陳進(jìn)芳，陳祥慧，李 卿，馮婧嫻，周 正，張 磊，吳 宇*，黃玉香

? 藥材與資源 ?

唇形科8種藥用植物漆酶基因的發(fā)現(xiàn)與生物信息學(xué)分析

陳進(jìn)芳1，陳祥慧1，李 卿2*，馮婧嫻3，周 正4，張 磊4，吳 宇4*，黃玉香5

1. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，海南 ?？?570311 2. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬上海長征醫(yī)院藥劑科，上海 200003 3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203 4. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433 5. 泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，福建 泉州 362000

分析漆酶在唇形科藥用植物中的異同，以期為唇形科藥用植物中漆酶的后續(xù)研究提供依據(jù)。通過生物信息學(xué)方法從唇形科8種藥用植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中發(fā)掘了31個(gè)完整漆酶基因并解析其特征，包括序列的同源性、理化特征、信號(hào)肽、導(dǎo)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、糖基化與磷酸化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和銅離子結(jié)構(gòu)域等，并對(duì)它們的進(jìn)化關(guān)系以及表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析。唇形科藥用植物漆酶基因均具有典型的漆酶結(jié)構(gòu)特征，相對(duì)分子質(zhì)量在62 000左右，多數(shù)含有分泌途徑的信號(hào)肽，無規(guī)則卷曲和延伸鏈?zhǔn)瞧涠?jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成部分；通過與擬南芥和丹參漆酶共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，能將其分為7個(gè)亞族。對(duì)唇形科藥用植物漆酶基因的詳細(xì)分析，可為后續(xù)該酶基因的深入研究以及通過生物技術(shù)手段對(duì)唇形科藥用植物藥效物質(zhì)進(jìn)行代謝調(diào)控以及關(guān)鍵酶基因的定點(diǎn)突變提供參考信息。

唇形科；藥用植物；漆酶；轉(zhuǎn)錄組；生物信息學(xué)

漆酶是一種廣泛存在于自然界（細(xì)菌、真菌、植物以及動(dòng)物）中的含有多個(gè)銅離子的多酚氧化酶（EC1.10.3.2）[1]，最早由日本科學(xué)家Yoshida在漆樹中發(fā)現(xiàn)，故而得名“漆酶”[2]。它能通過自由基催化反應(yīng)機(jī)制以氧氣作為電子受體直接氧化芳香族化合物或其介體，而后在介體的介導(dǎo)下氧化大分子木質(zhì)素或者非酚型芳香族化合物，被廣泛用于工業(yè)污水處理、紡織、造紙、食品、有機(jī)合成以及生物能源等領(lǐng)域[3-4]。

漆酶在植物體內(nèi)往往以基因家族形式存在[5]，目前在玉米Linn.中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)漆酶[6]，在擬南芥(L.) Heynh.中發(fā)現(xiàn)了17個(gè)漆酶[7]，在毛果楊Torr. & Gray和歐洲云杉(L.) Karst.中分別發(fā)現(xiàn)了49和112個(gè)漆酶[8-9]，在唇形科植物丹參Bunge中先后發(fā)現(xiàn)了29和65個(gè)漆酶[10-11]，這些漆酶功能各異，發(fā)揮著復(fù)雜作用，有些甚至發(fā)揮相反作用，這為我們研究漆酶功能及其作用機(jī)制帶來了困難。

前期本課題組在研究丹參次生代謝產(chǎn)物過程中發(fā)現(xiàn)丹參漆酶與丹酚酸B生物合成密切相關(guān)[10, 12]。丹參是唇形科藥用植物的代表，唇形科為一世界性分布的較大的科，有220余屬3500余種，科內(nèi)藥用植物資源豐富[13]。丹酚酸B為酚酸類物質(zhì)，來源于苯丙氨酸代謝途徑（phenylpropanoid pathway）。苯丙氨酸代謝途徑的部分代謝產(chǎn)物，如黃酮、酚酸和木脂素等，是眾多藥用植物的藥效物質(zhì)，如黃芩中的黃芩苷，夏枯草、紫蘇和鼠尾草屬植物中的迷迭香酸等。為了給唇形科其他藥用植物的漆酶研究提供依據(jù)，本研究借助薄荷基因組進(jìn)化聯(lián)盟（mint evolutionary genomics consortium）公布的轉(zhuǎn)錄組信息[14]，對(duì)唇形科常用藥用植物的漆酶基因進(jìn)行了挖掘、鑒定和詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，包括序列特征、信號(hào)肽、導(dǎo)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)和銅離子結(jié)構(gòu)域等，并對(duì)它們的進(jìn)化關(guān)系以及表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析，以期為唇形科藥用植物中漆酶的后續(xù)研究指明方向。

