李 妍 彭心怡 孔燕妮 郭 勇

近年來，實(shí)體腫瘤治療領(lǐng)域有57 種免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)入了17 種腫瘤治療的審批流程，其中有7種分別針對程序性死亡受體1（Programmed Death 1/Ligand 1，PD1/PDL1）的單克隆抗體藥物被美國FDA批準(zhǔn)[1-2]。臨床研究注冊數(shù)據(jù)（Clinicaltrials.gov）顯示，在過去2 年里，進(jìn)入臨床試驗的免疫檢查點(diǎn)治療項目數(shù)逐年增加，但速率正在減緩[3]，年齡、既往接受化療的線數(shù)、體力、腫瘤分期、病理分級均可能影響免疫治療療效[4-5]。目前臨床試驗的亞組數(shù)據(jù)或免疫治療相關(guān)數(shù)據(jù)不夠充分，尚缺乏真實(shí)世界樣本進(jìn)一步證實(shí)臨床病理特征聯(lián)合臨床參數(shù)在常見實(shí)體腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效預(yù)測中的作用。本研究將基于單中心真實(shí)世界臨床患者應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑過程中的臨床參數(shù)、免疫代謝相關(guān)指標(biāo)以及中醫(yī)證型的參數(shù)做進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建COX 比例風(fēng)險回歸模型及列線（Nomogram）圖，預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效構(gòu)建結(jié)合中醫(yī)證型參數(shù)的個體化模型。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2019 年2 月—2021 年2 月于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的常見實(shí)體惡性腫瘤患者53 例。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷明確為惡性腫瘤，中醫(yī)辨證分型參照《GB/T 16751.2-1997 中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分國家標(biāo)準(zhǔn)（GB）[6]》《中醫(yī)診斷學(xué)》[7]；（2）美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC 第7 版分期制定的TNM分期[8]）為Ⅳ期的患者；（3）在入組時間內(nèi)初次接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑單用或聯(lián)合治療；（4）有完整的代謝、免疫、中醫(yī)證型隨訪數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）隨訪數(shù)據(jù)不完整；（2）30 天內(nèi)接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療；（3）有其他重要臟器器質(zhì)性病變，如心、肺、腎損害。

1.3 方 法 提取每例患者的年齡、性別、T 分期、N分期和M 分期[8]、客觀緩解時間、既往接受治療情況、聯(lián)合治療情況、免疫檢查點(diǎn)抑制劑用藥、瘤種、中醫(yī)證型、外周血免疫相關(guān)指標(biāo)（調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞Treg、CD3+CD4+、CD3+CD8+、自然殺傷細(xì)胞NK cells）、前白蛋白（prealbumin，PAB）、淀粉樣蛋白a（serum amyloid A protein，SAA）、乳酸脫氫酶、鐵蛋白、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR）、血小板與淋巴細(xì)胞比率（platelet/lymphocyte ratio，PLR）等臨床及實(shí)驗室指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)因素分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件及R 語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Kaplan-Meier 曲線分析計算風(fēng)險評分對腫瘤患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用客觀化解時間獲益的單變量因素，并使用Log-rank 檢驗對Kaplan-Meier 曲線進(jìn)行評估，檢驗水準(zhǔn)α=0.05（雙尾）。使用COX 風(fēng)險比例模型分析多變量因素，并協(xié)助構(gòu)建Nomogram 圖[9]。使用R 語言3.2.4 構(gòu)建Nomogram 圖并計算C 指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在初次免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用期間出現(xiàn)進(jìn)展的21 例患者中：男16 例（76%），女5 例（24%）；年齡：≤50 歲1 例（4.8%），50～70 歲10 例（47.6%），≥70 歲10 例（47.6%）；疾病緩解時間：≤90天8 例（38.1%），90～200 天10 例（47.6%），≥200 天3 例（14.4%）；聯(lián)合治療情況：單用免疫治療2 例（9.6%），聯(lián)合化療12 例（57.1%），聯(lián)合靶向治療7 例（33.3%），聯(lián)合化療及靶向治療0 例；治療線數(shù)：一線應(yīng)用免疫藥物6 例（28.6%），二線應(yīng)用6 例（28.6%），三線應(yīng)用1 例（4.8%），三線及以上應(yīng)用8 例（38.1%）；治療期間中醫(yī)證型主要為陰虛證6 例（28.6%），脾虛證13 例（61.9%），血瘀證2 例（9.5%）；瘤種分布情況：肺癌8 例（38.1%），腸癌3 例（14.3%），胰腺癌3 例（14.3%），消化系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌癌1 例（4.8%），肝癌1 例（4.8%），胃癌5 例（23.8%）。

