袁群 胡海林 毛欣 王能 曹淼 何清湖

〔摘要〕 目的 觀察破壁靈芝孢子粉對正常大鼠睡眠功能的影響，初步探討其作用機制。方法 將雄性SD大鼠隨機分成正常對照組、陽性對照組、破壁靈芝孢子粉低、中、高劑量組（0.42、0.84、1.68 g/kg），每組9只，灌胃劑量為10 mL/（kg·d-1），連續(xù)灌胃14 d。末次灌胃后分別進行直接睡眠實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗、閾上劑量睡眠潛伏期及睡眠時間實驗，并測定大鼠血漿5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）、多巴胺（dopamine， DA），及下丘腦中5-HT、谷氨酸（glutamic acid， Glu）、γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid， GABA）的含量。結果 破壁靈芝孢子粉能明顯縮短大鼠睡眠潛伏期，提高大鼠睡眠率（P<0.05），對睡眠總時長的影響雖無統(tǒng)計學差異，但有延長睡眠時間的趨勢。中、高劑量的破壁靈芝孢子粉能夠提高大鼠下丘腦5-HT、GABA含量（P<0.05，P<0.01），同時也能提高血漿中5-HT水平、降低DA的含量（P<0.05，P<0.01）。結論 破壁靈芝孢子粉具有睡眠改善作用，其作用機制與調節(jié)大鼠腦內5-HT和Glu/GABA平衡，以及血中興奮-抑制中樞神經系統(tǒng)的神經遞質有關。

〔關鍵詞〕 靈芝孢子粉;睡眠;5-羥色胺;多巴胺;γ-氨基丁酸

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.011

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of broken wall ganoderma spores powder on sleep function in normal rats， and explore the mechanisms. Methods Male SD rats were randomly divided into five groups， normal group， positive group and low， medium and high dose （0.42， 0.84， 1.68 g/kg） broken wall ganoderma spores group， 9 rats in each group， 10 mL/（kg·d） in intragastric administration for 14 days. After the last intragastric administration， direct sleep test， pentobarbital sodium subthreshold dose hypnotism test， supra threshold dose sleep latency test and sleep time test were conducted， and plasma 5-hydroxytryptamine （5-HT）， dopamine （DA） and the content of 5-HT， glutamic acid （Glu） and gamma-aminobutyric acid （GABA） in the hypothalamus were measured. Results Broken wall ganoderma spore powder could significantly shorten sleep latency and increase sleep rate （P<0.05）. There was no statistical difference in sleep time， but there was a tendency to prolong sleep time. Medium and

high doses of broken wall ganoderma spore powder could increase the content of 5-HT and GABA in hypothalamus and decrease the content of Glu （P<0.05， P<0.001）， at the same time， the concentration of 5-HT in plasma was increased while the DA were decreased （P<0.05， P<0.001）. Conclusion Broken wall ganoderma spores powder can improve sleep， the mechanism of which is related to the regulation of 5-HT and Glu/GABA balance in rat brain， and the neurotransmitter of excitation-inhibition of central nervous system in blood.

〔Keywords〕 broken wall ganoderma spores powder; sleep; 5-hydroxytryptamine; dopamine; gamma-aminobutyric acid

靈芝，屬于擔子菌門擔子菌綱多孔菌科靈芝屬藥用真菌[1]，是一味珍貴的中藥藥材，具有益氣安神、扶正固本之功效[2]。成熟靈芝形成擔子孢子，為繁殖細胞，收集后即為靈芝孢子粉，其含有靈芝子實體幾乎所有的活性物質和功效作用[3]。大量的研究表明靈芝孢子粉能有效調節(jié)免疫力[4-5]，在抗腫瘤、防輻射過程中發(fā)揮著重要作用[6]，同時兼具有降血脂、護肝[7]及促眠[8]等功能。破壁靈芝孢子粉是一種靈芝深加工產品，有研究表明靈芝孢子粉在破壁后多糖與總三萜含量均高于未破壁孢子粉[9]，且更容易被人體吸收[10]。目前對于靈芝孢子粉改善睡眠的研究多集中在臨床療效的觀察，而對于其改善睡眠的機制研究還鮮有報道。本研究通過觀察不同劑量破壁靈芝孢子粉對戊巴比妥鈉所致大鼠催眠作用及血漿、腦內神經遞質含量的變化，初步探討其作用機制，為進一步研究靈芝孢子粉改善睡眠的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 ?實驗動物

