何巧玉，劉 靜，李春霞，王譽程，王曉麗，邢 紅，劉 虹，劉二偉，陳曉鵬

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和指紋圖譜的黃柏質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測分析

何巧玉，劉 靜，李春霞，王譽程，王曉麗，邢 紅，劉 虹，劉二偉，陳曉鵬*

組分中藥國家重點實驗室，天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

為確定質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）體現(xiàn)藥材共性的重要度提供數(shù)學(xué)評價方法，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和指紋圖譜方法，并基于Q-Marker“五原則”，對中藥黃柏從化學(xué)成分有效性以及可測性等角度進行Q-Marker預(yù)測分析。利用現(xiàn)有文獻(xiàn)對黃柏藥材Q-Marker的來源進行整合，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)并預(yù)測黃柏藥材中的核心成分。結(jié)合指紋圖譜對10批黃柏藥材進行定性和定量研究，進一步確定黃柏藥材中潛在的Q-Marker，并利用多元統(tǒng)計分析對結(jié)果進行驗證。通過文獻(xiàn)查閱確定生物堿、黃酮類以及酚酸類為黃柏Q-Marker主要來源。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明生物堿類和黃酮類具有高連接度，是其主要活性成分。同時建立了10批黃柏藥材指紋圖譜，并指認(rèn)其中8個共有成分，分別為新綠原酸、黃柏堿、木蘭花堿、4--阿魏?？鼘幩帷Ⅺ}酸藥根堿、綠原酸、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)活性和成分可測性以及Q-Marker理念，初步預(yù)測黃柏堿、4--阿魏?？鼘幩?、鹽酸小檗堿可作為黃柏藥材潛在的Q-Marker，最后利用數(shù)理統(tǒng)計方法進一步驗證了Q-Marker體現(xiàn)藥材共性的重要度。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進行初步預(yù)測，同時建立指紋圖譜結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計的黃柏藥材質(zhì)量控制方法，為黃柏藥材的Q-Marker的研究提供參考。

黃柏；質(zhì)量標(biāo)志物；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；指紋圖譜；多元統(tǒng)計分析；新綠原酸；黃柏堿；木蘭花堿；4--阿魏?？鼘幩?；鹽酸藥根堿；綠原酸；鹽酸巴馬汀；鹽酸小檗堿

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Schneid的干燥樹皮，習(xí)稱“川黃柏”。其味苦，性寒，歸腎、膀胱、大腸經(jīng)[1]，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等功效。主要用于治療濕熱瀉痢、骨蒸勞熱、黃疸尿赤及盜汗、遺精等癥[2]。黃柏主要分布于我國云南、湖北、四川、內(nèi)蒙古等地[3]。其化學(xué)成分多樣，包括生物堿類、黃酮類、酚酸類以及揮發(fā)油等其他類成分，其中生物堿類是黃柏的主要成分，含量約占3%。現(xiàn)代研究表明，黃柏藥材具有抗炎、抗真菌、抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[4-6]，因此在臨床上應(yīng)用廣泛。主要用于治療糖尿病、高血壓、急性腎炎以及月經(jīng)不調(diào)等疾病[7-8]。

在質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）確定過程中，發(fā)現(xiàn)能體現(xiàn)藥材或者方劑共性特征的成分尤為重要。Q-Marker是基于溯源與傳遞性、特有性、可測性、有效性以及處方配伍這5項核心原則的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的，與中藥的功能屬性密切相關(guān)且能夠反映中藥安全性和有效性，為中藥質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)[9-10]。指紋圖譜是目前較為成熟的發(fā)現(xiàn)不同批次產(chǎn)品共有成分的方法。但在確定的幾十甚至上百種共有成分中，每種成分體現(xiàn)共性的重要度尚無報道。數(shù)理統(tǒng)計方法如多元統(tǒng)計分析可以通過計算每種成分的變量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP）來評價成分對于共性的體現(xiàn)度。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，從整體觀角度構(gòu)建藥物靶點之間相互關(guān)系的生物網(wǎng)絡(luò)，從而有效預(yù)測相關(guān)靶點和通路的一種分析手段，其強調(diào)對信號通路的多途徑調(diào)節(jié)，同時指導(dǎo)和協(xié)助藥物重新定位，符合中藥的多成分、多途徑的作用特點[11-12]。本實驗基于生物信息、化學(xué)和數(shù)理統(tǒng)計相結(jié)合的方法預(yù)測黃柏潛在的Q-Marker，從而建立黃柏藥材的質(zhì)量控制研究方法，以期為黃柏藥材的質(zhì)量控制以及作用機制研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，包括G1311C四元梯度泵，G1329B自動進樣器，G1315D-DAD檢測器，G1316A柱溫箱，AgilentChemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、電子天平（Mettler Toledo，瑞士）、ZZ-3200DTS型超聲波清洗機（天津知著科技有限公司，功率330 W）、電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、渦旋振蕩器（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 試藥