在初次免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用期間未出現(xiàn)進(jìn)展的32 例患者中：男20 例（62.5%），女12 例（37.5%）；年齡：＜50 歲4 例（12.5%），50～70 歲21 例（65.6%），≥70 歲7 例（21.9%）；疾病緩解時間：＜90 天15 例（46.9%），90～200 天9 例（28.1%），≥200 天8 例（25.0%）；聯(lián)合治療情況：單用免疫治療6 例（18.8%），聯(lián)合化療9 例（28.1%），聯(lián)合靶向治療13例（40.6%），聯(lián)合化療及靶向治療4 例（12.5%）；治療線數(shù)：一線應(yīng)用免疫藥物9 例（28.1%），二線應(yīng)用3例（9.4%），三線應(yīng)用9 例（28.1%），三線以上應(yīng)用11例（34.4%）；治療期間中醫(yī)證型主要為陰虛證11 例（34.4%），脾虛證19 例（59.4%），血瘀證2 例（6.2%）；瘤種分布情況：肺癌11 例（34.3%），腸癌5 例（15.6%），胰腺癌4 例（12.5%），消化系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌癌2 例（6.3%），肝癌1 例（3.1%），胃癌6 例（18.8%），其他瘤種3 例（9.4%）。

2.2 免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用過程中臨床參數(shù)的單因素分析 53 例腫瘤患者中，對所有14 項臨床參數(shù)進(jìn)行單因素COX 回歸分析，發(fā)現(xiàn)PAB（P=0.003），SAA（P=0.046）與惡性腫瘤患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑客觀緩解時間相關(guān)。見表1。

表1 53 例腫瘤患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用臨床參數(shù)的單因素分析

2.3 多因素分析以評估免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用中客觀緩解出現(xiàn)進(jìn)展的獨(dú)立危險因素 根據(jù)單因素COX回歸分析結(jié)果，取P 值＜0.1 的PAB、SAA 進(jìn)一步行多因素回歸構(gòu)建生存風(fēng)險模型（R 語言rms 程序包），并得到生存風(fēng)險回歸模型（風(fēng)險評分RISK-Score=PAB×0.01498-SAA×0.00318），計算所有患者客觀緩解時間獲益風(fēng)險評分見表2。

表2 多因素分析評估客觀緩解出現(xiàn)進(jìn)展的獨(dú)立危險因素

表2 多因素分析評估客觀緩解出現(xiàn)進(jìn)展的獨(dú)立危險因素（續(xù)）

2.4 基于COX 多因素回歸分析的Kaplan-Meier 生存分析 使用R 語言survival 及survminer 程序包對COX 多因素回歸分析得到的RISK 風(fēng)險分值進(jìn)行Kaplan-Meier 生存預(yù)測，根據(jù)風(fēng)險評分預(yù)測公式計算每個患者的風(fēng)險評分，然后以中位數(shù)為cut-off 值，將所有患者分為高低危組（見圖1），在53 例惡性腫瘤應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑患者中，高危組患者預(yù)后顯著差于低危組，log-rank.P=0.001153。

圖1 對風(fēng)險評分RISKSCORE 進(jìn)行高低危分組后的Kaplan-Meier 生存曲線

2.5 Nomogram 圖的構(gòu)建 基于COX 分析得到的與免疫檢查點(diǎn)抑制劑用藥客觀緩解時間有獲益相關(guān)的P＜0.05 的獨(dú)立風(fēng)險因素：年齡、T 分期、N 分期、治療線數(shù)、聯(lián)合治療情況、中醫(yī)證型、風(fēng)險評分納入進(jìn)一步的模型構(gòu)建，構(gòu)建Nomogram 圖，由于本研究入組的均為Ⅳ患者，故僅將年齡、聯(lián)合治療情況、中醫(yī)證型、風(fēng)險評分等因素列入COX 回歸分析并構(gòu)建Nomogram 圖從而預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑客觀緩解時間（見圖2），采用Bootstrap 法對Nomogram 圖進(jìn)行內(nèi)部驗證，自抽樣次數(shù)B=1000，驗證結(jié)果顯示，C 指數(shù)為0.7309（95%CI 為0.6391～0.8228），有良好的預(yù)測價值。

圖2 結(jié)合中醫(yī)證型的Nomogram 模型對腫瘤患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑客觀緩解時間6 個月～1 年的預(yù)測