1 材料

根據(jù)薄荷基因組進(jìn)化聯(lián)盟的工作成果[14]，從Dryad Digital Repository數(shù)據(jù)庫（https://doi.org/ 10.5061/dryad.tj1p3）中下載黃芩Georgi、夏枯草L.、荊芥L.、紫蘇L.、留蘭香L.、廣藿香(Blanco) Benth.、西班牙鼠尾草Vahl、撒爾維亞L. 8種唇形科藥用植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其注釋結(jié)果，每種植物的基本概況和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息如表1所示。

2 方法

2.1 漆酶基因的獲取

以漆酶英文名稱“l(fā)accase”和其保守結(jié)構(gòu)域——銅離子結(jié)構(gòu)域名稱“Cu-oxidase”為關(guān)鍵詞，在8種藥用植物的轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果中分別搜索相關(guān)基因，將獲得的基因通過blastx比對(duì)方法，在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，篩除非漆酶基因和片段基因。篩選后的基因通過Vector NTI 11軟件取其開放閱讀框（open reading frame，ORF），利用MEGA5軟件將其翻譯成氨基酸序列后，再次通過blastp比對(duì)方法在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行候選漆酶基因的同源比對(duì)，確認(rèn)其是否具有完整的漆酶功能域。

2.2 漆酶的生物信息學(xué)分析

篩選得到的漆酶氨基酸序列通過ProtParam在線工具（https://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行理化特性預(yù)測分析，包括漆酶的氨基酸數(shù)量、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)等；漆酶的信號(hào)肽預(yù)測在SignalP-5.0 Server（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）上完成；用TargetP-2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TargetP/）進(jìn)行漆酶的導(dǎo)肽預(yù)測；用SoftBerry中的ProtComp 9.0（http://linux1.softberry.com/）對(duì)漆酶進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析通過TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）完成；蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測在NetNGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc/）和YinOYang 1.2 Server（http://www. cbs.dtu.dk/services/YinOYang/）上進(jìn)行；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）完成。利用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_ automat.pl?page＝npsa_sopma.html）在線完成漆酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，包括α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等。

表1 8種唇形科藥用植物的基本信息和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

*此品非《中國藥典》收載的荊芥正品，《中國藥典》收載的荊芥實(shí)為裂葉荊芥Briq.，其干燥地上部分和干燥花穗分別以荊芥和荊芥穗入藥[15]

*This isL. and it is not the Chinese medicine recorded in Chinese pharmacopoeia. In, it isBriq. with its aerial part used as schizonepetae herba and the dried flower spikes used as schizonepetae spica[15]

2.3 漆酶的結(jié)構(gòu)域序列分析

通過Pfam 33.1（http://pfam.xfam.org/）尋找漆酶的3個(gè)銅離子結(jié)構(gòu)域，利用MEGA5軟件的ClustalW程序?qū)?個(gè)銅離子結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行多序列比對(duì)，并用WEBLOGO（http://weblogo.berkeley.edu/ logo.cgi）對(duì)漆酶銅離子結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成進(jìn)行可視化分析，所有參數(shù)選擇默認(rèn)設(shè)置。

2.4 漆酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從TAIR（The Arabidopsis Information Resource，https://www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥漆酶家族成員共17條氨基酸序列作為參考序列，同時(shí)從已報(bào)導(dǎo)的丹參文獻(xiàn)的Supplementary Text 1中獲得丹參漆酶序列[10]，利用MEGA5軟件中的ClustalW程序?qū)λ衅崦赴被嵝蛄羞M(jìn)行多重序列比對(duì)，并用鄰位連接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用自舉（Bootstrap）方法檢驗(yàn)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，重復(fù)抽樣次數(shù)設(shè)為1000，將大于50%的Bootstrap值顯示在進(jìn)化樹上。結(jié)合擬南芥中漆酶的分類[7]，對(duì)唇形科藥用植物漆酶進(jìn)行分類。