對照品新綠原酸（批號wkq19021413）、4--阿魏?？鼘幩幔ㄅ杦kq20061906）均購自四川維克奇生物科技有限公司；對照品鹽酸藥根堿（批號Z05D10X104878）購自上海源葉生物科技有限公司；對照品黃柏堿（批號DST200217-031）、木蘭花堿（批號DST200519-004）、綠原酸（批號DST181201- 021）、鹽酸巴馬?。ㄅ朌ST190802-031）、鹽酸小檗堿（批號DST200509-028）均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司，所有對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。乙腈（色譜純，美國Fisher公司）、屈臣氏飲用水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）、磷酸（色譜純，美國Fisher公司）、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）。實驗用四川產(chǎn)黃柏藥材來源信息見表1，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)陳曉鵬副研究員鑒定為蕓香科植物黃皮樹Schneid的干燥樹皮，樣本留存于天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院樣品室。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃柏藥材Q-Marker來源的文獻(xiàn)分析

為了提升中藥材及其各類中藥產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，劉昌孝院士[9]于2016年提出中藥Q-Marker的新概念，Q-Marker的核心內(nèi)容是基于物質(zhì)有效性、特有性、傳遞與溯源性、可測性和處方配伍的“五原則”。本質(zhì)上與中藥的功能屬性密切相關(guān)，且能夠作為反映中藥有效性和安全性的標(biāo)示性物質(zhì)從而進行中藥的質(zhì)量控制研究。本研究通過文獻(xiàn)整合，確定黃柏Q-Marker的來源，為建立黃柏藥材準(zhǔn)確的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)全面的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

表1 黃柏藥材來源信息

2.1.1 基于植物親緣學(xué)及化學(xué)成分特有性探討黃柏Q-Marker 黃柏來源于蕓香科（Rutaceae）黃檗屬Rupr. 植物黃皮樹的干燥樹皮，黃檗屬植物全世界有4種，主要分布于亞洲東部，我國黃檗屬植物有2種及1變種，在東北至西南均有分布[13]。黃柏中的化學(xué)成分種類豐富，其中生物堿類、黃酮類和酚酸類成分是黃柏的主要有效成分之一，同時也是發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[4,14]。生物堿是植物進化過程中與外界環(huán)境相互作用形成的一類次生代謝產(chǎn)物，文獻(xiàn)報道[15]，小檗堿以酪氨酸（-tyrosine）作為起始，經(jīng)歷幾步后分別合成多巴胺（dopamine）和4-羥基苯乙醛（4-hydroxyphenyl- acetaldehyde），之后經(jīng)()-去甲烏藥堿合成酶（NCS）、去甲烏藥堿-6--甲基轉(zhuǎn)移酶（6-OMT）、()-烏藥堿--甲基轉(zhuǎn)移酶（CNMT）、-甲基烏藥堿- 3′-羥化酶（CYP80B3）和3′-羥基--甲基烏藥堿- 4′--甲基轉(zhuǎn)移酶（4′-OMT）的甲基化作用形成()-網(wǎng)狀番荔枝堿，由小檗堿橋酶（BBE）將其催化形成()-金黃紫堇堿[()-scoulerine]，最后經(jīng)金黃紫堇堿-9--甲基轉(zhuǎn)移酶（SMT）、氫化小檗堿合酶（CYP719A1）、四氫小檗堿氧化酶（THBO）催化形成小檗堿。黃柏堿是偽原小檗堿型生物堿，也是一種異喹啉生物堿，以2種酪氨酸衍生物的縮合為起始，經(jīng)過一系列反應(yīng)生成反式心果堿和多巴胺，反式心果堿作為前體物質(zhì)，再經(jīng)過酶催化之后而形成黃柏堿[16]。黃酮類化合物通過苯丙烷途徑將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成香豆酰-CoA，之后進入黃酮合成途徑進一步與3分子丙二酰CoA經(jīng)過分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)生成二氫黃酮類，在經(jīng)過不同合成途徑生成其他黃酮類化合物[17]。綜上，通過比較不同來源黃柏中主要成分的變化，可考慮將生物堿類成分和黃酮類成分作為黃柏Q-Marker的重要參考依據(jù)。

