李玉珍，戚宇琪，郭曉霞

1 山西省中醫(yī)藥研究院 山西太原 030012

2 山西省中醫(yī)院 山西太原 030012

糖尿病已發(fā)展成為第三大慢性非傳染性疾病[1]，嚴(yán)重威脅著人類的健康。根據(jù)中國慢性病及其危險(xiǎn)因素監(jiān)測報(bào)告結(jié)果，專家推測我國已成為世界上糖尿病患者人數(shù)最多的國家[2]。姜良鐸教授是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院主任醫(yī)師、教授，從事中醫(yī)臨床及教學(xué)工作30余年，在治療糖尿病方面有著獨(dú)到見解。導(dǎo)師曾跟診于側(cè)，幸得姜老醫(yī)案，受益匪淺。本研究借助中醫(yī)傳承輔助平臺（ v2.5）[3]，運(yùn)用規(guī)則分析、復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類等數(shù)據(jù)挖掘方法，分析姜良鐸教授治療糖尿病的組方用藥特點(diǎn)，總結(jié)其用藥規(guī)律與診療經(jīng)驗(yàn)，得到治療糖尿病的新處方，并對核心用藥進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，探討其作用機(jī)制，從而為糖尿病的防治提供新的思路。

資料與方法

1 處方來源及篩選

收集2018年1月1日—2020年3月31日北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院姜良鐸教授門診的糖尿病患者初診處方158例。符合《中國糖尿病防治指南（2017年版）》[4]診斷標(biāo)準(zhǔn)，病歷資料完整可查。剔除合并其他系統(tǒng)性疾病者。

2 處方錄入與核對

參照《中國藥典》，將中藥名稱規(guī)范化統(tǒng)一。將上述篩選的處方錄入“中醫(yī)傳承輔助平臺”（V2.5）軟件。為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與結(jié)果的可靠性，在錄入完成后，由2人對數(shù)據(jù)進(jìn)行審核。

3 數(shù)據(jù)分析

通過中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)軟件中數(shù)據(jù)分析模塊中的“方劑分析”功能，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與用藥規(guī)律的挖掘。點(diǎn)擊“頻次統(tǒng)計(jì)”得出方劑中每味中藥所出現(xiàn)的頻次；“規(guī)則分析”分析所得的規(guī)則；選擇合適的相關(guān)度和懲罰度，進(jìn)行聚類分析，然后點(diǎn)擊提取組合按鈕，發(fā)現(xiàn)新組方，并實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化展示。

4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）檢索組方規(guī)律中的核心藥物，獲得藥物的主要成分及作用靶點(diǎn)，在Uniprot數(shù)據(jù)庫中將藥物作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為基因。將結(jié)果導(dǎo)入cytoscape（3.8.0）獲得藥物有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。在TTD數(shù)據(jù)庫中獲得2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)，并繪制靶點(diǎn)相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用cytoscape中的merge功能，取得兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖的交集，從而得到藥物治療糖尿病的潛在靶點(diǎn)，并對其進(jìn)行KEGG富集分析。最后利用R語言“ggplot2”包進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

結(jié) 果

1 藥物頻次及性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)

對錄入數(shù)據(jù)庫的158首處方中的藥物進(jìn)行“頻次統(tǒng)計(jì)”，可得到220味中藥頻次從高到低的排序。其中使用頻次≥50的藥物有17味，見表1。藥物歸經(jīng)分布以肝、胃、肺經(jīng)居多，見表2。性味歸屬中以寒性為主、溫性次之；五味分析中，苦味使用最多、甘味次之，見表3。

表1 藥物頻次≥50次的中藥

表2 歸經(jīng)使用頻次統(tǒng)計(jì)

表3 使用中藥在四氣五味中所占比重

2 用藥模式與規(guī)則分析

支持度是指所選組合在整體數(shù)據(jù)樣本中出現(xiàn)的次數(shù)，當(dāng)設(shè)定不同支持度時(shí)，所涉及的方劑數(shù)據(jù)條數(shù)和所包含中藥的味數(shù)是不同的。本研究將支持度個(gè)數(shù)設(shè)置為47（相當(dāng)于整體數(shù)據(jù)的30%），置信度設(shè)置為0.8，共得到71種藥物組合模式，所有模式中共包含中藥11味，即赤芍、白芍、枳殼、黃芩、柴胡、瓜蔞、地骨皮、知母、全蝎、熟大黃。這11味藥物組合可以看作是治療糖尿病最常用、最核心的藥物組合，也組成了姜良鐸教授常用的用藥模式，包括角藥和對藥，其中藥對組合35條，角藥組合26條，4味藥及以上的核心組合10條，見表4-6。核心藥物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)展示見圖1。