實驗動物為健康SPF級雄性SD大鼠90只，體質量（200±20） g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]。在湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心開展實驗[許可證號SYZK（湘）2019-0009]。實驗過程中動物自由飲水攝食，喂養(yǎng)的飼料相同。所用飼料和墊料均購自湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 ?實驗藥品與主要試劑

破壁靈芝孢子粉（浙江金華壽仙谷藥業(yè)有限公司，批號：20200306）;艾司唑侖片（華中藥業(yè)股份有限公司，批號20181203）;戊巴比妥鈉（上海化學試劑采購供應站分裝廠，批號20200529）;5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid， GABA）、多巴胺（dopamine， DA）均購自南京建成生物科技有限公司。

1.3 ?主要儀器設備

低速離心機（型號Fresco17， Thermo公司）;多功能酶標儀（型號VarioskanLUX， Thermo公司）等。

2 方法

2.1 ?實驗動物分組與給藥

90只實驗動物適應性喂養(yǎng)7 d后稱質量，隨機分為2個批次（n=45），第1批次大鼠進行直接睡眠實驗和戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗，第2批次大鼠進行戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠時間、睡眠潛伏期實驗。每批大鼠分為5組（n=9），分別為正常對照組、陽性對照組、破壁靈芝孢子粉低、中、高劑量組，本實驗的受試藥物破壁靈芝孢子粉人體推薦量4 g/d。大鼠給藥劑量根據(jù)體表面積法換算即70 kg體質量人與1 kg體質量大鼠之間的藥物等效劑量比值為6.25[11]，以此1、2、4倍設置低、中、高3個劑量組（簡稱低、中、高劑量組），各組每日分別給予0.42、0.84、1.68 g/kg劑量，灌胃1次/d，陽性對照組藥物（艾司唑侖，0.089 mg/kg），各組大鼠按照10 mL/kg劑量灌胃，對照組每日灌胃經消毒處理后的蒸餾水，體積與實驗組相同。連續(xù)灌胃14 d后檢測大鼠各項指標。

2.2 ?行為學評價方法

2.2.1 ?直接睡眠實驗 ?大鼠睡眠以翻正反射消失為標準（當大鼠置于背臥位時超過1 min不能翻正者，即認為翻正反射消失）[12]，進入睡眠狀態(tài)。灌胃1 h內觀察各組大鼠睡眠情況，記錄各組大鼠入睡數(shù)量計算構成比及睡眠時間，以觀察受試藥物對大鼠是否存在直接睡眠的作用。

2.2.2 ?戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗 ?閾下劑量睡眠發(fā)生率是評判藥物協(xié)同睡眠作用的一個常用指標。根據(jù)本課題組預實驗已測得本組實驗大鼠的戊巴比妥鈉閾下劑量為28 mg/kg（使90%～100%大鼠翻正反射不消失的最大劑量），各組動物末次灌胃后藥物作用峰值前10～15 min，按28 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，注射劑量為10 mL/kg。記錄30 min內各組大鼠入睡的數(shù)量。

2.2.3 ?延長戊巴比妥鈉睡眠及睡眠潛伏期實驗 ?戊巴比妥鈉誘導的大鼠睡眠實驗是評價睡眠藥物研究中必不可少的行為學實驗。本研究預實驗測得本實驗大鼠閾上劑量為37 mg/kg（100%的大鼠發(fā)生翻正反射消失的最小劑量）[13]。即觀察在閾上劑量的干預下，各組大鼠睡眠潛伏期及睡眠時間。各組動物末次給予灌胃出現(xiàn)藥物作用峰值前10～15 min，按37 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，注射劑量為10 mL/kg。從注藥至翻正反射消失這段時間為睡眠潛伏期;從翻正反射消失到其恢復這段時間為睡眠時間，記錄各組動物睡眠潛伏期和睡眠時間。

