朱蕓蕓，陳 樂(lè)，魏曉晴，王梓靈，劉洪濤，杜鴻志, 3，劉大會(huì)

蘄艾治療潰瘍性結(jié)腸炎的活性篩選與作用評(píng)價(jià)

朱蕓蕓1，陳 樂(lè)1，魏曉晴1，王梓靈1，劉洪濤2，杜鴻志1, 3*，劉大會(huì)1*

1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源中心，湖北 武漢 430065 2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065 3. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700

評(píng)價(jià)蘄艾的抗炎活性，篩選其最佳抗炎活性部位，確證其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的治療作用。采用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7建立體外炎性細(xì)胞模型，給予蘄艾水部位、正丁醇部位、醋酸乙酯部位、石油醚部位進(jìn)行干預(yù)，觀察各組細(xì)胞形態(tài)；采用Griess法測(cè)定各組細(xì)胞上清液中一氧化氮（nitrite oxide，NO）水平；采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β水平；采用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞、、、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，）和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，）mRNA表達(dá)情況。利用超高效液相色譜（UPLC）法對(duì)最佳抗炎活性部位的主要化學(xué)成分進(jìn)行定量分析。建立2.5%葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的小鼠UC模型，給予蘄艾醋酸乙酯部位和異澤蘭黃素，記錄各組小鼠體質(zhì)量、攝食量和飲水量變化，并進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分；測(cè)量結(jié)腸組織長(zhǎng)度，并采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察各組小鼠結(jié)腸組織病理變化；采用免疫組化法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）表達(dá)情況。與模型組比較，10 μg/mL蘄艾醋酸乙酯部位能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的分化程度，顯著降低上清液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平（＜0.01），下調(diào)、、、、和mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01）。異澤蘭黃素在蘄艾醋酸乙酯部位中具有最高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為該部位中的主要成分。與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低（＜0.01），DAI評(píng)分升高（＜0.01），結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（＜0.01），結(jié)腸組織中、、和mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），ZO-1表達(dá)減少；給予蘄艾醋酸乙酯部位和異澤蘭黃素后，上述指標(biāo)均得到顯著改善（＜0.05、0.01）。蘄艾醋酸乙酯部位具有最佳的體外抗炎活性，醋酸乙酯部位及其主要成分異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠有較好的治療作用。

蘄艾；RAW264.7細(xì)胞；抗炎活性；潰瘍性結(jié)腸炎；異澤蘭黃素

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是世界范圍內(nèi)一種高發(fā)的疾病，主要包括克羅恩?。–rohn’s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）[1]。近年來(lái)，隨著城市化的發(fā)展，UC的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[2]，其致病因素復(fù)雜，主要病理特征為結(jié)腸黏膜和黏膜下層的炎性反應(yīng)和潰瘍性病變，發(fā)病時(shí)臨床表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、腹瀉、腹痛和直腸出血等，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸癌[3]。目前臨床主要以氨基水楊酸鹽、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑等緩解UC，可能會(huì)引起惡心、嘔吐、頭痛、腹瀉、血液紊亂、腎毒性、低鉀血癥以及帶狀皰疹、上呼吸道和尿路感染等嚴(yán)重的不良反應(yīng)[4]，因此抗IBD藥物的開(kāi)發(fā)為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

艾葉為菊科蒿屬植物艾Levl. et Vant.的干燥葉片，在我國(guó)各地均有分布，主產(chǎn)于湖北、河南、河北等地，其中湖北蘄艾為著名道地藥材，被譽(yù)為“四大名艾”之一。艾葉的功能主治最早記載于《名醫(yī)別錄》[5]，載其“……可作煎，止下痢，吐血……”，在隨后的歷代本草中記載的功能亦多有“止痛”“止血”“臍痛”“止痢”“止泄”等，臨床研究顯示艾葉對(duì)消化系統(tǒng)疾病的療效顯著，常用于治療心腹冷痛、泄瀉、久痢、下血等癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，艾葉富含揮發(fā)油、黃酮、酚酸等活性成分，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等藥理作用[6]；艾葉提取物和艾葉中多種化合物具有抗炎活性[7-8]，艾灸對(duì)UC具有一定的治療作用[9]，但艾葉治療UC的活性部位及活性成分尚未確證。