表4 治療糖尿病的2味藥核心組合模式

圖1 藥物之間的關(guān)聯(lián)性網(wǎng)絡(luò)化展示

3 基于無監(jiān)督的熵層次聚類新處方分析

本研究選擇相關(guān)度為8，懲罰度為2，進(jìn)行聚類分析。點(diǎn)擊"提取組合"按鈕，通過無監(jiān)督的熵層次聚類算法提取相關(guān)組合，進(jìn)一步聚類得到治療糖尿病的核心組合18個(gè)、新處方9個(gè)，見表7-8。

表7 用于新方聚類的核心組合

4 分析核心藥對“赤芍-白芍”治療糖尿病的作用機(jī)制

4.1 “赤芍-白芍”有效成分及作用靶點(diǎn) 經(jīng)總結(jié)用藥配伍規(guī)律發(fā)現(xiàn)，姜教授在治療糖尿病時(shí)，“赤芍-白芍”配伍使用頻率最多。因此，本研究對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，從微觀角度研究“赤芍-白芍”治療糖尿病的作用機(jī)制。將得到的活性成分及靶點(diǎn)基因?qū)隿ytoscape軟件，構(gòu)成“赤芍-白芍”活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表5 治療糖尿病的3味藥核心組合模式

表6 治療糖尿病的 4 味藥及以上核心組合模式

表8 治療糖尿病的新方組合

4.2 糖尿病相關(guān)靶點(diǎn) 在TTD數(shù)據(jù)庫中檢索“type 2 diabetes”，獲得糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)，將結(jié)果導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，繪制靶點(diǎn)相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖3 抗2型糖尿病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

4.3 “赤芍-白芍”治療糖尿病靶點(diǎn)篩選 利用cytoscape的merge功能，將藥物作用靶點(diǎn)和2型糖尿病靶基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，取得交集，得到“赤芍-白芍”作用于2型糖尿病的有效成分及靶基因網(wǎng)絡(luò)圖，主要靶基因有 PTGS2、NR3C2、PIK3CG、HTR2A 等，見圖4。

圖4 抗2型糖尿病作用活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

4.4 靶點(diǎn)基因功能富集分析 將上述獲得的共同靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG功能富集分析，上述基因主要富集的通路包括2型糖尿病、胰島素抵抗、胰島素信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路等，見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析

討 論

糖尿病屬于祖國醫(yī)學(xué)中“消癉”“消渴”范疇，病機(jī)演變可分為郁、熱、虛、損四個(gè)階段[5]。歷代醫(yī)家在治療糖尿病時(shí)，大多以益氣、養(yǎng)陰、溫陽等補(bǔ)虛治本為主，以清熱、化痰、祛瘀為標(biāo)為輔[6，7]。姜良鐸教授認(rèn)為疾病的證候可以相對穩(wěn)定，狀態(tài)會因不同的內(nèi)部、外部條件而變化，根據(jù)患者狀態(tài)以及肺、胃（脾）、腎病位的不同及其合并癥的情況，運(yùn)用活血、祛瘀、化痰等方法，使邪去正自復(fù)。在此基礎(chǔ)上，姜良鐸教授提出毒邪致病理論[10]，他認(rèn)為糖尿病患者血糖過高，超出其生理需要量，就轉(zhuǎn)化為毒，屬內(nèi)生之毒，在治療過程中應(yīng)注重排毒和解毒。

本研究借助中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)軟件，應(yīng)用關(guān)聯(lián)規(guī)則和聚類算法分析姜良鐸教授治療糖尿病的用藥經(jīng)驗(yàn)。經(jīng)過關(guān)聯(lián)算法分析，提煉出姜良鐸教授治療糖尿病常用的藥物有赤芍、白芍、枳殼、黃芩、柴胡、瓜蔞、地骨皮、知母、全蝎、熟大黃等，這些藥物多歸肝、肺經(jīng)，從藥物性味來看，寒性居多，溫性次之，藥味多為苦甘，多具有柔肝、潤燥等作用。姜教授在糖尿病治療中常采用對藥或角藥，且用藥平和、通補(bǔ)結(jié)合。對藥即針對某一證型或癥狀，常成對使用的藥物。如處方中赤芍-白芍、枳殼-枳實(shí)、柴胡-黃芩、知母-貝母等。角藥就是以3味藥物為組合單位的一種藥物配伍方法，由于疾病狀態(tài)病因病機(jī)的復(fù)雜性，姜教授基于《內(nèi)經(jīng)》“一君二臣，奇之制也”的基礎(chǔ)理論上提出了角藥理論[8]。如柴胡、黃芩、枳實(shí)三者聯(lián)用可解表、清里、通下，并有疏利肝膽之功。瓜蔞、枳實(shí)、芍藥三者同用有調(diào)和氣血、疏利三焦氣機(jī)的作用，若再配上柴胡、黃芩可以廣泛地應(yīng)用于氣血失和、水液代謝失調(diào)證屬三焦不暢者。