2.1.2 基于質(zhì)量傳遞與溯源性的黃柏Q-Marker預(yù)測分析 《中國藥典》2020年版中收載的黃柏炮制品包括鹽黃柏和黃柏炭。有學(xué)者通過比較黃柏生品與炮制品中生物堿類成分的含量，發(fā)現(xiàn)不同炮制方法和溫度是影響黃柏中生物堿類成分變化的主要因素[18]，預(yù)示著生物堿類成分在生品和炮制品之間具有傳遞性。有研究基于RPLC/Q-TOF-MS技術(shù)分析黃柏炭制前后化學(xué)成分的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生黃柏和黃柏炭的化學(xué)成分含量差異顯著，某些成分炮制后消失，另外也有新的物質(zhì)生成，與生品相比，炭制后小檗堿含量減少，黃柏堿在加熱過程中產(chǎn)生異構(gòu)化而生成了同分異構(gòu)體，有些奎尼酸衍生物在生品中含量較高，炭制后由于在高溫下羧基端發(fā)生甲酯化反應(yīng)生成奎尼酸酯衍生物而導(dǎo)致其含量降低[19]。高慧等[20]通過對黃柏炮制過程中的生物堿類成分的含量變化進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒炙和鹽炙由于在加熱條件下導(dǎo)致原有的生物堿成分小檗堿和黃柏堿發(fā)生轉(zhuǎn)化，使其含量降低。另還有學(xué)者對黃柏生品及其炮制品中8種成分進行含量測定研究，發(fā)現(xiàn)酚酸類成分綠原酸在炮制前后含量發(fā)生改變[21]。綜上所述，生物堿和酚酸類成分在炮制過程中具有傳遞性，可作為黃柏Q-Marker篩選潛在成分。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對黃柏藥材的Q-Marker預(yù)測分析

2.2.1 黃柏活性成分的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/ tcmsp.php）和ETCM數(shù)據(jù)庫（http://www.tcmip. cn/TCMIP/index.php/Home/）[22]檢索黃柏的化學(xué)成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得102種有效成分，在ETCM數(shù)據(jù)庫中以“黃柏”為關(guān)鍵詞檢索其主要活性成分，共獲得12種有效成分，合并后共獲得105種有效成分。收集活性成分相關(guān)靶點，再利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）以物種“Homo spanies”為篩選條件查詢靶點對應(yīng)的基因名稱，得到每種化學(xué)成分對應(yīng)的相關(guān)靶點共1457種，刪除重復(fù)項后，得到319種相關(guān)靶點基因。

2.2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建 將上述篩選得到的319個靶點導(dǎo)入到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/cgi/input.pl）中，物種設(shè)為“Homo sapiens”，選取打分值高于0.9的蛋白建立蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩除PPI網(wǎng)絡(luò)中離散的節(jié)點，保存為tsv文件，其中蛋白互作關(guān)系較強的是ABCB1-TP53、ABCC2-ABCG2、ADH1A-ALDH2、ADH1A-ADH1C、ADH1A-ADH1B等。再將上述文件導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.1中，利用“Network Analyzer”功能對上述PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點進行拓?fù)鋵傩苑治?，按照度值（degree）由大到小進行排序，見圖1。圖中包含249個相互作用的節(jié)點，1230條相互作用的邊，其中，度（degree）值排名前3的AKT1、JUN、MAPK1分別與44、41、41個蛋白發(fā)生相互作用。

2.2.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

（1）GO功能富集分析：利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://David-d.ncifcrf.gov/home.jsp）以＜0.05、FDR＜0.05作為篩選條件對上述319個作用靶點進行GO功能富集分析。結(jié)果得到GO條目503個，其中生物過程（biological process，BP）條目有373個，主要涉及的生物過程有RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號傳導(dǎo)、對藥物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等。細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目有38個，主要富集在質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、核質(zhì)等區(qū)域。分子功能（molecular function，MF）條目92個，主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性以及序列特異性DNA結(jié)合等功能。分別選取BP、CC、MF根據(jù)值排名前10的條目，見圖2。