2.5 漆酶基因表達(dá)量的熱圖繪制

薄荷基因組進(jìn)化聯(lián)盟對(duì)測序的物種進(jìn)行了表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，利用R語言，將漆酶基因?qū)?yīng)的表達(dá)量從相應(yīng)物種的表達(dá)量數(shù)據(jù)庫中提取出來，用MeV（Multi Experiment Viewer）軟件進(jìn)行熱圖繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 唇形科藥用植物漆酶基因的確認(rèn)

薄荷基因組進(jìn)化聯(lián)盟對(duì)唇形科多種植物進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，并對(duì)組裝后的基因序列進(jìn)行了注釋，注釋依據(jù)為擬南芥、SwissProt和Pfam數(shù)據(jù)庫。通過“l(fā)accase”和漆酶保守結(jié)構(gòu)域“Cu-oxidase”2個(gè)關(guān)鍵詞，分別在黃芩、紫蘇、廣藿香、夏枯草、荊芥、留蘭香、撒爾維亞和西班牙鼠尾草這8種藥用植物的轉(zhuǎn)錄組中尋找到了42、50、58、81、40、64、53和50個(gè)漆酶相關(guān)注釋結(jié)果。這些漆酶相關(guān)基因與NCBI數(shù)據(jù)庫的同源比對(duì)結(jié)果顯示，黃芩、紫蘇、廣藿香夏枯草荊芥、留蘭香、撒爾維亞和西班牙鼠尾草中分別只有2、3、5、2、4、4、6和5條完整漆酶基因，其他基因均為漆酶片段基因或非漆酶基因。漆酶全長基因翻譯成氨基酸后，與NCBI數(shù)據(jù)庫的同源比對(duì)結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，這些漆酶與芝麻L. 或丹參的漆酶同源，其中與芝麻漆酶同源的有19個(gè)，黃芩和廣藿香的漆酶僅與芝麻漆酶同源。與丹參漆酶同源的漆酶蛋白有16個(gè)，這些漆酶中，與丹參漆酶相似度最高的是撒爾維亞漆酶（SoLAC3），相似度達(dá)91.63%。

表2 唇形科8種藥用植物漆酶與同源蛋白的相似性比較

3.2 唇形科藥用植物漆酶蛋白的理化特性分析

將獲得的31個(gè)完整漆酶蛋白通過ProtParam在線工具進(jìn)行理化特性分析，包括氨基酸殘基數(shù)量、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)（PI）、不穩(wěn)定系數(shù)和總平均親水性等內(nèi)容，結(jié)果如表3所示。

從表3中可以看出，漆酶的氨基酸殘基數(shù)量在513～590個(gè)氨基酸范圍內(nèi)，與同科植物丹參漆酶的長度相似[10]。其中氨基酸數(shù)量最多的是留蘭香漆酶MsLAC4，包含590個(gè)氨基酸；西班牙鼠尾草漆酶ShLAC5的氨基酸數(shù)量最少，為513個(gè)。漆酶蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量在62 000左右，相對(duì)分子質(zhì)量大小與氨基酸個(gè)數(shù)對(duì)應(yīng)，最大的是留蘭香漆酶MsLAC4，為66 580；最小的是西班牙鼠尾草漆酶ShLAC5，為57 060。文獻(xiàn)記載，菘藍(lán)漆酶為堿性蛋白，PI均在8.0以上[17]。本研究中，漆酶蛋白的PI居于5.89～9.33，其中11個(gè)漆酶的PI在7.0以下，20個(gè)漆酶的pI在7.0以上，表明唇形科植物漆酶中既有酸性蛋白，也有堿性蛋白，但以堿性蛋白居多，這與丹參漆酶類似，在丹參漆酶中，也是堿性蛋白居多[10]。在參與分析的31個(gè)完整漆酶蛋白中，只有5個(gè)的不穩(wěn)定系數(shù)在40以上，其它均小于40。蛋白的穩(wěn)定性由不穩(wěn)定系數(shù)來衡量，若不穩(wěn)定系數(shù)大于40則該蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。此結(jié)果表明絕大多數(shù)參與分析的唇形科漆酶蛋白穩(wěn)定性較好，MsLAC2、SbLAC2、SoLAC6、PcLAC5和ShLAC4的穩(wěn)定性稍差。總平均親水性系數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）用于衡量目的蛋白的總體平均親水性，除了PfLAC2和NcLAC1，其余漆酶蛋白的GRAVY值均小于0，表明參與分析的絕大多數(shù)漆酶蛋白為親水性蛋白。

