牛 璐李偉霞 張 輝王曉艷張明亮陳毓龍?zhí)七M法

（1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州450046； 2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥臨床評價技術河南省工程實驗室，河南 鄭州450000； 3.河南中醫(yī)藥大學呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州450046）

甘草干姜湯是《金匱要略》 中記載的一首經方，由炙甘草（12 g）和炮姜（6 g）兩味中藥組成，主治肺痿咳吐涎沫［1］?！督饏T要略講義·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》第五條言，“肺痿吐涎沫而不咳者，其人不渴，必遺尿，小便數(shù)，所以然者，以上虛不能制下故也。此為肺中冷，必眩，多涎唾，甘草干姜湯以溫之”［2］。方中炙甘草和炮姜配伍，干姜辛溫能走能受，溫中回陽，溫肺化痰，偏治里寒，炮焦，有溫經止血功效；配炙甘草，補脾益氣，祛痰止咳，緩急止痛，辛從甘化，能受中復陽。兩藥合用，一補脾胃之虛，一復中焦之陽，使中陽得運，統(tǒng)攝有權，則吐血可止［3］。共同起到益氣、溫陽、化痰、止血的功效［4］。該方藥簡力宏，今人多認為此方有“培土生金”之妙，是現(xiàn)代臨床治療肺痿、哮喘、眩暈、尿頻等病證常用的基本方［5］。但目前有關甘草干姜湯的研究多集中在臨床觀察方面，而物質基礎和作用機制的研究報道較少［6?9］。故本研究擬采用超高液相色譜?四級桿?飛行時間質譜（ultra?performance liquid chromatography?quadrupole?time of flight?mass spectrometry，UPLC?Q?TOF／MS）技術結合UNIFI 數(shù)據(jù)庫對甘草干姜湯中化學成分進行快速分析，基于此，進一步采用網絡藥理學方法和分子對接技術對甘草干姜湯治療呼吸系統(tǒng)相關疾?。ǚ卫w維化、間質性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘）的作用機制進行探討，以期為甘草干姜湯的質量控制、體內過程分析及作用機制的深入研究奠定基礎，也為甘草干姜湯在臨床的合理應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters AcquityTMUPLC 液相系統(tǒng)；Xevo G2?XS QTof 質譜儀，配有 Lock?spray 接口，電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），MassLynx v4.1 質譜工作站；ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；XS105DU型十萬分之一天平（瑞士梅特勒?托利多集團）；Neofuge 1600R型臺式低溫高速離心機（上海力申科學儀器有限公司）；KQ?100DE型數(shù)顯超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 乙腈（批號JB086630）和甲醇（批號10999607909）為色譜純試劑，購自德國Merck 公司；甲酸（批號3257145）色譜純試劑，購自北京迪馬科技有限公司；亮氨酸腦啡肽（批號W15071909）購自美國Waters 公司；其他試劑均為分析純。炙甘草（批號19120101）購自鄭州瑞龍制藥股份有限公司，炮姜（批號190901）購自安徽石田中藥飲片有限公司；經河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部陳天朝主任藥師鑒定，均符合2015年版《中國藥典》（一部）炙甘草、炮姜項下標準［10］。

對照品10?姜酚（批號CHB180311）、橙皮苷（批號CHB180523）、甘草酸（批號CHB180610）、絡石苷元（批號CHB190106）、蒙花苷（批號CHB180120）、野黃芩苷（批號CHB180629）、木犀草苷（批號CHB180111）購自成都克洛瑪生物科技有限公司；補骨脂定（批號16042601）、補骨脂二氫黃酮甲醚（批號16060103）、補骨脂寧（批號160422）、川續(xù)斷皂苷乙（批號150922）、大豆苷（批號17040603）、大豆苷元（批號17122504）、大黃素甲醚（批號141214）、槲皮苷（批號151016）購自成都普菲德生物技術有限公司；丹酚酸B（批號P10A8F41491）、冬凌草乙素（批號Z13A7S13006）、地膚子皂 苷 IC（批號P15M6F2）、丹參酮Ⅰ（批號P20J8F40359）購自上海源葉生物科技有限公司；甘草次酸（批號lw19090603）、甘草素（批號lw19052203）和芒柄花素（批號lw18022712）購自南京良緯生物科技有限公司；甘草苷（批號PRF8110742）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；特女貞苷（批號111926?201404）購自中國食品藥品檢定研究院，以上所有對照品純度均≥98.0%。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 將炙甘草、炮姜飲片打粉，過80 目篩，精確稱取炙甘草粉末1.030 2 g、炮干姜粉末0.499 0 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入30 mL 50%甲醇，超聲提取1 h（功率100 W，頻率40 kHz），靜置后吸取上清液1 mL，于離心機14 000 r／min 離心10 min，吸取上清液100 μL待分析。

