李燕華，王淑慧，李俊鵬，李文琳，左 川*，趙 芳

·藥劑與工藝·

漆黃素與β-環(huán)糊精衍生物的包合行為及性能研究

李燕華1，王淑慧2，李俊鵬1，李文琳1，左 川1*，趙 芳3*

1. 貴研鉑業(yè)股份有限公司稀貴金屬綜合利用新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650156 2. 云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650500 3. 洱源縣檢驗(yàn)檢測(cè)院，云南 大理 671200

制備漆黃素（fisetin，F(xiàn)IT）與β-環(huán)糊精衍生物的包合物，并對(duì)其包合行為和包合物的水溶性、穩(wěn)定性進(jìn)行研究。通過(guò)超聲法制備了漆黃素與2-羥丙基-β-環(huán)糊精［(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin，HP-β-CD］、2,6-二甲基-β-環(huán)糊精［(2,6-di--methyl)-β-cyclodextrin，DM-β-CD］和磺丁基醚-β-環(huán)糊精（sulfobutyl ether-β-cyclodextrin，SBE-β-CD）的包合物；采用核磁共振氫譜（1H-NMR和2D-NMR）、X射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRD）、差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、紫外-可見(jiàn)光譜法（ultraviolet-visible spectrometry，UV）、Job曲線法對(duì)包合物進(jìn)行表征；測(cè)定了包合物的水溶性，在模擬人體胃液和腸液環(huán)境下進(jìn)行了穩(wěn)定性的測(cè)試。核磁共振（1H-NMR和2D-NMR）分析表明，漆黃素從小口端進(jìn)入HP-β-CD空腔，從大口端進(jìn)入DM-β-CD和SBE-β-CD空腔。漆黃素與HP-β-CD、DM-β-CD和SBE-β-CD形成包合物后，其溶解度從0.05 mg/mL分別提高到了3.45、3.70、4.60 mg/mL。漆黃素與β-環(huán)糊精衍生物形成包合物后，其溶解度、熱穩(wěn)定性及生物環(huán)境穩(wěn)定性得到明顯提高。

漆黃素；β-環(huán)糊精；包合物；水溶性；穩(wěn)定性；溶解度

漆黃素（fisetin，F(xiàn)IT）是黃酮類黃色針狀結(jié)晶化合物，從漆樹(shù)科植物木臘樹(shù)(Sieb. et Zucc.) O. Kuntze中提取而來(lái)[1-2]，廣布在蔬菜和水果中[3-4]。因其B環(huán)上具有鄰二酚羥基的特殊結(jié)構(gòu)使漆黃素具有較強(qiáng)的藥理作用[5-8]，如抗病毒、治療黃疽型病毒肝炎[9]；抑制細(xì)胞凋亡[10]、人黑色素瘤[11]、抗血管增生[12]、神經(jīng)保護(hù)[13-14]、抗癌[15-16]等藥理活性。盡管藥物漆黃素在預(yù)防和治療疾病中有顯著的效果，但其較低的水溶性（溶解度小于1 mg/mL）[16]，化學(xué)不穩(wěn)定性，脂溶性和溶出率低，代謝較快等性質(zhì)限制了其藥物制劑和臨床應(yīng)用[17]。

β-環(huán)糊精（β-cyclodextrins，β-CD）是由α-1,4-糖苷鍵鍵接的寡聚糖，具有親脂空腔和親水外壁，獨(dú)特的理化性質(zhì)使得環(huán)糊精分子可成功地作為藥物載體[18-19]。在藥物應(yīng)用中，環(huán)糊精水溶性好且低毒、易降解，可改善藥物的溶解性，提高制劑質(zhì)量。本研究對(duì)藥物漆黃素分子與2-羥丙基-β-環(huán)糊精［(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin，HP-β-CD］、2,6-二甲基-β-環(huán)糊精［(2,6-di--methyl)-β-cyclodextrin，DM-β-CD］、磺丁基醚-β-環(huán)糊精（sulfobutyl ether-β- cyclodextrin，SBE-β-CD）包合物的水溶性和穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為藥物漆黃素的臨床應(yīng)用提供一條有效、低毒的新途徑。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-8453紫外-可見(jiàn)分光光譜儀，安捷倫科技有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器，江蘇國(guó)華儀器有限公司；BSA224S-CW分析天平，Sartorius公司；FEI PHENO掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會(huì)社；TTR 18 kW轉(zhuǎn)靶X-射線衍射儀，日本理學(xué)公司；Nicolet IS10紅外光譜儀，美國(guó)Thermo科技有限公司；STA449F3熱分析儀，德國(guó)耐馳公司；Bruker Avance 400 核磁共振儀，瑞士布魯克公司。