表3 唇形科8種藥用植物漆酶蛋白的理化特性分析

3.3 唇形科藥用植物漆酶蛋白的糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白質(zhì)糖基化和磷酸化都是對(duì)蛋白質(zhì)的重要修飾作用，能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究熱點(diǎn)。真核生物的蛋白磷酸化位點(diǎn)主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈的羥基上，不同的蛋白激酶可識(shí)別和修飾不同蛋白質(zhì)的不同位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)唇形科8種藥用植物的31個(gè)漆酶蛋白進(jìn)行了糖基化和磷酸化潛在位點(diǎn)分析，結(jié)果如表3所示。參與分析的所有漆酶均含有潛在的糖基化和磷酸化位點(diǎn)。在糖基化位點(diǎn)分析中發(fā)現(xiàn)，SoLAC6的-糖基化（N-glyC）位點(diǎn)最少，僅為4個(gè)；SoLAC5和ShLAC3的糖基化位點(diǎn)最多，各有16個(gè)。-糖基化（-glyC）位點(diǎn)最少的是PvLAC2和ShLAC4，各為5個(gè)；SoLAC1的-糖基化位點(diǎn)最多，有21個(gè)。在磷酸化位點(diǎn)分析中，酪氨酸位點(diǎn)個(gè)數(shù)明顯少于絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn)。SoLAC1蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)最多，達(dá)57個(gè)；PcLAC4蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)最少，為31個(gè)。

3.4 唇形科藥用植物漆酶蛋白的信號(hào)肽、導(dǎo)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析

信號(hào)肽是蛋白質(zhì)-末端一段編碼長度為5～30個(gè)氨基酸的疏水性氨基酸序列，用于引導(dǎo)新合成蛋白質(zhì)向通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈。漆酶信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果顯示（表3），除了MsLAC3、ShLAC5和SoLAC3，其它漆酶都具有信號(hào)肽，信號(hào)肽長度和分裂位點(diǎn)如表3所示。為了驗(yàn)證這一預(yù)測結(jié)果，本研究又用導(dǎo)肽（導(dǎo)向序列）分析軟件對(duì)漆酶進(jìn)行了導(dǎo)肽分析，結(jié)果與信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果一致，除了上述3個(gè)漆酶，其余漆酶的導(dǎo)肽均為分泌途徑的信號(hào)肽，且預(yù)測長度與信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，所有漆酶都為分泌途徑的蛋白。

利用在線工具TMHMM Server v. 2.0對(duì)所有漆酶進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示（表3），17個(gè)漆酶沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，整條肽鏈都位于細(xì)胞膜之外；余下的14個(gè)漆酶分別具有１個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。MsLAC3、ShLAC5和SoLAC3既沒有信號(hào)肽，也沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。

3.5 唇形科藥用植物漆酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

通過蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測工具SOPMA對(duì)唇形科31個(gè)漆酶蛋白的α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等進(jìn)行在線分析。如表4所示，唇形科漆酶蛋白家族成員中均存在α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)重要結(jié)構(gòu)組件，但各結(jié)構(gòu)組件所占比例明顯不同。從表4可以看出，無規(guī)則卷曲是唇形科漆酶蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，各漆酶蛋白的無規(guī)則卷曲比例均在47%以上，其次分別為延伸鏈和α-螺旋，β-折疊所占比例最小，均在9%以下。