巨噬細(xì)胞是啟動(dòng)、維持和抑制炎性反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞[10]。由脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）激活的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生導(dǎo)致炎性反應(yīng)的促炎介質(zhì)[11]。本研究采用LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7建立體外炎性細(xì)胞模型，篩選蘄艾抗炎活性的有效部位，并利用超高效液相色譜（UPLC）法測(cè)定最佳抗炎部位的主要成分；進(jìn)一步考察最佳活性部位及主要成分對(duì)葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的UC小鼠的治療作用，以期為蘄艾治療UC提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量19～21 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（遼）2020-0001。動(dòng)物于湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，動(dòng)物飼養(yǎng)使用的標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料和水以及所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，倫理批準(zhǔn)號(hào)SYXK2017-0067-2020-15。

1.2 細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室饋贈(zèng)，冷藏于液氮罐中。

1.3 藥材

蘄艾采自湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)劉大會(huì)教授鑒定為蘄艾Levl. et Vant. cv. Qiai。

1.4 藥品與試劑

對(duì)照品異澤蘭黃素（批號(hào)PS020254，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）和棕矢車(chē)菊素（批號(hào)PS001167，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)A11H00K）購(gòu)自美國(guó)Gemini公司；LPS、DSS購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（批號(hào)40734ES75）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；一氧化氮（nitrite oxide，NO）試劑盒（批號(hào)S0021）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β ELISA試劑盒（批號(hào)20210113）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；緊密連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；乙醇、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；TNF-α、IL-6、IL-1β、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.5 儀器

1260型UPLC色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；QFN-DGJ-N型冷凍干燥機(jī)（上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司）；Bio-Tek Synergy 2型酶標(biāo)儀（美國(guó)Gene公司）；311型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；IX-73P1F型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；LC480型qRT-PCR儀（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）。

2 方法

2.1 蘄艾不同萃取部位樣品的制備

精確稱(chēng)取經(jīng)粉碎后的蘄艾粉末200 g，分別用8、6、6倍量的60%乙醇超聲提取3次，60 min/次，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀。浸膏以適量蒸餾水分散，依次用等體積的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取3次，減壓濃縮后得到石油醚部位1.28 g、醋酸乙酯部位6.57 g、正丁醇部位2.48 g、水部位5.55 g。將上述樣品用二甲基亞砜（DMSO）分別配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的儲(chǔ)存液，備用。

2.2 蘄艾不同萃取部位抗炎活性的篩選

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳代比例為1∶4，收集細(xì)胞懸液，2000 r/min離心2 min，棄上清，加入1 mL培養(yǎng)基重懸，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以1×105/mL接種于96孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組和蘄艾不同萃取部位（5、10、20、50、100、200 μg/mL）組，小心吸去上清液，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；每孔加入15 μL MTT溶液，避光孵育4 h，小心吸去上清，每孔加入100 μL DMSO，避光振蕩，待紫色結(jié)晶完全溶解后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝給藥/對(duì)照

2.2.3 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以1×105/mL接種于已放置玻璃圓片的12孔板，1 mL/孔，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、石油醚部位（10 μg/mL）組、醋酸乙酯部位（10 μg/mL）組、正丁醇部位（10 μg/mL）組和水部位（10 μg/mL）組，模型組和各給藥組加入LPS（1 μg/mL），各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；吸去上清，將玻璃圓片取出，進(jìn)行羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色，于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.2.4 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以2×105/mL接種于24孔板，1 mL/孔，培養(yǎng)24 h。按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，吸取上清，5000 r/min離心3 min，采用Griess法測(cè)定細(xì)胞上清液中NO水平，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.2.5 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞、、、、和mRNA表達(dá)的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以2.5×105/mL接種于6孔板，2 mL/孔，培養(yǎng)24 h。按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，棄上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.3 蘄艾醋酸乙酯部位成分分析

