龔海蓉，陳婷玉

福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院 福建福州 350101

5-氟 尿 嘧 啶（5-fluorouracil ，5-FU）的 臨 床治療仍因其骨髓抑制和胃腸道毒性受限[1]。中醫(yī)學認為化療后胃腸黏膜損傷（Chemothrapy induced gastrointestinal Mucositis，CIGIM）基本病機為脾失健運，水濕蘊結(jié)，益氣健脾中醫(yī)藥可立足于病機緩解CIGIM[2]。但其具體的調(diào)控機制尚不完全明確。近年研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，以白細胞介素 1β（Interleukin 1β，IL-1β）為典型的血清促炎因子是胃腸黏膜炎癥反應的重要損傷因素；而IL-10則是炎癥反應鏈中拮抗IL-1β等的首要細胞因子。因此，本實驗使用益氣健脾化濕藥膳參芪薏苡仁粥干預CIGIM大鼠，通過觀察大鼠胃腸黏膜組織形態(tài)血清及IL-10、IL-1β蛋白表達水平，探討參芪薏苡仁粥對CIGIM大鼠的可能作用機制。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 36只SPF級Wistar雄性大鼠，體重250～300g，適應性喂養(yǎng)1周后進入實驗。

1.2 實驗藥品 黨參10g，黃芪20g，薏苡仁20g，大棗10g，生姜12g，購自國醫(yī)堂。

1.3 實驗 試 劑 5-FU 注 射 液、Rat IL-1β ELISA Kit、Rat IL-10 ELISA Kit購自聯(lián)科生物。

2 實驗方法

將36只大鼠隨機分成模型組、藥膳組和空白組，每組12只。模型組及藥膳組給予5-FU150mg/kg一次性腹腔注射，制作化療大鼠模型；空白組使用等量生理鹽水腹腔注射。實驗期間藥膳組大鼠行參芪薏苡仁粥10ml/kg/d灌胃，模型組及空白組行生理鹽水10ml/kg/d灌胃，1次/d，干預周期15d。

3 指標評價方法

實驗結(jié)束后留取胃、回腸組織，采用HE染色法制作大鼠胃、回腸組織切片。參考Masuda標準評分法[6]、Chiu腸黏膜損傷評級標準[7]對分別胃、腸黏膜損傷程度進行評價。留取大鼠血清標本，采用Elisa法檢測IL-10和IL-1β細胞因子水平。

4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0軟件進行方差分析、卡方檢驗或Nemenyi檢驗，檢驗水準α=0.05。

結(jié) 果

1 大鼠胃黏膜病理結(jié)構(gòu)改變

模型組、空白組及藥膳組大鼠胃黏膜病理損傷評分差異無統(tǒng)計學意義（X2=3.627，P=0.163），胃黏膜損傷積分模型組>藥膳組>空白組（見圖1）。顯微鏡下觀察3組胃黏膜絨毛形態(tài)（見圖3），3組間模型組缺損最嚴重；藥膳組和空白組比較，絨毛致密程度無明顯差別，但空白組黏膜邊緣較整齊。

圖1 大鼠胃黏膜Masuda評分比較

圖3 大鼠胃黏膜HE染色鏡下（200×）

2 大鼠回腸黏膜病理結(jié)構(gòu)改變

模型組、空白組及藥膳組大鼠回腸黏膜病理損傷評分差異無統(tǒng)計學意義（χ2=5.763，P=0.056）；空白組損傷積分低于模型組和藥膳組，藥膳組和模型組積分無差別（見圖2）?；啬c黏膜HE染色鏡下結(jié)構(gòu)對比結(jié)果顯示（見圖4）：模型組腸絨毛空泡明顯，絨毛腫脹甚至斷裂；與空白組比較，藥膳組腸絨毛頂端缺損，游離紅細胞數(shù)量較多。

圖2 大鼠腸黏膜Chiu評分比較

圖4 大鼠回腸黏膜HE染色鏡下（200×）

3 大鼠血清IL-10、IL-1β表達水平

摸索 IL-10、IL-1β 標準曲線圖，（見圖5、6），R2>0.99，可用于計算樣品濃度。Elisa實驗結(jié)果顯示，3組間IL-1β蛋白表達水平有明顯差異（P<0.01），模型組IL-1β蛋白濃度明顯高于藥膳組和空白組，藥膳組IL-1β蛋白水平與空白組比較無明顯差別（見圖7）；3組大鼠IL-10蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），藥膳組血清IL-10含量高于模型組和空白組，以模型組蛋白表達水平最低（見圖8）。