1.2 材料

漆黃素（C15H10O6），相對(duì)分子質(zhì)量（FW）＝286.23，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HP-β-CD（FW＝1 541.54）、DM-β-CD （FW＝1 331.36）和SBE-β-CD（FW＝1 451.29），北京百靈威科技有限公司，未經(jīng)純化直接使用；其余試劑均為分析純?cè)噭?；所有?shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2 方法

2.1 漆黃素/β-環(huán)糊精衍生物（FIT/β-CDs）物理混合物的制備

按物質(zhì)的量比為1∶1稱取漆黃素（0.01 mmol/L）和β-CDs（0.01 mmol/L）樣品于瑪瑙研缽中，加入少量水，研磨使其充分混合均勻，減壓真空干燥，得到3種FIT/β-CDs（FIT/HP-β-CDs、FIT/ DM-β-CDs、FIT/SBE-β-CDs）物理混合物。

2.2 FIT/β-CDs包合物的制備

室溫條件下，分別稱取HP-β-CD（14.6 mg）、DM-β-CD（13.3 mg）、SBE-β-CD（11.4 mg）溶于4 mL蒸餾水，超聲30 min后，逐滴加入用少量乙醇溶解的漆黃素（4.7 mg），40 ℃超聲1 h后，冷卻至室溫，0 ℃避光放置2 d，除去反應(yīng)液中乙醇，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，除去未反應(yīng)的漆黃素，將濾液減壓蒸干，得黃色固體粉末，真空干燥，分別得到FIT/HP-β-CD（產(chǎn)率74%）、FIT/DM-β-CD（產(chǎn)率80%）、FIT/SBE-β-CD（產(chǎn)率72%）包合物。

2.3 紫外光譜測(cè)定

紫外光譜測(cè)定使用Aglient 8453紫外-可見(jiàn)光譜儀，1 cm石英比色皿（1 cm×1 cm×4 cm）。實(shí)驗(yàn)測(cè)定：室溫條件，溶劑為水-乙醇（4∶1），保持漆黃素的濃度為0.016 mmol/L，分批次加入β-CDs，靜置15 min后進(jìn)行紫外光譜測(cè)定（波長(zhǎng)掃描范圍220～800 nm），濃度梯度如表1所示。

2.4 線性關(guān)系考察

配制濃度為0.012、0.016、0.020、0.024、0.028、0.032、0.036、0.04、0.044、0.048 mmol/L的漆黃素對(duì)照品溶液，并在最大吸收波長(zhǎng)365 nm處測(cè)得相應(yīng)吸光度（）分別為0.268 1、0.336 1、0.425 5、0.511 9、0.574 1、0.660 5、0.747 9、0.820 3、0.891 2、0.969 9。以漆黃素溶液的濃度（）作橫坐標(biāo)，值為縱坐標(biāo)繪制漆黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為＝19.65－0.030 99，為0.999 22，線性范圍為0.012～0.048 mmol/L。

表1 紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)定中在pH 3.0和pH 10.5條件下加入β-CDs衍生物的濃度變化

2.5 核磁共振測(cè)定

1H-NMR和二維ROESY使用瑞士Bruker公司Avance DRX 500 MHz核磁共振儀。將HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD及FIT/HP-β-CD、FIT/DM- β-CD、FIT/SBE-β-CD溶于99.98% D2O中，濾過(guò)后于298 K下［以三甲基硅（TMS）為基準(zhǔn)］測(cè)定核磁共振氫譜（1H-NMR）和二維核磁共振氫譜（2D-NMR）。

