李 紅 邵靜波 朱嘉蒔 張 娜 陳 凱 王 真 鄒 冰 夏 敏 蔣 慧

上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科（上海 200040）

兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）10年無(wú)病生存率高達(dá)80%，發(fā)達(dá)國(guó)家5年生存率已經(jīng)接近甚至超過(guò)90%，這與目前的分層治療、白血病細(xì)胞生物學(xué)特性及積極的支持治療有關(guān)，也是多中心合作研究不斷優(yōu)化治療方案的結(jié)果[1-3]。其中根據(jù)形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和早期治療反應(yīng)等危險(xiǎn)因素進(jìn)行危險(xiǎn)度分型，對(duì)所有患兒進(jìn)行相應(yīng)的分層化療更顯重要。本研究回顧分析220例初診ALL患兒的臨床資料，通過(guò)誘導(dǎo)治療第19、46天骨髓細(xì)胞學(xué)及微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）檢測(cè)來(lái)評(píng)估早期治療反應(yīng)對(duì)于預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，為持續(xù)優(yōu)化治療方案，進(jìn)一步提高兒童白血病的長(zhǎng)期生存提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧分析2015年4月至2019年12月上海兒童醫(yī)院血液科初診ALL患兒的臨床資料。研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡0～18歲，接受CCCG-2015方案規(guī)范治療的初診ALL患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：成熟B-ALL、混合表型白血病、明確慢性粒細(xì)胞白血病急變、第二腫瘤、繼發(fā)于免疫缺陷病、非初治、診斷明確即放棄治療或不規(guī)范治療者。

研究對(duì)象均采用CCCG-ALL-2015化療方案（通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并得到患兒及家屬知情同意）。根據(jù)危險(xiǎn)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，患兒分為低危、中危及高危組。低危組必須同時(shí)滿(mǎn)足以下條件：①發(fā)病年齡1～9.9歲，且起病時(shí)白細(xì)胞數(shù)（WBC）≤50×109/L，或染色體數(shù)≥50，或?yàn)門(mén)EL/AMLl融合基因型；②無(wú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病和睪丸白血病，無(wú)t(1;19)、t(9;22)或MLL重排染色體數(shù)＜44；③誘導(dǎo)治療19天MRD＜1%。中危組：Ph+ALL；T-ALL；MLL重排（年齡≥6個(gè)月或WBC＜300×109/L）；染色體數(shù)＜44；其他不符合低危和高危的ALL。高危組：誘導(dǎo)治療46天MRD≥1%；MLL重排（年齡＜6個(gè)月且WBC≥300×109/L）。

誘導(dǎo)第19、46天骨髓細(xì)胞學(xué)檢查和MRD監(jiān)測(cè)為早期治療反應(yīng)評(píng)估節(jié)點(diǎn)。動(dòng)態(tài)調(diào)整危險(xiǎn)度，低危組第19天MRD≥1%進(jìn)入中危組，低危組第19天MRD≥0.1%至第46天MRD≥0.01%者則進(jìn)入中危組；第46天MRD≥1%進(jìn)入高危組。緩解后治療過(guò)程中MRD陽(yáng)性（＞0.01%）時(shí)加用DEAL方案，即地塞米松20 mg/(m2·d)，第1～6天；阿糖胞苷2 g/m2，q12h×4次，第1、2天；足葉乙甙100 mg/m2，q12h×5次，第3～5天；培門(mén)冬酰胺酶2 000 U/m2，1次，第6天，1個(gè)療程。高危組則有骨髓移植指征。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 通過(guò)醫(yī)院病案查詢(xún)系統(tǒng)、科室專(zhuān)科隨訪(fǎng)登記本及電話(huà)隨訪(fǎng)等方法，收集研究對(duì)象的臨床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查及預(yù)后療效等資料。