表4 唇形科8種藥用植物漆酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成組件比例

3.6 唇形科藥用植物漆酶蛋白的銅離子結(jié)構(gòu)域分析

漆酶是一種糖基化的多銅氧化酶，含有3個(gè)重要的銅離子結(jié)構(gòu)域，一般具有3個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)（T1、T2和T3），能結(jié)合4個(gè)銅離子。通過Pfam 33.1網(wǎng)絡(luò)工具確定了漆酶3個(gè)銅離子結(jié)構(gòu)域的位置和長度，它們?cè)谄崦钢幸訡u-oxidase_3→Cu- oxidase→Cu-oxidase_2 domain的順序連接，Cu-oxidase_3、Cu-oxidase和Cu-oxidase_2 domain的平均長度分別為116、152和138個(gè)氨基酸。將3個(gè)銅離子結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行多重序列比對(duì)后，用WEBLOGO在線工具對(duì)漆酶銅離子結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成進(jìn)行可視化分析（圖1）?？偢叨缺硎敬宋恢蒙系男蛄斜Ｊ匦?，單個(gè)氨基酸代表出現(xiàn)的頻率，HWH、HAH、HLH和HCH是4個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)，藍(lán)色下劃線放大部分具有典型的藍(lán)銅譜帶，為漆酶顯藍(lán)色的重要結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。

圖1 唇形科8種藥用植物漆酶的銅離子結(jié)構(gòu)域

3.7 唇形科藥用植物漆酶的進(jìn)化分析

為了檢驗(yàn)本研究中8種唇形科藥用植物的漆酶與同科植物丹參以及模式植物擬南芥漆酶的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA5軟件對(duì)這10種植物77個(gè)漆酶蛋白構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），并根據(jù)擬南芥漆酶的分類對(duì)唇形科漆酶進(jìn)行分類[7]。結(jié)果顯示，此進(jìn)化樹能分成7個(gè)組別。第Ⅰ組包括8個(gè)唇形科漆酶（3個(gè)丹參漆酶）和2個(gè)擬南芥漆酶（AtLAC2和AtLAC17），AtLAC2在鹽脅迫下能大幅提高轉(zhuǎn)錄水平，并改變根的伸長以適應(yīng)環(huán)境[18]，提示第Ⅰ組中的唇形科漆酶可能與植物的抗逆機(jī)制有關(guān)，很可能在鹽脅迫下改變表達(dá)水平。第Ⅱ組包括17個(gè)唇形科漆酶（3個(gè)丹參漆酶）和4個(gè)擬南芥漆酶（AtLAC4、AtLAC10、AtLAC11和AtLAC16）。AtLAC4、AtLAC11和AtLAC17與木質(zhì)素的合成密切相關(guān)[19-20]，基于該進(jìn)化樹結(jié)果，初步判斷唇形科第Ⅰ和Ⅱ組漆酶成員具有類似功能。第Ⅲ組由4個(gè)丹參漆酶和4個(gè)擬南芥漆酶（AtLAC3、AtLAC5、AtLAC12和AtLAC13）組成。AtLAC5、AtLAC12和AtLAC13能響應(yīng)脫落酸（abscisic acid，ABA）信號(hào)[7]，提示第Ⅲ組中的這4個(gè)丹參漆酶可能對(duì)ABA信號(hào)也有響應(yīng)。第Ⅳ組包括28個(gè)唇形科漆酶（16個(gè)丹參漆酶）和2個(gè)擬南芥漆酶基因（AtLAC14和AtLAC15），AtLAC14可能與低溫、干旱、洪澇和鹽脅迫有關(guān)[7]，提示該組成員可能參與逆境生長。另外，該組中的SmLAC20與丹酚酸B合成相關(guān)[10]，與SmLAC20距離最近的SoLAC1可能參與撒爾維亞的酚酸類成分合成。第Ⅴ組包括2個(gè)丹參漆酶和3個(gè)擬南芥漆酶（AtLAC7、AtLAC8和AtLAC9），據(jù)報(bào)道稱[18]，敲除AtLAC8后，擬南芥花期提前，但是花枝的葉片減少，提示該組成員可能參與植物花和葉的發(fā)育。第Ⅵ組只有1個(gè)擬南芥漆酶AtLAC1。第Ⅶ組包括1個(gè)丹參漆酶（SmLAC10）和1個(gè)擬南芥漆酶（AtLAC6），AtLAC6在低溫、洪澇、干旱和生物脅迫下均表現(xiàn)為基因下調(diào)[7]，提示該組中的丹參漆酶SmLAC10在逆境脅迫下可能也有下調(diào)趨勢(shì)。