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取異澤蘭黃素和棕矢車(chē)菊素對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容，制得含異澤蘭黃素171.50 mg/L、棕矢車(chē)菊素95.06 mg/L的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘄艾醋酸乙酯部位干燥粉末20 mg，以20 mL甲醇超聲溶解并定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3.3 色譜條件 參照羅丹丹等[12]的UPLC方法測(cè)定蘄艾醋酸乙酯部位中的主要成分。Zorbaxr RHD Eclipse Plus 95A C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～0.3 min，2%～5% B；0.3～1.0 min，5% B；1.0～7.0 min，5%～20% B；7.0～9.0 min，20% B；9.0～9.5 min，20%～25% B；9.5～12.5 min，25%～28% B；12.5～18.0 min，28%～40% B；18.0～18.3 min，40%～80% B；18.3～21.0 min，80%～98% B；21.0～24.0 min，98% B；體積流量為0.5 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。對(duì)該法進(jìn)行方法學(xué)考察，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率均符合含量測(cè)定要求。

2.4 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠的治療作用

2.4.1 造模、分組與給藥 BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、醋酸乙酯部位（1 g/kg）組和異澤蘭黃素（80 mg/kg）組，每組12只。對(duì)照組和模型組ig 0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)14 d。自給藥第8天，將模型組和各給藥組飲水換為2.5% DSS溶液，每天記錄小鼠體質(zhì)量、飲食和飲水量。

2.4.2 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分的影響 每天觀察并記錄各組小鼠的一般情況，進(jìn)行DAI評(píng)分[13]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

DAI＝(體質(zhì)量下降＋糞便性狀＋便血情況)/3

表2 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.4.3 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響 給藥結(jié)束后，小鼠吸入乙醚麻醉處死，迅速剖取結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并拍照，剪取結(jié)腸端1～2 cm，于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片后，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。

2.4.4 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織、、和mRNA表達(dá)的影響 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組小鼠結(jié)腸組織總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。

2.4.5 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織ZO-1表達(dá)的影響 取各組小鼠結(jié)腸組織，于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟至水，經(jīng)抗原修復(fù)、畫(huà)圈自發(fā)熒光淬滅、血清封閉等操作后，加入ZO-1抗體（1∶2000），4 ℃孵育12 h；將玻片置于PBS（pH 7.4）中，在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體覆蓋組織，避光室溫孵育50 min，再次洗滌后，在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min，洗滌后加抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 蘄艾不同萃取部位抗炎活性的篩選

3.1.1 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 如圖1所示，蘄艾水部位（5～200 μg/mL）組細(xì)胞存活率均大于90%，無(wú)細(xì)胞毒性；蘄艾正丁醇部位（100、200 μg/mL）組細(xì)胞存活率小于50%，表明該部位安全劑量為5～50 μg/mL；蘄艾醋酸乙酯部位（≥20 μg/mL）組和蘄艾石油醚部位（≥20 μg/mL）組細(xì)胞存活率均小于50%，表明該部位安全劑量為5～10 μg/mL。因此，選取不同萃取部位對(duì)細(xì)胞存活率均無(wú)明顯影響的質(zhì)量濃度（10 μg/mL）開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

3.1.2 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響 如圖2所示，對(duì)照組細(xì)胞呈圓形，成群，類(lèi)似“葡萄串”；模型組細(xì)胞呈現(xiàn)除多邊形、梭形等不規(guī)則形狀，生出偽足，分化情況嚴(yán)重；各給藥組細(xì)胞形態(tài)趨向正常，表明蘄艾不同萃取部位對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)具有一定的抑制作用。