（2）KEGG通路富集分析：利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://David-d.ncifcrf.gov/home.jsp）以＜0.05、FDR＜0.05為篩選條件對上述319個作用靶點進行KEGG通路富集分析。結(jié)果共得到127個條目，主要涉及的通路有：神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、癌癥通路（pathways in cancer）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、乙型肝炎（hepatitis B）、cAMP信號通路（cAMP signaling pathway）等，并選取排名前20的通路進行KEGG通路富集分析氣泡圖的繪制，見圖3。以上結(jié)果表明中藥黃柏具有多成分、多靶點的作用特點，能夠通過調(diào)控多條通路達(dá)到治療疾病的作用。

圖1 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

圖2 GO功能富集分析柱狀圖

圓點越大，富集基因的數(shù)目越多；P值越小，圓點顏色越紅，P值越大，圓點顏色越綠

2.2.4 “活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)”的構(gòu)建 將KEGG通路富集分析得到的前10條通路和這些通路涉及的148個靶點，以及靶點所對應(yīng)的84種成分導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.1中構(gòu)建黃柏“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，進行可視化分析見圖4。根據(jù)圖中節(jié)點的連接度（degree）可知，連接degree值較高的化合物有槲皮素（degree＝74）、β-谷甾醇（degree＝52）、黃柏堿（degree＝32）、木蘭花堿（degree＝32）、7-去氫豆甾醇（degree＝30）、菜油甾醇（degree＝28）、四氫非洲防己堿（degree＝24）、四氫小檗堿（degree＝24）、STOCK1N-14407（degree＝23）、丹皮酚（degree＝22）、蝙蝠葛任堿（degree＝20）、卡維丁（degree＝19）、-甲基蕓香堿（degree＝18）、丁香酚（degree＝18）、4-[()-3-hydroxyprop-1-enyl]-2,6-dimethoxyphenol（degree＝18）、原阿片堿（degree＝17）、去氫丹參酮IIA（degree＝15）、植物甾醇（degree＝15）、蝙蝠葛波酚堿（degree＝13）、4-氧代異佛爾酮（degree＝13）、丁香苷（degree＝13）、巴馬?。╠egree＝13）、油酸（degree＝12）、松柏醇（degree＝12）、小檗堿（degree＝11），表明這些活性成分可能是黃柏發(fā)揮藥效的潛在Q-Marker，以2倍中位數(shù)的degree值（degree值中位數(shù)為16）進行初步篩選，得到1個新的網(wǎng)絡(luò)，再利用1倍中位數(shù)的degree值、介數(shù)中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）值進行二次篩選，得到最終的20個關(guān)鍵靶蛋白，分別為AKT1（degree＝44）、MAPK1（degree＝41）、JUN（degree＝41）、TP53（degree＝37）、RELA（degree＝35）、TNF（degree＝35）、CXCL8（degree＝33）、HSP90AA1（degree＝31）MAPK14（degree＝28）、IL6（degree＝26）、ESR1（degree＝25）、SP1（degree＝25）、EGFR（degree＝25）、EDN1（degree＝24）、PPARA（degree＝24）、RXRA（degree＝23）、VEGFA（degree＝22）、EGF（degree＝20）、RB1（degree＝20）、PRKCA（degree＝20），預(yù)示這些靶點可能作用于癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路以及其他信號通路對某些疾病的治療發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

圖4 “黃柏活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.3 黃柏指紋圖譜定性分析

2.3.1 色譜條件 采用安捷倫Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～8 min，5%～15% A；8～12 min，15%～20% A；12～18 min，20%～25% A；18～27 min，25%～29% A；27～28 min，29%～32% A；28～31 min，32%～35% A；31～35 min，35%～95% A。體積流量1.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取新綠原酸、黃柏堿、木蘭花堿、4--阿魏?？鼘幩?、鹽酸藥根堿、綠原酸、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇溶解并稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為35、100、40、150、15、30、15、350 μg/mL的混合對照品溶液，于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 供試品溶液的制備 均勻稱取黃柏粗粉3 g，加入480 mL的水，于500 mL電熱套中煎煮至約240 mL，冷卻至室溫，經(jīng)紗布濾過，濾液用水補足240 mL，即得黃柏提取液。進樣前用0.22 μm的微孔濾膜濾過，濾液即為供試品溶液。