2.6 X射線粉末衍射（XRD）測(cè)定

XRD使用D/max-3B衍射儀；實(shí)驗(yàn)操作：Cu Kα（＝0.154 60 nm），40 kV，100 mA，2＝0.02°到 2＝3°～50°，速率5°/min；樣品：漆黃素、HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD、FIT/HP-β-CD、FIT/DM-β- CD、FIT/SBE- β-CD和3種FIT/β-CDs物理混合物。

2.7 熱分析測(cè)定

分別取質(zhì)量約為5～15 mg的漆黃素、HP-β- CD、DM-β-CD、SBE-β-CD及FIT/HP-β-CD、FIT/ DM-β-CD、FIT/SBE-β-CD樣品，使用型號(hào)為德國(guó)耐馳公司的STA449F3進(jìn)行熱分析測(cè)定差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）曲線和熱重分析（thermogravimetric analysis，TG）曲線。升溫速率12 ℃/min，范圍20～500 ℃，N2體積流量為70 mL/min。

2.8 SEM觀察

SEM圖通過(guò)FEI PHENO臺(tái)式掃描電鏡儀拍攝得到。測(cè)試條件：電子加速電壓為20 kV，分辨率可放大700、1500、3000倍，甚至10 000倍；樣品：漆黃素、HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD、FIT/HP- β-CD、FIT/DM-β-CD、FIT/SBE-β-CD和3種FIT/β- CDs物理混合物。

2.9 包合率的測(cè)定

取FIT/HP-β-CD、FIT/DM-β-CD及FIT/SBE- β-CD包合物真空減壓干燥（溫度60 ℃），稱適量的干燥物，加入2 mL蒸餾水，攪拌15 min，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，取少許濾液稀釋，搖勻于365 nm波長(zhǎng)下測(cè)定值，代入“2.4”項(xiàng)中回歸方程算出客體藥物的含量，并計(jì)算出包合物FIT/HP-β-CD、FIT/ DM-β-CD及FIT/SBE-β-CD的包合物得率和包合率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.10 水溶性實(shí)驗(yàn)

在室溫pH 7.0的條件下，取過(guò)量的漆黃素、包合物FIT/HP-β-CD、FIT/DM-β-CD及FIT/SBE- β-CD，加入2 mL水，避光渦旋一段時(shí)間后用0.45 μm濾膜濾過(guò)除去未溶解物，減壓旋蒸，得到黃色固體物，計(jì)算出該包合物與原藥物漆黃素相比水溶性的增加量。

2.11 模擬生物體環(huán)境下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取漆黃素、FIT/HP-β-CD、FIT/DM-β-CD及FIT/ SBE-β-CD包合物于25 mL棕色量瓶中，分別用pH 1.5和pH 7.6的2種緩沖溶液溶解（溶劑為水-乙醇4∶1），靜置1 h至溶液平衡，固定波長(zhǎng)為363 nm，藥液作為對(duì)照，每隔（12±2）h對(duì)漆黃素的值進(jìn)行跟蹤測(cè)量。

3 結(jié)果與討論

3.1 Job’s曲線的測(cè)定

確定化學(xué)計(jì)量比可采用等摩爾連續(xù)遞變法，即Job法[20]。維持漆黃素和HP-β-CD的總濃度為0.08 mmol/L，在pH 3.0的緩沖溶液中分別配置一系列濃度的漆黃素和HP-β-CD混合液，然后在365 nm處測(cè)定值，使兩者的物質(zhì)的量之比（漆黃素的摩爾分?jǐn)?shù)）在0～1內(nèi)變化[21-22]。以值與漆黃素的摩爾分?jǐn)?shù)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖1，從曲線中可知最高點(diǎn)時(shí)相對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)為0.5。由此可確定主客體包合物FIT/HP-β-CD的包合化學(xué)計(jì)量比為1∶1。

3.2 紫外光譜滴定

為了研究主客體系的定量包合行為，在pH值分別為3.0、10.5[23-24]的條件下進(jìn)行紫外光譜滴定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，保持溶液的酸堿性和所測(cè)的客體漆黃素的濃度不變）。

圖1 漆黃素與FIT/HP-β-CD包合物在pH 3.0中的Job曲線

若漆黃素與β-CD的包結(jié)配位計(jì)量比為1∶1，則主體（β-CD）和客體（漆黃素）的配位包合可用公式（1）表示。