3.1.3 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響 如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高（＜0.01），提示炎性細(xì)胞模型構(gòu)建成功。與模型組比較，蘄艾不同萃取部位組細(xì)胞上清液中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著降低（＜0.05、0.01），其中以醋酸乙酯部位抑制作用最為顯著，表明蘄艾醋酸乙酯部位具有最佳的體外抗炎活性。

圖2 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響(×400)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下同

3.1.4 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞、、、、和mRNA表達(dá)的影響 如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞、、、、和mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，蘄艾不同萃取部位組細(xì)胞、和mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），蘄艾醋酸乙酯部位、正丁醇部位和石油醚部位組細(xì)胞、和mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），其中以醋酸乙酯部位的抑制作用最為顯著，進(jìn)一步明確蘄艾醋酸乙酯部位為最強(qiáng)的抗炎活性部位。

圖4 蘄艾不同萃取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、iNOS和NLRP3 mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

3.2 蘄艾醋酸乙酯部位的成分分析

如圖5所示，蘄艾醋酸乙酯部位主要含黃酮類(lèi)成分異澤蘭黃素、棕矢車(chē)菊素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.81%、0.84%，其中以異澤蘭黃素最為豐富，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，表明異澤蘭黃素可能為蘄艾醋酸乙酯部位發(fā)揮抗炎作用的重要活性成分。

3.3 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠的治療作用

3.3.1 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠體質(zhì)量、攝食量和飲水量的影響 如圖6所示，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)；模型組小鼠造模6 d后，活動(dòng)能力、體質(zhì)量開(kāi)始下降，毛色無(wú)光澤，造模第7天體質(zhì)量顯著降低（＜0.05）；各給藥組小鼠體質(zhì)量下降趨勢(shì)稍緩。各組小鼠攝食量、飲水無(wú)明顯差異。

1-棕矢車(chē)菊素 2-異澤蘭黃素

圖6 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠體質(zhì)量 (A)、攝食量 (B) 和飲水量 (C)的影響(, n = 12)

3.3.2 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠DAI評(píng)分的影響 模型組小鼠造模第4天出現(xiàn)排便次數(shù)增加、稀便、水樣便等情況，第6天出現(xiàn)大便隱血、血便情況。如圖7所示，與對(duì)照組比較，造模第7天模型組小鼠DAI評(píng)分顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠活動(dòng)增加，毛發(fā)色澤改善，且大便性狀也有所改善，DAI評(píng)分顯著降低（＜0.05），表明異澤蘭黃素及蘄艾醋酸乙酯部位對(duì)UC小鼠有一定的緩解作用。

3.3.3 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和形態(tài)的影響 如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著減?。ǎ?.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著增大（＜0.05）。對(duì)照組小鼠結(jié)腸形態(tài)完整，無(wú)充血、水腫、潰瘍等，模型組小鼠結(jié)腸充血、水腫，潰瘍情況嚴(yán)重；蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素小鼠結(jié)腸黏膜有一定程度的水腫，潰瘍程度較模型組減少。

圖7 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠DAI評(píng)分的影響(, n = 12)

圖8 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響(, n = 12)

3.3.4 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響 如圖9所示，模型組結(jié)腸組織可見(jiàn)黏膜潰瘍、上皮破裂、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸腺及隱窩大部分結(jié)構(gòu)被破壞；各給藥組結(jié)腸組織病理?yè)p傷減輕，表明蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素能夠減輕UC小鼠結(jié)腸組織的損傷。

3.3.5 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織、、和mRNA表達(dá)的影響 如圖10所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織α、、和mRNA表達(dá)水平明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠結(jié)腸組織、、和mRNA表達(dá)水平明顯升高（＜0.05、0.01），表明蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素能夠抑制UC小鼠結(jié)腸組織中炎性因子表達(dá)。

圖9 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響(HE, ×100)

圖10 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2 mRNA表達(dá)的影響()