2.3.4 方法學(xué)考察

（1）參照峰的選擇：小檗堿作為中藥黃柏中的主要成分，依據(jù)《中國藥典》2020年版，將小檗堿作為評價黃柏質(zhì)量的指標(biāo)性成分之一，其峰面積較大，峰形較好，色譜峰較穩(wěn)定，故選擇小檗堿作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間以及相對峰高。

（2）日內(nèi)精密度：精密稱取黃柏樣品（S1），按“2.3.3”項下的方法進行供試品溶液的制備，并利用“2.3.1”項的色譜條件連續(xù)進樣6次，以小檗堿作為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰高，結(jié)果各峰的相對保留時間RSD＜0.07%，相對峰高RSD＜0.67%，相似度為1.000，表明該儀器的精密度良好。

（3）日間精密度：精密稱取黃柏樣品（S1），按“2.3.3”項下的方法進行供試品溶液的制備，并利用“2.3.1”項色譜條件選擇3 d分別連續(xù)進樣6次，以小檗堿作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰高，結(jié)果各峰相對保留時間RSD＜0.61%，相對峰高RSD＜2.05%，相似度≥0.999，表明該儀器的精密度良好。

（4）重復(fù)性試驗：精密稱取黃柏樣品（S1）各6份，按“2.3.3”項下的方法平行制備6份供試品溶液，并利用“2.3.1”項色譜條件進樣測定，以小檗堿作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰高，結(jié)果各峰相對保留時間RSD＜0.11%，相對峰高RSD＜2.87%，相似度為1.000，表明該方法的重復(fù)性良好。

（5）穩(wěn)定性試驗：精密稱取黃柏樣品（S1），按“2.3.3”項下的方法進行供試品溶液的制備，分別利用“2.3.1”項色譜條件在0、2、4、8、12、24 h進行測定，以小檗堿作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰高，結(jié)果各峰相對保留時間RSD＜0.15%，相對峰高RSD＜2.44%，相似度為1.000，表明黃柏供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3.5 指紋圖譜的建立與相關(guān)性分析 取10批黃柏藥材粉末，按“2.3.3”項下的方法制備供試品溶液，并利用“2.3.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。再將上述10批黃柏藥材的HPLC色譜圖導(dǎo)入到中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)中（2012年版），采用中位數(shù)法，時間窗設(shè)為0.1，并以測定的10批黃柏樣品中的S1樣品的圖譜作為參照圖譜并同時生成對照圖譜（R），然后對其相似度進行評價。結(jié)果共標(biāo)定出16個共有峰，將黃柏藥材指紋圖譜進行疊加，結(jié)果見圖5。相似度結(jié)果表明，黃柏藥材指紋圖譜的相似度在0.994～1.000，S1～S10相似度依次為0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、0.994、1.000、0.999，表明同一產(chǎn)地黃柏藥材的質(zhì)量穩(wěn)定均一。10批黃柏指紋圖譜共檢測到16個共有峰，經(jīng)過與混合對照品溶液圖譜的比對，指認(rèn)了其中的8個色譜峰，分別為1號峰新綠原酸、4號峰綠原酸、6號峰黃柏堿、7號峰木蘭花堿、9號峰4--阿魏?？鼘幩?、14號峰鹽酸藥根堿、15號峰鹽酸巴馬汀、16號峰鹽酸小檗堿，見圖6。

2.4 正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）

為了進一步驗證黃柏藥材潛在Q-Marker對藥材共性的體現(xiàn)程度，將10批藥材隨機分為2組，每組5批藥材，并采用有監(jiān)督模式的OPLS-DA進行組間分析。模型擬合參數(shù)2＝0.609，2＝0.896，模型預(yù)測參數(shù)2＝0.543，均大于0.5，表明所建立的模型穩(wěn)定且預(yù)測能力較強，10批黃柏樣品的OPLS- DA得分矩陣圖見圖7。