圖2 唇形科9種藥用植物與擬南芥漆酶的NJ樹

3.8 唇形科藥用植物漆酶蛋白在葉片中的表達(dá)模式分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的FPKM（fragments per kilobase million）值，利用MeV軟件繪制熱圖，分析漆酶家族成員在不同物種葉片中的表達(dá)情況，各漆酶基因的表達(dá)量如圖3所示。在黃芩中，SbLAC2的表達(dá)量稍高于SbLAC1；在夏枯草中，PvLAC1的表達(dá)量明顯高于PvLAC2；在紫蘇中，3個(gè)漆酶的表達(dá)量接近，PfLAC3的表達(dá)量略高，PfLAC2次之，PfLAC1略低；在荊芥中，NcLAC1的表達(dá)量最高，NcLAC4的表達(dá)量最低；在留蘭香中，MsLAC4的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它3個(gè)漆酶基因；在廣藿香中，PcLAC4表達(dá)量最高；在西班牙鼠尾草中，ShLAC4的表達(dá)量最高，ShLAC1次之；在撒爾維亞中，SoLAC6的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其它5個(gè)漆酶，SoLAC1次之，SoLAC2和SoLAC4幾乎不表達(dá)。

圖3 唇形科8種藥用植物漆酶在葉片中的表達(dá)量熱圖

4 討論

漆酶作為一種廣泛存在的酶，其研究主要集中在真菌領(lǐng)域，高等植物漆酶研究正在興起。Berthet[19]和Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)擬南芥漆酶中的LAC4、LAC11和LAC17能影響木質(zhì)素合成；Pourcel等[21]發(fā)現(xiàn)漆酶與擬南芥種皮中黃酮類成分的合成相關(guān)；Ranocha等[22]和Bryan等[23]在楊樹中抑制表達(dá)LAC3后，在木質(zhì)部中發(fā)現(xiàn)了酚類物質(zhì)的增加；Li等[10]發(fā)現(xiàn)漆酶能影響丹參中丹酚酸B的合成。這些結(jié)果充分表明，漆酶在植物初生和次生代謝過程中發(fā)揮了重要作用。

無論是木脂素、黃酮類還是酚類物質(zhì)，都來源于苯丙氨酸代謝途徑，而苯丙氨酸代謝途徑中的代謝產(chǎn)物，正是很多唇形科藥用植物的特殊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，如丹酚酸B、迷迭香酸、黃芩苷、漢黃芩苷和野黃芩苷等。研究苯丙氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因譬如漆酶，對(duì)唇形科藥用植物藥效物質(zhì)的代謝調(diào)控以及定點(diǎn)突變，都具有重要意義。

本研究通過生物信息學(xué)方法，對(duì)唇形科常見的8種藥用植物漆酶基因進(jìn)行了初步分析。首先從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中尋找到潛在的漆酶基因片段，通過同源序列比對(duì)，確認(rèn)了這些漆酶基因的完整性。在此過程中，從數(shù)據(jù)庫中搜索到了大量漆酶相關(guān)基因，但最后只得到少數(shù)幾個(gè)完整的漆酶基因，這可能與轉(zhuǎn)錄組測序和拼接技術(shù)有關(guān)，后續(xù)可以通過基因克隆或是長片段轉(zhuǎn)錄組測序甚至基因組測序來獲得完整的漆酶基因序列。

文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，漆酶氨基酸序列相似性差異很大，一般不同來源的漆酶相似性低于50%[24]。本研究中，8種藥用植物漆酶與同源基因的氨基酸序列相似度在64.86%（MsLAC4）～91.63%（SoLAC3），序列差異明顯。它們與芝麻或丹參漆酶蛋白同源，這也從分子層面上支持了這些物種的親緣關(guān)系。除了黃芩，其它7種藥用植物以及丹參，都是野芝麻亞科的植物，與芝麻的親緣關(guān)系較近。序列相似度最高（91.63%）的是撒爾維亞SoLAC3與丹參漆酶，這可能是因?yàn)樗鼈兺瑢偈笪膊輰僦参?，親緣關(guān)系更近的緣故。