3.3.6 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白表達(dá)的影響 如圖11所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低；與模型組相比，各給藥組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1蛋白表達(dá)升高，表明蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素可以有效保護(hù)UC小鼠腸道黏膜。

4 討論

炎性反應(yīng)是機(jī)體的一種自我保護(hù)反應(yīng)，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，機(jī)體通過(guò)多種細(xì)胞及因子來(lái)進(jìn)行調(diào)控，而過(guò)度的炎性反應(yīng)會(huì)造成免疫調(diào)控失衡，進(jìn)而對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重傷害。巨噬細(xì)胞是人體內(nèi)固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，經(jīng)LPS刺激后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，同時(shí)分泌產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2等多種細(xì)胞因子[15]，其中過(guò)表達(dá)的iNOS可以通過(guò)-精氨酸途徑合成大量NO。NLRP3是NLR家族最重要的炎癥小體，巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR-4）受到LPS刺激后，上調(diào)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）介導(dǎo)的pro-IL-1β，pro-IL-1β經(jīng)剪切后形成成熟的IL-1β并被釋放到細(xì)胞外[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL蘄艾不同部位萃取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分化均有不同程度的恢復(fù)作用，并能夠顯著抑制NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的分泌；除水部位外，正丁醇、醋酸乙酯、石油醚部位均能夠顯著下調(diào)、、等炎性因子mRNA表達(dá)水平，4個(gè)極性部位萃取物對(duì)、、等促炎介質(zhì)的mRNA表達(dá)水平均有顯著抑制作用，其中蘄艾醋酸乙酯部位表現(xiàn)出最佳的抗炎活性。

圖11 蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白表達(dá)的影響(×200)

為了明確蘄艾醋酸乙酯部位發(fā)揮抗炎活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用UPLC法對(duì)醋酸乙酯部位主要成分進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)異澤蘭黃素在醋酸乙酯部位中具有最高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而異澤蘭黃素被多次報(bào)道具有較好的抗炎活性。異澤蘭黃素可以降低BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中亞硝酸鹽、IL-6、TNF-α和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等炎性反應(yīng)標(biāo)志物的分泌，從而發(fā)揮抗炎作用[17]。異澤蘭黃素能夠減輕LPS引起的大鼠急性肺損傷，通過(guò)降低表面活性劑蛋白、IL-6、TNF-α等炎性因子表達(dá)水平，從而發(fā)揮對(duì)肺部損傷的保護(hù)作用[18]。

UC是一種常見(jiàn)的腸道炎癥疾病，中醫(yī)認(rèn)為UC屬于“痢疾”“泄瀉”“腸癖”“下利”等范疇，而艾葉在多部古籍中被記載具有治療“痢疾”的功效[19]。本研究以DSS誘導(dǎo)的UC模型評(píng)價(jià)蘄艾醋酸乙酯部位及其主要成分異澤蘭黃素對(duì)UC小鼠的治療作用，結(jié)果顯示，蘄艾醋酸乙酯部位及其主要成分異澤蘭黃素均能夠緩解由DSS引起的小鼠體質(zhì)量減輕、結(jié)腸縮短，顯著下調(diào)DAI評(píng)分，并顯著抑制腸道炎性因子、、和mRNA表達(dá)水平。結(jié)腸上皮屏障的功能主要由Claudins、occludin和黏附分子等跨膜蛋白控制，ZO-1能夠通過(guò)與跨膜蛋白o(hù)ccludin、claudins、黏附分子A和肌動(dòng)蛋白相互作用，將胞質(zhì)蛋白與細(xì)胞骨架系統(tǒng)穩(wěn)定地連接在一起[20]。研究發(fā)現(xiàn)，UC中結(jié)腸組織ZO-1表達(dá)降低[21]，結(jié)腸上皮屏障破壞后細(xì)菌和其他病原體侵入，進(jìn)一步促進(jìn)腸道炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘄艾醋酸乙酯部位及其主要成分異澤蘭黃素能夠在一定程度上恢復(fù)由DSS導(dǎo)致的腸道屏障功能受損，從分子結(jié)構(gòu)層面進(jìn)一步證實(shí)了蘄艾醋酸乙酯部位及異澤蘭黃素對(duì)UC的治療作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蘄艾最佳抗炎活性部位為醋酸乙酯部位，蘄艾醋酸乙酯部位能夠通過(guò)抑制炎性因子表達(dá)、保護(hù)腸道屏障功能，從而治療UC，黃酮類(lèi)成分異澤蘭黃素可能為該部位中的主要抗炎活性成分之一。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Activity screening and evaluation ofin treatment of ulcerative colitis