圖5 10批黃柏樣品指紋圖譜疊加圖

1-新綠原酸 4-綠原酸 6-黃柏堿 7-木蘭花堿 9-4-O-阿魏?？鼘幩?14-鹽酸藥根堿 15-鹽酸巴馬汀 16-鹽酸小檗堿

圖7 10批黃柏樣品的OPLS-DA得分圖

為了反映成分對黃柏藥材的共性表征的重要度，各成分的VIP值見圖8。來自四川的10批黃柏藥材按VIP值由小到大篩選出組間具有共性的標(biāo)志性成分，VIP值越小，成分體現(xiàn)藥材共性的重要性越大，即圖中靠右側(cè)的成分（6號峰為黃柏堿）體現(xiàn)黃柏藥材的共性的重要性最大。由于4號峰（綠原酸）和1號峰（新綠原酸）在多種中藥中普遍存在，因此不適合作為辨別藥材質(zhì)量的標(biāo)志性成分。2、8、3、5、13、11、10、12號峰尚未歸屬到具體成分。15號峰（巴馬汀）、14號峰（藥根堿）和7號峰（木蘭花堿）在目前黃柏水提物中含量較低，不宜作為檢測指標(biāo)成分。16號峰（小檗堿）及9號峰（4--阿魏?？鼘幩幔￢IP值均較小，能較好體現(xiàn)黃柏藥材共性，適宜作為黃柏藥材的Q-Marker。

2.5 黃柏藥材Q-Marker的含量測定

綜合考慮網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選成分的度值、可測性和共有成分重要性貢獻(xiàn)度，選取黃柏堿、4--阿魏酰奎寧酸、鹽酸小檗堿進行含量測定。

圖8 黃柏藥材成分的VIP

2.5.1 色譜條件 同“2.3.1”項下的色譜條件。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱定黃柏堿、4--阿魏酰奎寧酸以及鹽酸小檗堿的對照品適量，加甲醇制成含黃柏堿18.75 μg/mL、4--阿魏?？鼘幩?00.00 μg/mL、鹽酸小檗堿20.00 μg/mL的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 按“2.3.3”項下的供試品溶液的制備方法進行制備。

2.5.4 方法學(xué)考察

（1）專屬性試驗：利用上述的色譜條件，分別將空白水溶液、供試品溶液及對照品溶液進樣測定，結(jié)果其空白水溶液基線無干擾，供試品溶液無雜質(zhì)峰干擾，說明此分析方法具有良好的專屬性，結(jié)果見圖9。

（2）檢測限與定量限：以3倍的信噪比為檢測限，10倍的信噪比為定量限，實驗測得黃柏堿的檢測限為0.06 μg/mL，定量限為0.27 μg/mL，4--阿魏?？鼘幩岬臋z測限為0.56 μg/mL，定量限為1.36 μg/mL，鹽酸小檗堿的檢測限為0.25 μg/mL，定量限為0.51 μg/mL。

（3）線性關(guān)系考察：精密稱取“2.5.2”項下的混合對照品溶液，分別逐級稀釋一定倍數(shù)后，按“2.3.1”項下的色譜條件進樣測定，分別測定黃柏堿、4--阿魏?？鼘幩?、鹽酸小檗堿的峰高，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），對照品的峰高為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，結(jié)果見表2。

（4）精密度試驗：精密稱取黃柏樣品（S1），按“2.3.3”項下的方法進行供試品溶液的制備，并利用“2.3.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，計算供試品溶液中黃柏堿、4--阿魏?？鼘幩帷Ⅺ}酸小檗堿的峰高RSD分別為0.67%、0.57%、0.25%，表明儀器的精密度良好。

（5）重復(fù)性試驗：精密稱取黃柏樣品（S1）各6份，按“2.3.3”項下的方法進行供試品溶液的制備，并按“2.3.1”項下的色譜條件進行測定，計算供試品溶液中黃柏堿、4--阿魏?？鼘幩?、鹽酸小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為2.01%、2.16%、1.42%，表明該方法的重復(fù)性良好。

（6）穩(wěn)定性試驗：精密稱取黃柏樣品（S1），按“2.3.3”項下的方法進行供試品溶液的制備，分別按“2.3.1”項下的色譜條件在0、2、4、8、12、24 h進行測定，計算供試品溶液中黃柏堿、4--阿魏酰奎寧酸、鹽酸小檗堿的峰高RSD分別為2.44%、1.73%、1.57%，表明黃柏供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

6-黃柏堿 9-4-O-阿魏?？鼘幩?16-鹽酸小檗堿

（7）加樣回收率試驗：精密稱定已測定的黃柏粉末（S1）9份，將其分成3組，每組3份，每組按1∶0.8、1∶1和1∶1.2的比例分別加入黃柏堿、4--阿魏?？鼘幩?、鹽酸小檗堿對照品，按“2.3.3”項下的方法進行供試品溶液的制備，并利用“2.3.1”項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜峰的峰高以及計算各成分的含量。加樣回收率結(jié)果顯示黃柏堿、4--阿魏?？鼘幩?、鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為101.50%、99.50%、99.80%，RSD分別為1.28%、0.61%、1.40%，表明所建立的含量測定方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.5 黃柏樣品測定 分別精密稱取10批黃柏樣品，按照“2.3.3”項下的方法進行供試品溶液的制備，并按“2.3.1”項下的色譜條件進行測定，計算黃柏堿、4--阿魏?？鼘幩帷Ⅺ}酸小檗堿的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