3 討論

由于腫瘤內(nèi)在機(jī)制的異質(zhì)性及患者宿主個體差異，很多患者對免疫檢查點(diǎn)治療的響應(yīng)性并不如預(yù)期高，腫瘤本身、腫瘤微環(huán)境以及宿主因素的復(fù)雜性均可能影響免疫治療應(yīng)答[10-13]。臨床研究設(shè)計可能也只能納入有限且檢測標(biāo)準(zhǔn)不一致的分子標(biāo)志物，如腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）、PD1/PDL1 表達(dá)、錯配修復(fù)缺陷（different mismatch repair，dMMR）狀態(tài)等[14]。因而，采用明確的分子標(biāo)志物聯(lián)合臨床參數(shù)協(xié)助預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效將有一定臨床意義。國內(nèi)腫瘤治療的中醫(yī)藥參與度極高，有研究證實(shí)中醫(yī)藥對腫瘤的獲益體現(xiàn)在不同方面，如保護(hù)放化療后正常組織和細(xì)胞損傷、增強(qiáng)化放療效力、減輕瘤周組織炎癥狀態(tài)、提高患者體力狀態(tài)、改善患者生活質(zhì)量及延長晚期患者生存時間[15]。結(jié)合中醫(yī)證候及代謝營養(yǎng)免疫狀態(tài)等臨床參數(shù)所建立的預(yù)測模型，有望成為潛在的免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效預(yù)測的個體化工具。

臨床通常根據(jù)患者現(xiàn)有的分子表達(dá)如PD1/PDL1、TMB、dMMR 狀態(tài)來判斷免疫檢查點(diǎn)抑制劑的可能獲益，而在宿主因素及腫瘤微環(huán)境因素上常常依據(jù)疾病分期及常規(guī)實(shí)驗室檢查作出經(jīng)驗性判斷，尚未見可靠的評分系統(tǒng)來預(yù)測療效。本研究針對真實(shí)世界中正在接受免疫檢查點(diǎn)抑制治療的常見惡性實(shí)體腫瘤患者，所有的臨床數(shù)據(jù)都是前瞻性收集并儲存于本中心臨床資料數(shù)據(jù)庫，包括結(jié)合中醫(yī)證型的臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)，常規(guī)檢查中易獲取的隨訪期間外周血代謝、營養(yǎng)及免疫參數(shù)以及客觀緩解時間的結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)，通過R 語言進(jìn)行COX 生存單因素及多因素分析可能影響免疫檢查點(diǎn)抑制劑客觀緩解時間的臨床參數(shù)特征，進(jìn)一步構(gòu)建有中醫(yī)特征及臨床可及參數(shù)的個體化Nomogram 預(yù)測模型。我們對14 項臨床參數(shù)進(jìn)行單因素COX 回歸分析發(fā)現(xiàn)PAB（P=0.003）與SAA（P=0.046）與客觀緩解時間獲益有關(guān)；進(jìn)一步行多因素COX 回歸分析結(jié)果表明，年齡（P＜0.01），T 分期（P＜0.01），N 分期（P＜0.01），治療線數(shù)（P＜0.01），聯(lián)合治療情況（P＜0.01），中醫(yī)證型（P＜0.01），不同免疫檢查點(diǎn)抑制劑（P＜0.01）及瘤種（P＜0.01）是患者獲得客觀緩解時間獲益的獨(dú)立預(yù)后影響因素。采用相關(guān)因素構(gòu)建Nomogram 圖提示脾虛證的風(fēng)險評分較陰虛證低，血瘀證的風(fēng)險評分最高，聯(lián)合治療的風(fēng)險評分也低于單藥，內(nèi)部驗證的C 指數(shù)為0.7309（95%CI 為0.6391～0.8228），表現(xiàn)出良好的預(yù)測價值。

既往研究顯示，對免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療有反應(yīng)患者的基線中位單核細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞計數(shù)均低于無反應(yīng)患者（P＜0.05），提示外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計數(shù)對晚期非小細(xì)胞肺癌患者免疫治療反應(yīng)具有一定預(yù)測價值[16]。相較于以往的研究，未研究通過外周血的髓系細(xì)胞數(shù)、代謝狀態(tài)、免疫細(xì)胞數(shù)、營養(yǎng)狀態(tài)來評估免疫檢查點(diǎn)抑制劑的預(yù)測價值，且結(jié)合中醫(yī)證型的特征納入Nomogram 建模有一定創(chuàng)新。由于本次研究的病例數(shù)來自單中心，數(shù)量較少，因而僅僅探索性運(yùn)用回歸模型及Nomogram 圖進(jìn)行數(shù)據(jù)療效預(yù)測，在今后的工作中可以繼續(xù)積累數(shù)據(jù)，完善模型評估及內(nèi)外部驗證，為免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用提供可靠的預(yù)測工作。