ZHU Yun-yun1, CHEN Le1, WEI Xiao-qing1, WANG Zi-ling1, LIU Hong-tao2, DU Hong-zhi1, 3, LIU Da-hui1

1. Resource Center of Chinese Material Science, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 2. School of Basic Medicine, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 3. National Resource Center for Chinese Material Medica, State Key Laboratory of Dao-di Herbs Breeding Base, China Academy of Chinese Material Science, Beijing 100700, China

To evaluate the anti-inflammatory activity of Qiai (), screen its best anti-inflammatory activity site and confirm its therapeutic effect on ulcerative colitis (UC).Lipopolysaccharides (LPS) was used to induce mouse mononuclear macrophages RAW264.7 to establish aninflammatory cell model. The water part,-butanol part, ethyl acetate part and petroleum ether part fromwere intervened, cell morphology of each group were observed; Griess method was used to determine the level of nitric oxide (NO) in supernatant of each group; ELISA method was used to detect levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and IL-1β in supernatant of each group; qRT-PCR method was used to detect mRNA expressions of,,, cyclooxygenase-2 (), inducible nitric oxide synthase () and nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3 () in each group. UPLC method was used to quantitatively analyze the main chemical components of the best anti-inflammatory active sites. UC mice model was established by 2.5% dextran sodium sulfate (DSS), ethyl acetate part fromand eupatilin were given to intervention, the changes of body weight, food intake and water intake of mice in each group were recorded, disease activity index (DAI) score was performed; Length of colon tissue was measured, and pathological changes of colon tissue of mice in each group were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining method; Immunohistochemical method was used to detect zonula occluden-1 (ZO-1) expression in colon tissue of mice.Compared with model group, 10 μg/mLethyl acetate part inhibited the differentiation of RAW264.7 cells induced by LPS, significantly reduced the levels of NO, TNF-α, IL-6 and IL-1β in the supernatant (< 0.01), down-regulated the expressions of,,,,andmRNA (< 0.05, 0.01). Eupatilin had the highest mass fraction in ethyl acetate part from, and was the main component in this part. Compared with control group, the body weight of mice in model group was significantly reduced (< 0.01), DAI score was increased (< 0.01), the length of colon was shortened (< 0.01), expressions of,,andmRNA in colon tissue were significantly increased (< 0.01), and ZO-1 expression was decreased; After given the ethyl acetate part fromand eupatilin, the above indicators were significantly improved (< 0.05, 0.01).The ethyl acetate part fromhas the best anti-inflammatory activity, ethyl acetate part fromand its main component eupatilin have a good therapeutic effect on UC mice.

Levl. et Vant.; RAW264.7 cells; anti-inflammatory activity; ulcerative colitis; eupatilin

R285.5

A

0253 - 2670(2021)16 - 4882 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.013

2021-05-01

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1700704）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-21）；湖北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（HBHZD-ZB-2020-005）

朱蕓蕓，碩士研究生，從事中藥資源與中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。E-mail: 2677007603@qq.com

杜鴻志，副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail: dhz3163@hbtcm.edu.cn

劉大會(huì)，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail: liudahui@hbtcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]