指紋圖譜方法是目前測定不同批次產(chǎn)品共有峰，即共有成分較為成熟的方法。本研究在指紋圖譜確定共有成分的基礎(chǔ)上，利用數(shù)理統(tǒng)計方法進一步分析了每個共有成分體現(xiàn)藥材共性的重要度，賦予了共有成分新的內(nèi)涵，也為篩選Q-Marker提供了新的思路和方法。根據(jù)成分體現(xiàn)藥材共性的VIP值進行由小到大排序，基于成分含量和含量的波動情況篩選出標(biāo)志性成分，能夠更加有代表性的分析和評價藥材質(zhì)量。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得知AKT1（degree＝44）、MAPK1（degree＝41）、JUN（degree＝41）、TP53（degree＝37）等靶點可能作用于癌癥通路、PI3K-Akt信號通路以及cAMP信號通路發(fā)揮關(guān)鍵性作用。研究表明，黃柏中的生物堿成分在治療腫瘤性疾病和發(fā)揮抗炎等藥理作用上有一定療效[23-24]。有學(xué)者通過體外實驗證實黃柏中的生物堿類成分小檗堿可通過調(diào)控PI3K/Akt通路抑制喉癌Hep2細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，從而發(fā)揮一定的治療作用[25]，與本實驗研究結(jié)果一致。

表2 3個指標(biāo)性成分的線性回歸方程

在篩選核心成分的過程中，degree值排名靠前的有槲皮素、β-谷甾醇、黃柏堿、木蘭花堿、7-去氫豆甾醇、菜油甾醇、四氫非洲防己堿、四氫小檗堿、STOCK1N-14407、丹皮酚、蝙蝠葛任堿、卡維丁、-甲基蕓香堿、丁香酚、4-[()-3-hydroxyprop-1- enyl]-2,6-dimethoxyphenol、原阿片堿、去氫丹參酮IIA、植物甾醇、蝙蝠葛波酚堿、4-氧代異佛爾酮、丁香苷、巴馬汀、油酸、松柏醇、小檗堿。由于槲皮素、β-谷甾醇以及植物甾醇在自然界中普遍存在，同時這幾種成分也廣泛存在于多種中藥材中，具有多種生物活性[26-28]，因此不能作為辨別藥材質(zhì)量的標(biāo)志性成分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到的7-去氫豆甾醇、菜油甾醇、四氫非洲防己堿、四氫小檗堿、卡維丁、原阿片堿、STOCK1N-14407、丹皮酚、-甲基蕓香堿、丁香酚、4-[()-3-hydroxyprop-1-enyl]-2,6- dimethoxyphenol、原阿片堿、去氫丹參酮IIA、蝙蝠葛波酚堿、4-氧代異佛爾酮、丁香苷、油酸、松柏醇、木蘭花堿、蝙蝠葛任堿、巴馬汀在黃柏提取物中含量較低，基于成分可測性角度，不適合作為評價黃柏藥材質(zhì)量的標(biāo)志性成分。劉洋等[29]建立HPLC法對川黃柏中的鹽酸小檗堿進行含量測定及抑菌活性評價，證明鹽酸小檗堿的抑菌作用與黃柏在抗感染方面的藥理作用相一致，可考慮作為黃柏的Q-Marker。黃柏堿可通過通過調(diào)控TLR4/NLRP3信號通路來降低機體內(nèi)的炎癥因子水平，進而改善腎損傷[30]。另外，黃柏堿還可顯著抑制免疫效應(yīng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[31]，其藥理活性與黃柏的傳統(tǒng)藥效具有一定的相關(guān)性，適合作為黃柏的Q-Marker成分。