2.2 對照品溶液制備分別精密稱定對照品10?姜酚、橙皮苷、甘草酸、絡石苷元、蒙花苷、野黃芩苷、木犀草苷、補骨脂定、補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂寧、川續(xù)斷皂苷乙、大豆苷、大豆苷元、大黃素甲醚、槲皮苷、丹酚酸B、冬凌草乙素、地膚子皂苷IC、丹參酮Ⅰ、甘草次酸、甘草素、芒柄花素、甘草苷和特女貞苷，加甲醇分別制備成質量濃度分別為520、420、640、380、208、332、304、298、284、306、420、338、420、360、260、220、204、300、282、420、340、272、296、220 μg／mL 的對照品貯備液。

2.3 數(shù)據(jù)采集與處理

2.3.1 色譜條件 流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫（0～1 min，20% B；1～24 min，20%～80% B；24～25 min，80%～100% B；25～27 min，100% B；27～27.5 min，10%～100% B；27.5～30 min，10% B）；柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL／min；進樣量2 μL。

2.3.2 質譜條件 ESI 源，以MSEContinuum 模式在負離子條件下進行數(shù)據(jù)采集。毛細管電壓2.5 kV；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度250 ℃；錐孔電壓40 V；錐孔氣體積流量50 L／h；脫溶劑體積流量600 L／h；碰撞能量（10～45 V）；間隔掃描時間0.1 s。質量掃描范圍50～1 200m／z。準確質量測定采用亮氨酸?腦啡肽（1eucine?enkephalin，ESI－m／z554.261 5）溶液為鎖定質量溶液，采用甲酸鈉溶液對儀器質量軸進行校正。

2.3.3 成分分析 查閱在線和離線數(shù)據(jù)庫（PubMed、TCMSP、Chemical book、Chemspider、化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫等）及相關文獻，收集甘草干姜湯中單味藥的化學成分信息，主要包括化合物英文名稱、分子式、結構式，自建甘草干姜湯成分數(shù)據(jù)庫（EXCEL），導入UNIFI 數(shù)據(jù)庫。將采集的甘草干姜湯質譜數(shù)據(jù)導入UNIFI 軟件中，建立過濾篩選方法，設置質量誤差為5×10－6，保留時間誤差為0.1 min，響應值＞5 000，將甘草干姜湯的質譜數(shù)據(jù)與所建數(shù)據(jù)庫進行自動匹配，結合對照品保留時間及文獻信息進一步進行確認，并進行成分歸屬。

2.4 甘草干姜湯中活性成分及呼吸系統(tǒng)疾病靶點的收集和匹配 首先基于成分分析結果，通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平 臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug?likeness，DL）≥0.18，對甘草干姜湯中活性化合物進行篩選；然后通過TCMSP 及Swiss Target Prediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch）數(shù)據(jù)庫對甘草干姜湯中活性成分靶點進行預測。

在疾病關聯(lián)數(shù)據(jù)庫（genetic association database，GAD）、治療靶標數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／ttd，TTD）和基因名片數(shù)據(jù)庫（Gene Cards） （http：／ ／www.genecards.org／）等對呼吸系統(tǒng)疾病肺纖維化（Pulmonary fibrosis）、間質性肺疾病（Interstitial lung disease）、慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease）、哮喘（Asthma）的靶點進行預測。

所有靶點通過Uniprot 蛋白質數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.Unitprot.org／）將蛋白名轉換成基因名后，采用維恩圖對甘草干姜湯活性成分靶點及疾病靶點進行匹配，得到成分?疾病共有靶點。

2.5 京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路富集和基因本體論（Gene_ Ontology，GO）生物功能分析 將甘草干姜湯活性成分與疾病共有靶標輸入生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／ conversion.jsp），進行KEGG 通路分析和GO 富集分析。KEGG 通路篩選以p?value＜0.05 為限制條件。GO 富集分析，包括生物過程（BP，Biological Process）、分子過程（MF，Molecular Function）和細胞組成（CC，Cellular Component）3個部分，以p?value＜0.05 為限制條件。結合基迪 奧云平臺（Omicshare 數(shù)據(jù)庫）（http：／ ／www.omicshare.com／ tools／index.php／）將篩選條目制作成高級氣泡圖。

2.6 成分?靶點?疾病網絡構建 采用生物信息分析軟件Cytoscape 3.6.1 構建甘草干姜湯的“成分?靶點?疾病”網絡。網絡圖中的節(jié)點（node）表示活性成分、靶基因、疾病和通路，節(jié)點間相互關系用邊（edge）表示，利用軟件網絡分析（Network Analyzer）功能進行網絡拓撲分析。

