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        基于非標記核酸適配體熒光法檢測灌溉水中汞離子的研究

        2021-08-24 13:32:04陳佳祎陸安祥欒云霞盧靜華
        分析測試學報 2021年8期
        關鍵詞:雙鏈特異性熒光

        王 楠,陳佳祎,陸安祥,欒云霞,盧靜華

        (1.錦州醫(yī)科大學 藥學院,遼寧 錦州121001;2.北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究中心,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(北京),農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點實驗室,北京100097)

        隨著新型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展,農(nóng)田生態(tài)環(huán)境和保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)升級中的地位愈加重要,也對有毒危害因子的檢測提出了更高的要求。高靈敏度、高通量且操作簡單、成本低廉的快速檢測方法更符合基層快速篩查的需求。重金屬對農(nóng)田環(huán)境的污染可通過農(nóng)產(chǎn)品對人類健康造成嚴重危害,尤以汞、鎘、鉛、鉻等毒性為最大[1]。這些重金屬及其化合物多數(shù)有致畸、致癌作用,并且均為蓄積性毒物,具有生物不可降解性,歸宿于水體、底泥、生物群或大氣。在有毒金屬元素中,汞的毒性排在首位,即使在濃度很低的情況下,也會對人類和動植物產(chǎn)生相當大的毒害作用。對農(nóng)田土壤、空氣、水體等環(huán)境介質(zhì)以及農(nóng)產(chǎn)品中的汞進行日常監(jiān)測已成為各國的常規(guī)項目,因此,研究快速、低成本、靈敏度高且特異性好的汞離子檢測方法顯得極為重要[2-3]。汞的檢測常采用原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、色譜法等,但傳統(tǒng)方法所需儀器價格昂貴,對操作人員、實驗環(huán)境、前處理均有較高的要求,不適合在基層現(xiàn)場實時在線檢測?;诿庖邔W原理的快速檢測方法是目前現(xiàn)場檢測的主流,但因抗體制備過程及其自身的特點,該法對于毒性強、免疫原性差、免疫位點不明的小分子污染物,存在雜交瘤細胞篩選難度大、抗體親和力低、假陽性高等問題。近年來基于功能核酸對汞的檢測有了新的突破,并在此基礎上發(fā)展了比色法、電化學、共振瑞利散射、電致發(fā)光等快速檢測技術,成為汞環(huán)境分析中的研究熱點[4-8]。核酸適配體(Aptamer)是一段能夠與靶分子高親和力、高特異性結合的單鏈寡核苷酸,具有檢測靈敏度高、成本低、易合成修飾等優(yōu)點,在基礎研究、分子診斷以及農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)田環(huán)境污染物監(jiān)測等諸多領域中均展示出廣闊的應用前景,為農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)田環(huán)境中化學殘留物、生物毒素、重金屬等小分子污染物的檢測提供了一種新型、高效、快速的檢測元件,具有很大的應用潛力[9-15]。已有研究表明,Hg2+可被適配體DNA鏈中的胸腺嘧啶(T-T)選擇性捕獲,錯配形成T-Hg2+-T發(fā)夾結構,且親和力強于適配體DNA與其互補鏈的結合力[16]。基于此原理,一些熒光和電化學適配體傳感器已經(jīng)被成功開發(fā)用于Hg2+檢測[4-7]。隨著材料與光學技術的發(fā)展,熒光法檢測發(fā)展迅速,快速中小型熒光分光光度計是目前最常用的一種高靈敏度檢測儀器,非常適合現(xiàn)場實時快速監(jiān)測。熒光法具有靈敏度高、結果準確度高、適合實時監(jiān)測等特點,且適配體易被熒光染料修飾,是目前普遍采用的光學檢測方法。但目前采用的將熒光染料標記到核酸適配體上的方法,可能影響DNA的高級結構構象及其與目標物的結合。因此,利用非標記適配體的熒光檢測技術具有更好的發(fā)展?jié)摿?,在環(huán)境分析、農(nóng)產(chǎn)品安全、體外診斷等痕量分析領域具有更大的應用空間。本研究擬以非標記的汞特異性核酸適配體為識別元件,結合高效的熒光染料檢測溶液體系中不同濃度的汞離子,通過探索熒光信號的變化規(guī)律及各組分的配比,確定最佳的檢測體系。同時對方法的精密度、準確性和特異性進行研究,并應用于灌溉水樣品的檢測,以期為在線實時監(jiān)測灌溉水中汞的污染水平提供技術支持。