圖5 IL-10標準曲線

圖8 3組大鼠血清IL-10蛋白表達水平

討 論

5-FU引發(fā)胃腸黏膜損傷的本質(zhì)是化療藥阻滯胃腸黏膜上皮細胞DNA合成，使黏膜屏障功能受損，從而引發(fā)腸道炎癥反應，形成CIGIM。IL-1β作為促炎因子IL-1主要亞型，主要由巨噬細胞分泌；IL-10可由巨噬細胞、T淋巴細胞和自然殺傷細胞等多種免疫細胞產(chǎn)生，它可以抑制炎癥細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，與IL-1β互相拮抗。研究發(fā)現(xiàn)[8]，NLRP3/caspase-1、NF-kB、STAT3和MAPK等多條反應鏈參與IL-1β與IL-10調(diào)控。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶 1（caspase-1）作為上游活化蛋白，可將Pro-IL-1β結(jié)合體分解為有活性 IL-1β，IL-1β借助NLRP3炎癥小體介導腸道炎癥反應，形成NLRP3/IL-1β級聯(lián)反應鏈[9]。參芪薏苡仁粥君藥黃芪有效成分主要包括黃芪甲苷和黃芪多糖，黃芪甲苷可抑制NLRP3/IL-1β軸改善大鼠血管及平滑肌炎癥反應[10]。腸道炎癥反應過程中的脂多糖及其蛋白復合物可與巨噬細胞膜上的 CD14 特異性結(jié)合，通過 TLR/ NF-κB 路徑激活巨噬細胞，產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等早期炎癥因子[11]。隨著TNF-α水平升高，刺激NF-κB結(jié)合蛋白TLR表達，經(jīng) TLR/ NF－ κB 通路下游 MyD88信號的配體增加IL-6和IL-1β等細胞因子的表達[12]。文獻表明[13-14]，黃芪多糖及黃芪甲苷可顯著降低LPS 誘導的巨噬細胞反應程度，降低 TNF-α及IL-1β水平。黃芪甲苷可明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎腸道炎癥損傷，改善腸道菌群環(huán)境，其作用方式可能與調(diào)控TLR/NF-κB信號通路上的關鍵蛋白有關[15]。

圖6 IL-1β標準曲線

研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可增加調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量，增加 IL-10 的表達[16]。IL-10 / IL-10 受體相互作用涉及細胞內(nèi)信號傳導途徑激酶1（JAK1）、酪氨酸激酶2（Tyk2）和信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），JAK和Tyk2同屬JAK體系，與STAT家族各亞型一起參與機體炎癥反應，JAK/STAT3通路活化后誘導靶基因的表達，通過阻斷NF-κB核易位，抑制細胞因子IL-6和IL-1β的分泌以及細胞因子的表達[17]。而黃芪能有效抑制JAK1和Tyk2的活性[18-19]。巨噬細胞對M1（炎癥性）或M2（抗炎性）的極化受信號轉(zhuǎn)導通路網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)，AMPK是參與產(chǎn)生IL-10M2表型極化的信號分子之一。AMPKα是IL-10介導的PI3K / Akt和STAT3信號轉(zhuǎn)導必備介質(zhì)，MAPK相關蛋白水平降低可增加IL-10基因表達[20]。黃芪通過抑制 MAPK通路上游啟動蛋白ERK、p38的表達，降低通路活化程度，增加Il-10生成[21-23]。除黃芪，藥膳中的配伍用藥黨參、薏苡仁等可調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠IL-6與IL-10平衡，緩解腸道病理損傷[24-25]。

本研究結(jié)果顯示，3組大鼠胃黏膜、回腸黏膜損傷評價差異無統(tǒng)計學意義，可能與以下原因有關：5-FU 致胃腸黏膜損傷模型大鼠存在自我修復機制，在實驗周期設計上，應進一步參考大鼠的生理特點及CIGIM修復機制。同時，可增設偽無菌小鼠模型，避免腹腔注射等可能導致胃腸道損傷的干擾因素。本次研究在取材過程發(fā)現(xiàn)不同組別大鼠胃腸黏膜厚度、胃體大小存在差別，今后研究在評價指標中可增加胃黏膜厚度、毛細血管充血程度、黏膜大體形態(tài)觀察，進一步驗證實驗效果。文獻表明，5-FU對胃腸黏膜損傷具有劑量相關性，單次腹腔注射400 mg/kg或以50 mg/kg連續(xù)腹腔注射5d均可復制化療模型，造模劑量界定亦有可能是導致本次實驗結(jié)果的影響因素[26]。

綜上所述，參芪薏苡仁粥可能通過調(diào)控IL-1β與IL-10表達水平修復化療后胃腸黏膜損傷，但是介導IL-10和IL-1β的分子通路較多，后續(xù)研究可進一步探討不同通路具體的作用機制。