表3 10批黃柏樣品含量測定結(jié)果

阿魏?？鼘幩犷惢衔镏饕l(fā)揮抗氧化、抗腫瘤以及清除體內(nèi)自由基等多種療效[32-33]。有研究報道黃柏的樹皮提取物可以保護皮膚屏障免受空氣污染物的損害，且活性成分4--阿魏?？鼘幩崾菓?yīng)對誘導(dǎo)損傷作用的主要決定因素[34]。目前，關(guān)于化合物4--阿魏酰奎寧酸在黃柏藥材中的研究尚不廣泛，有學(xué)者在2019年利用HPLC-DAD-ESI-MS/MS技術(shù)對黃柏中的4--阿魏?？鼘幩徇M行定性定量分析[35]。

本實驗根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果可知，黃柏堿、小檗堿度值排名靠前，基于化學(xué)成分有效性角度可將這2種成分作為黃柏的質(zhì)量標(biāo)志物成分Q-Marker，根據(jù)指紋圖譜、數(shù)理統(tǒng)計及含量測定結(jié)果分析，4--阿魏?？鼘幩岷枯^高，可測性好，且能較有代表性的體現(xiàn)不同批次藥材的共性，也適合作為黃柏的Q-Marker成分。因此本實驗選擇以黃柏堿、4--阿魏?？鼘幩?、小檗堿進行定量分析，確定其Q-Marker成分。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制研究是制約中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題，自Q-Marker概念提出后，中藥質(zhì)量控制研究成為行業(yè)關(guān)注的熱點。本實驗為確定Q-Marker體現(xiàn)藥材共性的重要度提供了新的數(shù)學(xué)方法，采用傳統(tǒng)水提取進行黃柏指紋圖譜定性及定量研究，同時結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并基于Q-Marker“五原則”，從化學(xué)和生物信息學(xué)的角度預(yù)測黃柏藥材潛在的Q-Marker，為后期深入研究中藥黃柏的作用機制提供參考依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Predictive analysis ofquality markers based on network pharmacology and fingerprint

HE Qiao-yu, LIU Jing, LI Chun-xia, WANG Yu-cheng , WANG Xiao-li, XING Hong, LIU Hong, LIU Er-wei, CHEN Xiao-peng

State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617,China

To predict and analyze the potential quality markers (Q-Markers) of Huangbo ()based on the “five principles” of Q-Markers combined with fingerprint and network pharmacology methods from the perspectives of chemical composition validity and measurability and so on, so as to provide a mathematical evaluation method for determining the importance of Q-Marker to reflect the commonness of medicinal materials.The sources ofQ-Marker were integrated by existing literature, and a “component-target-pathway” network was constructed by using network pharmacology and the core components ofwere predicted, and the qualitative and quantitative research of 10 batches ofwas carried out to further determine the potential Q-Marker, and the results were verified by using multivariate statistical analysis.Literature studies had determined that alkaloids, flavonoids and phenolic acids were the main source ofQ-Marker. The results of network pharmacology showed that alkaloids and flavonoids were its main active ingredients with high connectivity. At the same time, 10 batches offingerprints were established, and eight common components, neochlorogenic acid, phellodendrine, magnoflorine, 4--feruloylquinic acid, jatrorrhizine hydrochloride, chlorogenic acid, palmatine chloride, berberine hydrochloride, were identified. Combining network pharmacological activity and component measurability as well as Q-Marker concept, it is preliminary predicted that phellodendrine, 4--feruloylquinic acid, and berberine hydrochloride could be the potential Q-Markers of. Finally, mathematical statistics methods were used to further verify the importance of Q-Marker reflecting the commonness of medicinal materials.Using network pharmacology to make preliminary predictions, and establish a method for quality control ofwith fingerprint and mathematical statistics, which provides a reference for the research on the quality control and mechanism of.

; Q-Marker; network pharmacology; fingerprint; multivariate statistical analysis; neochlorogenicacid; phellodendrine, magnoflorine; 4--feruloylquinic acid; jatrorrhizine hydrochloride; chlorogenic acid; palmatine chloride; berberine hydrochloride

R284

A

0253 - 2670(2021)16 - 4931 -11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.018

2021-04-12

重大新藥創(chuàng)制專項（2018ZY09735-002）；重大新藥創(chuàng)制專項（2019ZX09201005-002-007）；國家自然科學(xué)基金青年項目（81903915）

何巧玉（1998—），女，漢族，遼寧營口人，碩士研究生，研究方向為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制。E-mail: 15524743165@163.com

陳曉鵬（1983—），女，漢族，天津人，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制。Tel: (022)59596163 E-mail: xpchen@tjutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]