        1 實驗部分

        1.1 儀器與設備

        LS-55熒光光譜儀,美國PE公司產(chǎn)品;臺式高速冷凍離心機器,Sigma公司產(chǎn)品;Millipore純水機,美國Bedford公司產(chǎn)品。

        1.2 試劑

        重金屬汞的適配體寡聚核苷酸序列和互補序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成,HPLC純 化。Hg2+適 配 體 序 列:5'-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3',互 補 序 列:5'-AACAAACAAG GGGAAGAAAGAA-3',用 含1 mmol/L MgCl2(pH 8.5)的10 mmol/L的PBS(pH 7.4)溶 液 進 行 稀釋,-20℃保存。腺苷的特異性適配體序列:5'-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTA-3',其互補序列:5'-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3'。汞標準溶液以及用于特異性檢測的砷、鉛、鎘、鉻和鉀元素標準溶液購自鋼研納克標準物質(zhì)中心,PicoGreen熒光染料、Tris-HCl購自Sigma公司,其它試劑均購于上?;瘜W試劑公司。實驗所用試劑均為分析純。

        1.3 檢測原理

        基于適配體DNA對汞離子的特異性結合,并利用熒光染料PicoGreen對雙鏈DNA pg級的靈敏度和嵌入雙鏈后引發(fā)熒光強度急劇增加(1 000倍)的特性進行高靈敏度特異性檢測。如圖1所示,當溶液中存在汞離子時,適配體的構象發(fā)生變化,單鏈DNA“stem-loop”區(qū)域形成特定的立體結構,高特異性、高親和力地與汞離子結合。隨后,加入適配體DNA互補鏈cDNA和PicoGreen,互補鏈將與溶液中未結合目標物的游離適配體結合,形成雙鏈DNA。由于PicoGreen不結合單鏈核苷酸,僅識別并結合雙鏈DNA的螺旋溝,并發(fā)射出熒光信號[17],因此,可通過對熒光強度的分析來測定目標物汞的濃度,且汞離子的濃度與熒光強度成反比。

        圖1 基于PicoGreen/適配體檢測汞離子的原理Fig.1 Schematic of the PicoGreen/aptamer-based method for detection of Hg2+

        1.4 熒光檢測

        取50 μL濃度為1 μmol/L的Hg2+適配體DNA,加入100 μL不同質(zhì)量濃度(0、0.002、0.02、0.2、2、20、200 μg/mL)的Hg2+,混勻孵化20 min后,加入50 μL濃度為1 μmol/L的適配體DNA互補鏈,此時Hg2+的最終質(zhì)量濃度分別為0、0.001、0.010、0.100、1、10、100 μg/mL,再加入PicoGreen。連續(xù)測定λex/λem=480 nm/530 nm處的熒光強度值IF(不含Hg2+的空白對照溶液熒光值為IF0),每分鐘檢測1次,持續(xù)檢測25 min。

        1.5 特異性檢測

        按照“1.4”檢測體系和孵育時間,以As3+、Pb2+、Cd2+、Cr2+、K+作為干擾物,在相同條件下檢測適配體對Hg2+和其他金屬離子的選擇特異性和靈敏度,金屬離子質(zhì)量濃度梯度為0、0.002、0.02、0.2、2、20、200 μg/mL。以無目標物和干擾物,只有適配體DNA的溶液為空白對照,通過熒光強度變化分析Hg2+適配體與其他干擾離子的結合情況,判斷方法的特異性。

        2 結果與討論

        2.1 反應條件的確定

        為了獲得更好的熒光信號,需對PicoGreen和適配體DNA(1 μmol/L)相互作用的時間進行優(yōu)化。如圖2所示,低質(zhì)量濃度的Hg2+(0.002 μg/mL)在反應5 min時的熒光強度達到最大,之后隨著PicoGreen的熒光衰退,熒光強度逐漸降低;更高質(zhì)量濃度的Hg2+(200 μg/mL)在反應進行5 min后,熒光強度基本保持穩(wěn)定。這說明前5 min適配體/Hg2+復合物與適配體/互補鏈DNA雙鏈之間存在競爭,Hg2+濃度越高越具競爭優(yōu)勢,且適配體/Hg2+復合物的結合親和力強于適配體/互補鏈DNA雙鏈。因此,本實驗選擇5 min作為適宜的反應時間。

        圖2 不同汞離子濃度下熒光強度隨時間的變化情況Fig.2 Changes of fluorescence intensity with time under different mercury ion concentrations