2.3 ?觀察各組大鼠血（DA、5-HT）及下丘腦組織中（5-HT、GABA、Glu）的水平

第一批次45只大鼠完成閾下劑量睡眠實驗后禁食不禁水1 d，于次日晨稱質量后采取戊巴比妥鈉腹腔注射（劑量40 mg/kg，注射劑量為10 mL/kg）麻醉，進行腹主動脈采血，新鮮促凝血4 mL，離心收集上層血清;分離肝、脾、胸腺等器官并稱質量，計算大鼠臟器指數(shù);最后采取頸椎脫臼處死大鼠，冰上斷頭取腦，分離出下丘腦組織，用預冷生理鹽水漂洗、濾紙拭干，稱質量。按體質量（g）∶體積（mL）=1∶9比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下玻璃勻漿器勻漿，使組織勻漿化。離心半徑13.5 cm，2 500 r/min，離心10 min，取上清液待測。根據(jù)各指標操作流程進行，用多功能酶標儀進行檢測和分析。

2.4 ?實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用雙人雙錄入的方法，用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗結果，方差齊則計算F值，方差不齊則采用非參數(shù)檢驗的秩和檢驗;計數(shù)資料采用卡方檢驗，本研究總例數(shù)>40，1<最小的理論頻數(shù)<5，所以選擇“校正法”，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠行為學的影響

3.1.1 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠直接睡眠的影響 ?干預14 d后，觀察各組大鼠灌胃后60 min內的活動情況。各組大鼠活動正常，均未出現(xiàn)翻正反射消失，睡眠發(fā)生率為零。見表1。

3.1.2 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠閾下劑量睡眠率的影響 ?陽性對照組睡眠率88.9%，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;靈芝孢子粉低、中、高劑量組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

3.1.3 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠睡眠潛伏期及睡眠時間的影響 ?在睡眠潛伏期方面，陽性對照組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;靈芝孢子粉各劑量組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但高劑量組大鼠入睡潛伏期最短。在睡眠總時長方面，各組大鼠睡眠時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3.2 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠神經遞質的影響

各組隨機抽取4只大鼠進行干預后腦組織及血漿神經遞質的檢測。陽性對照組較正常對照組大鼠腦組織5-HT、GABA、Glu含量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但5-HT、GABA含量有增加的趨勢，而Glu的含量卻有下降的趨勢。與正常對照組大鼠比較，靈芝孢子粉高劑量組大鼠下丘腦組織中5-HT、GABA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且與陽性對照組比較，靈芝孢子粉高劑量組大鼠下丘腦組織內5-HT、GABA含量均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。靈芝孢子粉各組與正常對照組大鼠下丘腦組織中Glu含量雖有下降趨勢，但均無顯著性差異（P>0.05）。見表4。

陽性對照組較正常對照組大鼠血漿中DA含量顯著下降，而5-HT含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而靈芝孢子粉各劑量組大鼠較正常對照組大鼠血漿中DA含量均有下降，5-HT含量均有升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），但與陽性對照組大鼠比較，靈芝孢子粉各組血漿DA含量差異卻無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;在血漿5-HT方面，僅靈芝孢子粉中劑量組大鼠較陽性對照組大鼠顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5。

4 討論

目前對于睡眠改善的動物實驗研究主要從行為學、免疫因子學和中樞神經遞質等方面著手。其中通過戊巴比妥鈉催眠實驗[11]及中樞神經遞質水平來探討其效果及機制已成為中藥研究的重要途徑[14]，涉及的神經遞質主要有GABA、Glu、5-HT、色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase， TPH）、DA、去甲腎上腺素（norepinephrine， NE）、組胺等。

4.1 ?破壁靈芝孢子粉對對大鼠睡眠改善效果觀察

本研究發(fā)現(xiàn)干預后各組大鼠均未發(fā)生睡眠現(xiàn)象，靈芝孢子粉各組大鼠自主活動有所下降，表明靈芝孢子粉具有一定的鎮(zhèn)靜作用，能夠減少動物自發(fā)性的活動，但其本身并沒有直接催眠或麻醉的作用，這一結果與肖科金等人的結果一致[15-16]。在本睡眠潛伏期研究中發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子粉各劑量組都能顯著提高大鼠的睡眠率，且與陽性對照組在提高入睡率效果上無差異，表明靈芝孢子粉能縮短戊巴比妥鈉誘導的大鼠睡眠潛伏期，存在延長睡眠時間的趨勢，增加閾下劑量戊巴比妥鈉誘導的大鼠睡眠發(fā)生率，說明靈芝孢子粉能夠增強巴比妥類藥物的中樞抑制作用，從而起到改善睡眠的效果，本實驗可能因原料來源、劑量不同、干預時間長短不一致等，實驗效果也有所不同，但本實驗發(fā)現(xiàn)改善睡眠的效果與受試物劑量有一定的線性關系。該結果與以往相關結果基本一致[8]。