1.2.2 骨髓細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 采用骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)（morphology，M）分類(lèi)和細(xì)胞免疫組化染色方法，同時(shí)結(jié)合骨髓免疫學(xué)分型（immunology，I）、細(xì)胞遺傳學(xué)（cytogenetics，C）和分子生物學(xué)（molecular biology，M）檢測(cè)進(jìn)行MICM分型診斷。分子生物學(xué)檢測(cè)采用結(jié)合原位熒光雜交法（FISH），選用的探針包括TEL/AML1、MLL重排、BCR/ABL1、PBX1/TCF3。

1.2.3 微小殘留病監(jiān)測(cè) 免疫表型及MRD監(jiān)測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）免疫表型標(biāo)志組合。MRD＜0.01%為陰性，MRD≥0.01%為陽(yáng)性。

1.2.4 療效判斷 療效標(biāo)準(zhǔn)參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第3版[4]。無(wú)事件生存（event free survival，EFS）定義為自診斷到第一次事件發(fā)生或末次隨訪(fǎng)時(shí)間，事件包括誘導(dǎo)未緩解、復(fù)發(fā)、死亡?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為自診斷到死亡或末次隨訪(fǎng)時(shí)間。本研究隨訪(fǎng)截止時(shí)間2020年12月31日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析。非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析5年EFS與OS，組間生存率比較采用log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用COX回歸模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

2015年4月至2019年12月初診ALL兒童223例，符合入組標(biāo)準(zhǔn)納入研究220例。男128例、女 92 例，男、女比例1.4:1；中位年齡5.1歲（2.8～6.9歲）。初診時(shí)外周血WBC 27（4.4～23.5）×109/L，血紅蛋白84（67～99）g/L，血小板111（32～150）×109/L。113例患兒初診時(shí)存在外周血幼稚細(xì)胞；2例初診時(shí)合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)，5例合并睪丸浸潤(rùn)。

220例患兒中，低危組127例、中危組90例、高危組3例；203例為B-ALL，17例為T(mén)-ALL；204例獲得MRD篩選指標(biāo)。41例TEL/AML1融合，5例BCR/ABL1融合，7例MLL重排，8例PBX1/TCF3融合。染色體≥50高二倍體26例，假二倍體34例，正常核型160例。

2.2 總體生存分析

中位隨訪(fǎng)時(shí)間45（15.5～44）月。208例（94.6%）長(zhǎng)期生存，5年EFS為（87.5±2.6）%，5年OS（92.7±2.2）%（圖1）；12例（5.4%）死亡，15例（6.8%）復(fù)發(fā)；5年累積復(fù)發(fā)率（9.4±2.4）%，中位復(fù)發(fā)時(shí)間為32（9～34）月。

圖1 220例患兒總體生存分析

15例復(fù)發(fā)患兒中，極早期復(fù)發(fā)（＜18個(gè)月）8例，早期復(fù)發(fā)（18～36個(gè)月）7例。其中低危組5例、中危組9例、高危組1例（6.7%）；單純骨髓復(fù)發(fā)12例，骨髓合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)1例，單純中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)1例，睪丸復(fù)發(fā)1例。

2.3 早期治療反應(yīng)評(píng)估

誘導(dǎo)第19天骨髓細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，220例患兒中，215例幼稚淋巴細(xì)胞＜5%（M1），誘導(dǎo)緩解率97.7%；3例幼稚淋巴細(xì)胞5%～25%（M2）、2例＞25%（M3）。215例M1組和5例（M2+M3）組患兒的5年EFS率分別為（88.2±2.6）%和（60±21.9）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.93，P=0.003）。誘導(dǎo)第46天骨髓細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，219例（99.6%）完全緩解，1例骨髓未緩解。

誘導(dǎo)第19天，220例患兒中204例（92.7%）篩選到MRD監(jiān)測(cè)指標(biāo)，陰性77例、陽(yáng)性 127例，兩者5年EFS率分別為（94.4±3.5）%和（82.5±3.9）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.83，P=0.028）。127例MRD陽(yáng)性患兒中，57例MRD為0.01%～0.099%，40例0.1%～0.99%，30例≥1%，5年EFS率分別（93.5±3.8）%、（80.9±7.1）%、（64.1±10.3）%。MRD≥1 %組患兒5年EFS（64.1±10.3）%與MRD 0.01%～0.99%組患兒（87.9±3.9）%之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.39、P=0.001）。誘導(dǎo)第46天，191例持續(xù)監(jiān)測(cè)MRD，陰性173例、陽(yáng)性18例，兩者5年EFS率分別（92±2.7）%、（55.6±11.7）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.15，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 第19天和第46天不同MRD組生存分析