        2.2 方法檢出限

        隨汞離子濃度的升高,530 nm處的吸收峰強度逐漸降低,汞離子濃度的對數(shù)(lgcHg,x)和熒光比值IF/IF0(y)之間呈良好的線性關系:y=1.157 2-0.162 6x,r2=0.988。根據(jù)標準偏差斜率法[18],獲得本方法的檢出限為0.38 ng/mL,線性范圍為0.001~100 μg/mL,滿足世界衛(wèi)生組織對飲用水中汞離子的限量標準(1 ng/mL)要求[19]。

        2.3 特異性分析

        為了驗證本方法對汞離子檢測的特異性,以同濃度的As3+、Pb2+、Cd2+、Cr2+、K+為干擾物,在相同條件下檢測適配體對Hg2+和其他金屬離子的選擇特異性,結果如圖3所示。結果表明,加入0.02~200 μg/mL的Hg2+作為目標物時,檢測體系的熒光變化率顯著高于其他金屬離子,而以As3+、Pb2+、Cd2+、Cr2+、K+離子作為目標物的溶液熒光強度變化很小。

        圖3 不同金屬離子的相對熒光強度變化Fig.3 Changes in the relative fluorescence intensity with various metalions

        另外,為了證明Hg2+適配體的特異性和其他寡核苷酸對檢測體系的影響,選用與汞離子適配體相似,同樣具有發(fā)夾結構的腺苷適配體及其互補鏈作為識別元件,對不同質(zhì)量濃度(0、0.002、0.02、0.2、2、20、200 μg/mL)汞離子進行檢測。發(fā)現(xiàn)汞離子的加入并未顯著降低溶液的熒光值,進一步證明了本方法的特異性(圖4)。上述結果表明本方法使用的適配體序列具有較好的選擇性,基于此建立的Hg2+的檢測方法具有較好的特異性。

        圖4 利用腺苷適配體對Hg2+進行檢測的熒光結果Fig.4 Fluorescence detection results of Hg2+by aptamer of adenosine

        2.4 灌溉水樣品檢測

        以北京市郊區(qū)農(nóng)業(yè)灌溉水作為水樣,經(jīng)原子熒光法未檢出總汞。將Hg2+標準溶液加入到該水樣中,獲得不同Hg2+質(zhì)量濃度(50、100、500 ng/mL)的灌溉水樣,按照本方法所建體系進行測定,獲得加標灌溉水樣中Hg2+回收結果(表1),其回收率為95.2%~97.9%,相對標準偏差為2.3%~4.0%。雖然灌溉水基質(zhì)中存在不同類型的干擾物,但采用本體系檢測Hg2+的加標回收結果良好。結果表明,本方法適用于農(nóng)田灌溉水中汞的檢測,在水質(zhì)的實時在線檢測方面具有良好的應用前景。

        表1 灌溉水樣中添加Hg2+回收結果(n=3)Table 1 Recovery results of adding Hg2+in irrigation water samples(n=3)

        2.5 方法對比

        本研究建立的基于汞特異性適配體熒光法檢測Hg2+的方法無需對DNA分子和熒光染料進行設計和修飾,可將合成好的單鏈寡聚核苷酸直接與熒光染料以及適配體互補鏈混合形成檢測體系,對溶液中的Hg2+進行監(jiān)測。與ICP-MS和原子熒光等方法相比,該方法線性范圍寬,不使用強酸、強堿、強氧化劑和還原劑,具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、用時短(可在5 min內(nèi)完成)的優(yōu)勢(表2),在現(xiàn)場實時監(jiān)測方面有良好的應用前景。

        表2 與已報道方法的比較Table 2 Comparison between this method and the reported methods

        3 結論

        本研究建立了一種基于汞特異性核酸適配體檢測農(nóng)田灌溉水中汞離子的實時在線監(jiān)測方法,應用核酸染料PicoGreen可以嵌入雙鏈DNA的特性,未對適配體進行任何修飾,保證了適配體的空間構象及其與目標物結合的特異性,通過檢測溶液的熒光強度即可監(jiān)測汞離子濃度。該方法線性范圍為0.001~100 μg/mL,檢出限達到0.38 ng/mL,對汞離子具有很好的特異性,在實際樣品檢測中表現(xiàn)出較好的線性和基質(zhì)適應性,具有簡單、快速、靈敏的特點,在現(xiàn)場快速檢測和高通量實時監(jiān)測中具有很好的應用前景。

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