4.2 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠神經遞質的影響

5-HT主要來自胃腸道及中樞神經系統(tǒng)，血中也分布有5-HT。本研究發(fā)現(xiàn)受試藥物組大鼠下丘腦及血漿中5-HT濃度高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明破壁靈芝孢子粉能有效提高大鼠下丘腦及血漿5-HT含量。5-HT又名血清素，是目前較為公認的參與睡眠-覺醒機制的經典神經遞質，被認為是腦內的“致眠因子”，早在1968年就有研究者發(fā)現(xiàn)藥物拮抗[17]或者手術切除5-羥色胺能細胞可導致失眠，并得出5-羥色胺可促進睡眠的結論[18]。本研究發(fā)現(xiàn)破壁靈芝孢子粉對下丘腦、血清中5-HT有一定的調節(jié)作用，通過提高5-HT的水平起到促進睡眠的作用。

GABA是腦內重要的抑制性神經遞質，對睡眠的開始與維持起著重要的作用[19-20]。Glu作為興奮性氨基酸類神經遞質，能夠在谷氨酸脫羧酶的作用下轉化為GABA[14]，因此，認為GABA與Glu作為腦內主要的抑制性與興奮性神經遞質[21]，維持他們之間的穩(wěn)態(tài)平衡對改善睡眠也是至關重要的[22]。本研究對大鼠下丘腦組織中GABA、Glu水平進行了檢測，中、高劑量組大鼠GABA水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），經兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)，提高水平與受試物劑量存在一定的量效關系，高劑量組增高最明顯。該結果表明破壁靈芝孢子粉能夠降低因Glu占比過高或GABA占比過低所引起的興奮，使其處于平衡狀態(tài)。

DA是中樞神經系統(tǒng)中廣泛分布的神經遞質，在睡眠-覺醒調控中發(fā)揮重要的作用[23]。目前研究認為DA在覺醒狀態(tài)中起著極其重要的作用[24]，主要通過腦內的DA能神經系統(tǒng)來發(fā)揮其作用，Li等[25]發(fā)現(xiàn)一些擬DA藥物是通過對前腦基底部及腦干區(qū)域的作用而促進覺醒延長。本研究中受試藥物各組大鼠血漿DA水平顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），證明靈芝孢子粉在改善睡眠方面不單是提高抑制性神經遞質的水平，同時對興奮性遞質水平也有一定的調節(jié)作用。

5 小結

區(qū)別于以往以疾病為基礎的機制研究，本研究從正常大鼠著手，探討靈芝孢子粉對正常大鼠睡眠效果的影響機制，并針對中藥成分多、途徑多的特點，將大鼠下丘腦GABA、5-HT和Glu以及血漿5-HT和DA作為檢測對象，研究結果表明破壁靈芝孢子粉不僅能夠提高下丘腦與血漿中5-HT含量，還能有效調節(jié)下丘腦GABA與Glu的含量，維持Glu/GABA平衡，并且能降低血漿中DA水平，說明靈芝孢子粉不僅通過提高抑制性神經遞質的水平、降低興奮性神經遞質含量，還能調節(jié)Glu與GABA含量，維持興奮性神經遞質與抑制性神經遞質之間的穩(wěn)態(tài)平衡，從而發(fā)揮改善睡眠的作用，這為靈芝孢子粉治療失眠提供了實驗基礎，并為本課題組深入探討靈芝孢子粉改善失眠的作用機制提供了參考。本研究在設計上也存在一些不足，如未對TPH進行檢測，該酶作為5-HT生物合成中的起始酶和限速酶，被認為對調節(jié)5-HT濃度有關鍵作用。在后期的研究中將補充研究5-HT與TPH之間的平衡關系，以探討靈芝孢子粉對5-HT能系統(tǒng)的調節(jié)機制。

參考文獻

[1] 邵力平，沈瑞祥，張素軒，等.真菌分類學[M].北京：中國林業(yè)出版社，1984：226-228.

[2] 戴則林，董昌武.靈芝多糖的生物活性研究進展[J].安徽中醫(yī)學院學報，2005，24（5）：60-62.

[3] 包縣峰，徐 ?勇，劉維明，等.靈芝孢子粉生物活性成分及藥理作用[J].食品工業(yè)科技，2020，41（6）：325-331.