誘導(dǎo)第19天MRD陽(yáng)性者于第46天繼續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，37例第19天MRD 0.1%～0.99%者，第46天持續(xù)陽(yáng)性6例；29例≥1%者，持續(xù)陽(yáng)性11例；49例0.01%～0.099%者，持續(xù)陽(yáng)性1例。第19天MRD≥1%至第46天MRD持續(xù)陽(yáng)性者，復(fù)發(fā)率（6/11，54.6%）高于第46天MRD轉(zhuǎn)陰患兒（1/18，5.6%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher精確概率法，P=0.006）。

誘導(dǎo)第19天MRD＜0.01%、0.01%～0.099%、0.1%～0.99%、≥1%，及誘導(dǎo)第46天MRD陽(yáng)性患兒累積復(fù)發(fā)率分別為（3.1±3.1）%、（3.1±3.1）%、（16.4±6.8）%、（31.3±10.5）%、（41.0±11.9）%；第19天MRD 0.01%～0.099%組與≥1 %組及第46天MRD陽(yáng)性組比較，累積復(fù)發(fā)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.27、21.08，P均＜0.001）。見(jiàn)圖3。誘導(dǎo)第19 天MRD≥1%以及第46天MRD仍持續(xù)陽(yáng)性者，累積復(fù)發(fā)率為（59.6±15.5）%。

圖3 第19天和第46天不同MRD組累積復(fù)發(fā)分析

2.4 長(zhǎng)期生存單因素分析

220例患兒按年齡、性別、免疫表型、初診時(shí)睪丸浸潤(rùn)及外周血常規(guī)等臨床特征單因素分析5年EFS，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 220例ALL患兒臨床特征單因素分析

存在TEL/AML 1融合、BCR/ABL 1融合、MLL重排以及PBX1/TCF3融合基因患兒的5年EFS率分別為100%、（80.0±17.9）%、（51.4±20.4）%和（87.5±11.7）%。TEL/AML1融合患兒5年EFS與BCR/ABL 1、HR重排患兒的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.20、16.32，P均＜0.001）。見(jiàn)圖4。HR重排陽(yáng)性患兒5年EFS為（51.4±20.4%），低于陰性患兒的（86.8±3.1%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.57，P=0.018）。

圖4 分子生物學(xué)異?；純荷媲€(xiàn)

高二倍體、假二倍體以及正常核型患兒5年EFS率分別為（84.4±10.2）%、（82.4±6.5）%、（89.1±2.8）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.77，P=0.510）。

低危組、中危組和高危組5年E F S分別為（91.9±2.9）%、（82.7±4.8）%和（33.3±27.2）%，5年OS分別為（97.6±1.3）%、（86.2±5.2）%和（66.7±27.2）%；高危組與低、中危組患兒5年EFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.66、11.30，P均=0.001）；低危組與非低危組患兒5年OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.43，P=0.02）。

2.5 長(zhǎng)期生存多因素分析

對(duì)臨床危險(xiǎn)度分型，TEL/AML1、MLL重排、BCR/ABL 1融合基因，第19天骨髓緩解狀態(tài)及第19天MRD、第46天MRD等因素進(jìn)行COX回歸模型分析，結(jié)果顯示，第19天MRD≥1%（HR=7.04，95%CI：2.84～17.46，P＜0.001）和第46天MRD≥0.01%（HR=1.67，95%CI：1.17～2.37，P=0.005）是影響EFS預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