漆酶氨基酸序列的差異雖大，但其銅離子結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)保守。作為一種含有4個(gè)銅離子的多酚氧化酶，銅離子結(jié)構(gòu)域是漆酶序列結(jié)構(gòu)的特征部分。本研究中所有漆酶氨基酸序列均具有3個(gè)典型的漆酶Cu-oxidase結(jié)構(gòu)域及4個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)，表明它們均屬于漆酶家族成員。

8種藥用植物漆酶蛋白的理化性質(zhì)、糖基化和磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽、導(dǎo)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，都與同科植物丹參相似，從序列特征上表明了這些植物與丹參的親緣關(guān)系。

在漆酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析中，根據(jù)擬南芥漆酶基因的功能，將31個(gè)唇形科藥用植物漆酶和29個(gè)丹參漆酶分為了7組。在擬南芥漆酶分析中，AtLAC6與AtLAC14、AtLAC15歸為第Ⅳ組[7]，本研究中，AtLAC6與AtLAC14、AtLAC15分屬2組，與陸地棉漆酶基因的分組情況一致[25]，這可能是因?yàn)樵黾恿似崦傅臄?shù)量，改變了進(jìn)化樹的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致AtLAC6與AtLAC14、AtLAC15分離。

本研究為深入研究唇形科藥用植物漆酶蛋白功能和克隆其編碼基因提供了可靠依據(jù)，為通過生物技術(shù)手段調(diào)控唇形科藥用植物次生代謝物質(zhì)的合成與積累，保障唇形科藥用植物優(yōu)良品質(zhì)并不斷開發(fā)優(yōu)異品種提供了基因數(shù)據(jù)，這對(duì)發(fā)展和利用唇形科藥用植物資源具有重要參考意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Discovery and bioinformatics analysis of laccases in eight medicinal plants of Labiatae

CHEN Jin-fang1, CHEN Xiang-hui1, LI Qing2, FENG Jing-xian3, ZHOU Zheng4, ZHANG Lei4, WU Yu4, HUANG Yu-xiang5

1. Department of Pharmacy, the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570311, China 2. Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Naval Medical University, Shanghai 200003, China 3. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 4. School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China 5. School of Pharmacy, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362000, China

To provide useful information for the further study of Labiatae laccases through sequence comparison among eight Labiatae medicinal plants.Thirty-one full-length laccase genes were found from the transcriptome database of eight medicinal plants of Labiatae by bioinformatics method and their characteristics were analyzed, including sequence homology, physicochemical characteristics, signal peptides, target peptides, transmembrane helices, glycosylation and phosphorylation sites, secondary structure and Cu-oxidase domains. Their evolutionary relationships and expression patterns were also analyzed.The laccase genes of medicinal plants in Labiatae have typical laccase structures. Their molecular weight was about 62 000, and most of them contain signal peptides. Random coils and extended strands are the main components of the secondary structure of laccases. The Labiatae laccases can be divided into seven subfamilies by constructing a phylogenetic tree with laccases ofand.The detailed analysis of laccase genes in medicinal plants of Labiatae in this study will provide important information for further study of these genes as well as the regulation of the secondary metabolites of these medicinal plants through laccase mutation.

Labiatae; medicinal plants; laccase; transcription database; bioinformatics

R282.12

A

0253 - 2670(2021)16 - 4996 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.024

2021-02-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31770329）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（32070327）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2019YFC1711100）；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2019M661602）；泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校重點(diǎn)科技項(xiàng)目（XJK1601A）

陳進(jìn)芳，主管藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)和生物信息學(xué)分析。E-mail: chenjinfang8@163.com

吳 宇，助教，主要從事藥用植物功能基因發(fā)掘、表征和鑒定研究。E-mail: wuyuagnes@163.com

李 卿，副主任藥師，主要從事藥用植物代謝調(diào)控和生物信息學(xué)分析。E-mail: qli@smmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]