[4] 李 ?立，王亞東，王海玉，等.破壁靈芝孢子粉對小鼠免疫功能調節(jié)作用的實驗研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2019，29（23）：2835-2836，2839.

[5] CHAN W K， LAM D T， LAW H K， et al. Ganoderma lucidum mycelium and spore extracts as natural adjuvants for immunotherapy[J]. Journal of Alternative and Complementary Medicine， 2005， 11（6）： 1047-1057.

[6] 譚洪升，李 ?翔，鞏伯梁，等.靈芝子實體和孢子粉三萜含量的測定及體外抗腫瘤活性的評價[J].微生物學免疫學進展，2018，46（1）： 43-48.

[7] 沐 ?華，蔡 ?銘，徐 ?靖，等.破壁與去壁靈芝孢子粉的化學成分與抗氧化活性比較[J].食品工業(yè)科技，2020，41（10）：32-37，51.

[8] 樸 ?瑋，韓 ?楓，徐維盛，等.破壁靈芝孢子粉及靈芝提取物的混合物對改善小鼠睡眠功能的研究[J].食品科技，2015，40（11）：172-175.

[9] 王 ?方，麻紅太，胡 ?德，等.靈芝孢子粉破壁前后質量對比研究[J].特產研究，2020，42（1）：47-53.

[10] 馬藝沔，丁自勉，陳向東，等.靈芝孢子粉破壁技術、質量分析與深加工相關研究進展[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2019，21（5）：892-899.

[11] 姜興華，李晨曦，余 ?宙，等.具有改善睡眠功能的五味子葡萄酒的研制[J].食品科技，2012，37（11）：103-106.

[12] 徐叔云.藥理實驗方法學[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：804-805.

[13] 王亞茹，于世家.自擬安眠方對小鼠自主活動及協(xié)同戊巴比妥鈉睡眠實驗的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（9）：935-938.

[14] 陳希民，王 ?鑫，魏九齡，等.一種酸棗仁提取物、茶氨酸、γ-氨基丁酸配方產品改善睡眠作用研究[J].食品工業(yè)科技，2020，41（20）：303-306.

[15] 肖科金，周德生.中藥提取物促進睡眠作用研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（12）：103-105.

[16] 邱賽紅，仇 ?萍，黃宇明，等.靈芝的藥理研究概況[J].湖南中醫(yī)藥導報，1999，5（10）：19-21.

[17] KOELLA W P. Discussion of insomnia and decrease of cerebral 5-hydroxytryptamine after destruction of the raphe system in the cat[J]. Advances in Pharmacology， 1968， 6（Pt B）： 280-282.

[18] JOUVET M. Insomnia and decrease of cerebral 5-hydroxytryptamine after destruction of the raphe system in the cat[J]. Advances in Pharmacology， 1968， 6（Pt B）： 265-279.

[19] 朱政羽，趙 ?娜，吳旭杰，等.怡神助眠湯聯(lián)合西藥唑吡坦治療失眠癥臨床療效及對腦內神經遞質的影響[J].新中醫(yī)，2019，51（10）：99-102.

[20] KIM S， JO K， HONG K B， et al. GABA and l-theanine mixturedecreases sleep latency and improves NREM sleep[J]. Pharmaceutical Biology， 2019， 57（1）： 65-73.

[21] ASIKAINEN M， TOPPILA J， ALANKO L， et al. Sleep deprivation increases brain serotonin turnover in the rat[J]. Neuroreport， 1997， 8（7）： 1577-1582.

[22] 徐飛飛，田雅娟，李欽青，等.酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠睡眠的改善作用及機制研究[J/OL].食品工業(yè)科技：1-14[2021-04-13].https：//doi.org/10.13386/j.issn1002-0306.2020070005.

[23] 宋志遠，易紅良.多巴胺與睡眠呼吸障礙研究進展[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2017，52（7）：549-551.

[24] 趙忠新.臨床睡眠障礙學[M]上海：第二軍醫(yī)大學出版社，2003，12.

[25] LI N， LIU J L， WANG M Y， et al. Sedative and hypnotic effects of Schisandrin B through increasing GABA/Glu ratio and upregulating the expression of GABAA in mice and rats[J]. Biomedecine & Pharmacotherapie， 2018， 103： 509-516.