隨著對(duì)ALL發(fā)病機(jī)制和臨床特點(diǎn)的深入了解，MRD作為預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)已廣泛應(yīng)用于臨床，基于MRD進(jìn)行的危險(xiǎn)度分層和化療方案不斷優(yōu)化，兒童ALL預(yù)后大為改善[5-7]?；仡櫡治霰窘M220例ALL患兒，誘導(dǎo)緩解率97.7%，5年EFS為（87.5±2.6）%，5年OS （92.7±2.2）%，累積復(fù)發(fā)率（9.4±2.4）%，無(wú)病生存及復(fù)發(fā)率較以往有明顯改善，接近發(fā)達(dá)國(guó)家水平[8]。

臨床研究表明，早期治療反應(yīng)敏感、治療后迅速完全緩解患兒的預(yù)后較好[9]。目前主要通過(guò)潑尼松治療反應(yīng)、誘導(dǎo)治療骨髓狀態(tài)及誘導(dǎo)結(jié)束骨髓緩解情況來(lái)評(píng)估患兒對(duì)早期治療的反應(yīng)。本組患兒誘導(dǎo)治療第19天MRD＜0.01%者預(yù)后好，而MRD≥1%患兒的5年EFS僅（64.1±10.3）%。國(guó)外研究也提示這部分患兒預(yù)后差[10]。因此，需要及時(shí)調(diào)整患兒的危險(xiǎn)度分級(jí)，加強(qiáng)化療方案以提高療效。本組患兒經(jīng)強(qiáng)化療后仍有18例第46天MRD持續(xù)陽(yáng)性，5年EFS（55.6±11.7）%，累積復(fù)發(fā)率達(dá)（41.0±11.9）%，預(yù)后不佳[11]；尤其是第19天MRD≥1%、第46天MRD仍持續(xù)陽(yáng)性者累積復(fù)發(fā)率更高達(dá)（59.6±15.5）%。為改善這部分患兒的長(zhǎng)期生存，需要制定新的治療策略，新的靶向精準(zhǔn)治療或細(xì)胞免疫治療，盡早骨髓移植，提高ALL的EFS。值得注意的是，本組40例第19天MRD 0.1%～0.99%患兒的累積復(fù)發(fā)率為（16.4±6.8）%，與MRD陰性及0.01%～0.099%患兒相比，相對(duì)較高。除了化療方案需要適當(dāng)加強(qiáng)外，還需要進(jìn)一步行二代測(cè)序技術(shù)，識(shí)別影響預(yù)后的高危因素，改善預(yù)后。

文獻(xiàn)報(bào)道，TEL/AML1融合ALL預(yù)后好[12]，但易出現(xiàn)晚期復(fù)發(fā)[13]。本組41例TEL/AML1融合患兒全部達(dá)到持續(xù)緩解狀態(tài)，需要進(jìn)一步隨訪(fǎng)觀(guān)察。既往預(yù)后較差的Ph+ALL，在本組中5年EFS為（80±17.9）%，考慮與化療聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑靶向治療有關(guān)[14]，因而移植并非此類(lèi)患兒的首選治療手段[15]。文獻(xiàn)報(bào)道，MLL重排的ALL患兒預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高[16]。本組患兒中，MLL重排ALL患兒5年EFS僅（51.4±20.4）%，究其原因可能是MLL重排具有非常獨(dú)特的基因表達(dá)譜和相關(guān)的變異，細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素和L-天門(mén)冬酰胺酶的耐藥性，對(duì)傳統(tǒng)化療反應(yīng)并不敏感，需要應(yīng)用酶抑制劑新型靶向治療藥物，有利于預(yù)防早期復(fù)發(fā)和延長(zhǎng)生存期[17-18]。

綜上所述，目前兒童ALL通過(guò)監(jiān)測(cè)誘導(dǎo)第19天和第46天MRD評(píng)估早期治療反應(yīng)，及時(shí)調(diào)整臨床危險(xiǎn)度、加強(qiáng)化療強(qiáng)度、制定新的治療策略，對(duì)于進(jìn)一步提高兒童ALL的總體生存意義重大。