因，對(duì)它們進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證的結(jié)果顯示，qRT-PCR得到的在各個(gè)樣品中的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致（＜0.05）。TRINITY_ DN41836_c0_g1在樣本D中表達(dá)量最高，是樣本C中表達(dá)量的19.5倍；TRINITY_DN6616_c0_g1在各樣本中表達(dá)量均較低，其中在樣本A中未檢測到其表達(dá)。4個(gè)樣本中總皂苷的含量從高到低依次為D（47.2 g/kg）＞C（37.6 g/kg）＞B（32.2 g/kg）＞A（26.1 g/kg）。使用SPSS軟件對(duì)基因表達(dá)量與總皂苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，在0.01級(jí)別檢測到了6條基因與總皂苷含量相關(guān)性顯著；在0.05級(jí)別檢測到了TRINITY_DN41836_c0_g1與總皂苷含量相關(guān)性顯著；TRINITY_DN39772_c0_g3和TRINITY_ DN5264_c0_g2與總皂苷含量不存在相關(guān)性。見圖4。

4 討論

三萜皂苷是許多藥用植物的主要活性成分之一，基因的表達(dá)水平影響了三萜皂苷在藥用植物中合成和積累量的多寡[11]。本研究從刺五加轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘出了基因家族成員，對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果表明，CYP450蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)較少，推測α-螺旋和無規(guī)則卷曲在其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示不同的CYP450定位在不同的細(xì)胞器中實(shí)現(xiàn)其氧化功能，這與前人研究結(jié)果一致[12]?；蚣易宸治龅慕Y(jié)果顯示，所在家族與已知和三萜結(jié)構(gòu)修飾有關(guān)的分布家族基本吻合[13]。在刺五加中存在的最大類型是CYP71。CYP71也是植物中最大的基因簇，這個(gè)基因簇基本上包含超過半數(shù)基因，功能非常豐富[14]，此家族中的CYP716A47和CYP716A53v2已被證實(shí)參與人參皂苷生物合成過程中2步連續(xù)的氧化反應(yīng)[15]，而刺五加與人參同屬五加科，是人參的近源物種，在刺五加CYP71家族中很可能存在參與三萜皂苷合成途徑反應(yīng)的CYP450。

A～D分別代表4株刺五加樣本 1-TRINITY_DN10211_c0_g2 2-TRINITY_DN1436_c0_g1 3-TRINITY_DN1439_c0_g1 4-TRINITY_ DN3773_c0_g1 5-TRINITY_DN39772_c0_g3 6-TRINITY_DN41836_c0_g1 7-TRINITY_DN4544_c0_g1 8-TRINITY_DN5264_c0_g2 9-TRINITY_DN6616_c0_g1

氨基酸序列的適應(yīng)性進(jìn)化能夠?yàn)檠芯棵傅幕钚晕稽c(diǎn)和功能提供有意義的信息。在植物眾多的P450中，部分為三萜皂苷生物合成通路中的關(guān)鍵酶，這些酶也是造成三萜苷元多樣性的重要原因之一。利用分子適應(yīng)性進(jìn)化原理進(jìn)行功能位點(diǎn)的篩選可以為植物P450的活性位點(diǎn)提供有價(jià)值的參考。本研究通過PAML、MEC模型、Datamonkey共3種方式對(duì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明不存在正選擇位點(diǎn)，由此推測基因以負(fù)選擇為主導(dǎo)，它們受到強(qiáng)烈的負(fù)選擇作用的約束，在長期進(jìn)化的過程中高度保守，對(duì)維持基因的重要功能起到了保護(hù)作用。比如，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)一般都受負(fù)選擇，因?yàn)樗鼈円坏┌l(fā)生突變，就會(huì)被純化處理而消失[16]。

本研究所用的不同刺五加樣本皂苷含量存在顯著差異，并且9條差異表達(dá)基因中，有7條基因的表達(dá)量與刺五加總皂苷含量成正相關(guān)關(guān)系（＜0.05）。吳鵬等[3]研究結(jié)果也表明，基因表達(dá)量與三萜皂苷含量間確實(shí)存在正相關(guān)關(guān)系，這代表參與刺五加三萜皂苷合成途徑的很可能存在于本研究篩選得到的7條差異基因中。目前預(yù)測P450的功能仍具有一定難度，今后可以對(duì)這7條基因進(jìn)行深入挖掘，開展基因克隆及功能研究，為進(jìn)一步解析三萜皂苷合成途徑提供借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification ofgene ofand its effect on saponin content

SONG Xin, CUI Ming-hui, ZHANG Duo-duo, ZHANG Jie, LIN Li-mei, XING Zhao-bin

College of Life Science, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China

To screen and identifygene in(), analyze its evolutionary characteristics, and explore the correlation betweengene and total saponins content of.According to the results of transcriptome sequencing,was screened and analyzed by bioinformatics and adaptive evolution, qRT-PCR was used to detect the expression ofand spectrophotometer was used to determine the total saponin content of.Eighteenwere screened. There was no transmembrane region in, and the secondary structure was mainly α-helix and irregular curly structure. There was no positive selection site of. The expression ofwas significantly different. Sevenwere identified, which were positively correlated with the total saponin content (＜0.05).Thewere subjected to purifying selection pressure during evolution.

(Rupr.et Maxim) Maxim; cytochrome P450; bioinformatics analysis; gene expression level; qRT-PCR

R282.12

A

0253 - 2670(2021)16 - 5012 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.026

2021-01-23

河北省自然科學(xué)基金生物醫(yī)藥聯(lián)合基金項(xiàng)目（H2020209302）；河北省教育廳資助科研項(xiàng)目（ZD2019075）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31570683）；河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（S202010081016）；華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（R2020044）；河北省大中學(xué)生科技創(chuàng)新能力培育專項(xiàng)項(xiàng)目（2021H020911）

宋 鑫（2000—），男，研究方向?yàn)樯镄畔⒃谒幱弥参镏械膽?yīng)用。

邢朝斌（1975—），男，教授，研究方向?yàn)榉肿由帉W(xué)。Tel/Fax: (0315)8805590 E-mail: xingzhb@ncst.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]