由于處方規(guī)律和用藥頻次分析中，以“赤芍-白芍”使用頻率最多。因此，本研究基于TCMSP、TTD、STRING、KEGG等數(shù)據(jù)庫分析“赤芍-白芍”治療糖尿病的作用機(jī)制。得到的靶點(diǎn)基因分別為PTGS2、NR3C2、PIK3CG、HTR2A、INSR、F2、SLC2A4、MAPK8、PTPN1。胰島素受體（INSR）轉(zhuǎn)運(yùn)的改變可能導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素抵抗[9]。同樣，在2型糖尿病中，PIK3CG活性降低會損害胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并損害葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4的轉(zhuǎn)位，從而導(dǎo)致胰島素抵抗[10]。而NR3C2的上調(diào)則可促進(jìn)胰島素分泌[11]。KEGG富集分析主要與胰島素抵抗、胰島素信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路等有關(guān)。IL-17信號通路是2型糖尿病炎癥發(fā)生的信號傳導(dǎo)途徑，在宿主防御和炎癥性疾病中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[12]。在T2MD中，IL-17可通過誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞凋亡來加重胰島素抵抗[13]。據(jù)此可推測“赤芍-白芍”藥對具有改善胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和降低炎癥的作用，從而參與糖尿病及其并發(fā)癥的治療。

本研究通過無監(jiān)督的熵層次聚類，得出姜良鐸教授治療糖尿病的9首新處方。方1、2中羚羊角粉苦寒，清瀉上逆之肝火，天麻富含汁液，可養(yǎng)陰滋液而息內(nèi)風(fēng)，葛根清熱生津，適用于糖尿病合并高血壓者；方3、4紫菀潤肺下氣，杏仁具疏利開通之性，與肺之肅降功能相合，通調(diào)三焦，開上導(dǎo)下，可宣化濕濁，浙貝母清熱化痰，治療糖尿病兼有痰濁者；方5、6、7寓清熱、行氣、活血于一方，適用于糖尿病早期消渴癥狀明顯者；方7中兼有合歡皮、珍珠粉等寧心安神之藥，可用于糖尿病兼有失眠者。方8山藥、麥芽、豬苓健脾利水，佐以紫河車為動物胚芽，虛勞要藥，生麥芽為植物胚芽，具升發(fā)之氣，合用以補(bǔ)虛損之體，振頹敗之元?dú)猓瑪♂u草清熱解毒，祛瘀排膿，為藥食兩用之品，雖有寒涼之性而無苦寒?dāng)∥钢?，對于熱毒熾盛，耗氣傷陰之證，實(shí)有益氣養(yǎng)陰之效，全方適用于糖尿病終末期陰陽兩虛者，仍兼顧解毒祛瘀；方9柴胡、桂枝、黃芩、枳實(shí)，枳殼疏利三焦氣機(jī)，清解少陽膽經(jīng)郁熱，佐以麥冬、五味子養(yǎng)陰生津，避免清熱太過而傷陰適用于糖尿病肝郁化火傷津者。以上處方充分體現(xiàn)了姜教授獨(dú)特學(xué)術(shù)理論體系，包括“外感病的內(nèi)傷基礎(chǔ)”和“狀態(tài)醫(yī)學(xué)理論”[14]。即發(fā)病呈現(xiàn)內(nèi)傷外感并存的局面，則應(yīng)依據(jù)“急則治其標(biāo)，緩則治其本”的原則處理，亦可內(nèi)外同治。

綜上所述，本研究通過“中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)”挖掘出姜良鐸教授治療糖尿病的臨床方劑用藥規(guī)律，探討了其核心藥對治療糖尿病的潛在作用機(jī)制，并得到治療糖尿病的新處方9首，對臨床治療糖尿病用藥具有一定的指導(dǎo)作用。