2.7 分子對接驗證甘草干姜湯活性成分與作用靶點相互作用 將“2.6”篩選得到的核心成分作為小分子配體庫，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載各活性成分結構mol2 格式；在蛋白質結構數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）（http：／ ／www.rcsb.org／）下載重要潛在靶點蛋白質的晶體結構pdb 格式，作為受體庫。采用SYBYL?X 1.3 軟件對小分子化合物及受體進行優(yōu)化，并利用對接套件（Docking suite）選項進行分子對接；將對接后的蛋白導入Pymol 3.8 軟件進行渲染作圖。同時，通過藥物數(shù)據(jù)庫（Drugbank）（https：／ ／www.drugbank.ca／）查找作用于潛在靶點的臨床藥物進行對接作為對照。

3 結果

3.1 基于UPLC?Q?TOF／MS 的化學成分鑒別 甘草干姜湯的基峰離子流圖（BPI）見圖1。在甘草干姜湯供試品溶液中共檢測到116個化合物（見表1），其中95個歸屬于炙甘草，19個歸屬于炮姜，2個為炙甘草、炮姜共有成分。所測成分主要包括黃酮類、生物堿類、皂苷類等，其中24個化合物經與對照品確認。以新甘草苷（化合物28）為例，準分子離子峰為［M?H］－m／z417.119 2，化合物28 脫去一個C6H10O5中性片段得到M1［M?H?162］－m／z255.066 3 的碎片離子，M1 進一步脫去C8H8O 中性片段得到M2［M?H?120］－m／z135.008 4 的碎片離子，準分子離子脫 去C13H14O8中性片段得到M3［M?H?298］－m／z119.049 9 的碎片離子，可推斷該化合物為新甘草苷，該化合物在負離子模式下的高能裂解質譜圖和裂解途徑見圖2。

表1 甘草干姜湯化學成分鑒定結果

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 甘草干姜湯的基峰離子流圖

圖2 新甘草苷的質譜圖和裂解途徑

3.2 甘草干姜湯成分靶點與疾病靶點分析 檢測得到的甘草干姜湯116種成分中，40個成分滿足OB≥30%和DL≥0.18，12種成分通過文獻檢索確認具有較強的藥理活性［11?18］，共得到甘草干姜湯候選成分52種。通過TCMSP和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫得到甘草干姜湯成分對應的靶點837個。通過GAD、TTD、Gene Cards 等數(shù)據(jù)庫檢索得到肺纖維化相關靶標37個、間質性肺疾病相關靶標12個、慢性阻塞性肺疾病相關靶標444個，哮喘相關靶標714個。經與成分靶標匹配后得到共有靶點211個。

3.3 KEGG 代謝通路富集和GO 生物功能過程分析 將甘草干姜湯成分與呼吸系統(tǒng)疾病共有的211個靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫，得到KEGG 通路83 條（P＜0.05），篩選與疾病相關排名前20 的通路條目見圖3A。GO 富集分析得到BP、CC、MF 各405、52、108 條，排名前20 的條目分別見圖3B～3D。通過富集分析可知，甘草干姜湯治療呼吸系統(tǒng)疾病的靶點主要富集與神經活性配體?受體相互作用、鈣離子信號通路、乙型肝炎、PI3K?Akt 信號通路等；生物過程主要涉及藥物反應、胞質鈣離子濃度正調節(jié)、炎癥反應、凋亡過程負調控、對抗生素的反應等；這些靶點在細胞組分中與質膜、胞質、細胞器膜等較為相關；在分子功能中與藥物結合、血紅素結合、蛋白質酪氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶結合等高度相關。

圖3 甘草干姜湯KEGG 通路（A）、BP（B）、CC（C）、MF（D） 富集分析

3.4 甘草干姜湯成分?疾病?靶點網絡構建結果 采用Cytoscape 3.6.1 軟件構建甘草干姜湯“成分?靶點?疾病”網絡（圖4）。為尋找成分?靶點?疾病網絡中具有重要作用的靶標，進一步對導出拓撲數(shù)據(jù)excel 文件分析，設置度值＞14 進行核心網絡篩選（圖5）。由圖5 可知，篩選得到鱗葉甘草素A（MOL004828）、毛蕊異黃酮（MOL000417）、異甘草黃酮醇（MOL004949）、紅車軸草素（MOL003398）等核心成分共40種，PPARG、ESR2、PTGS2 等核心靶標36個。

圖4 甘草干姜湯的成分?疾病?靶點網絡

圖5 甘草干姜湯的成分?疾病?靶點核心網絡

3.5 分子對接驗證結果 通過甘草干姜湯核心成分?疾病?靶點網絡，將度值前4 的靶點ESR1（PDB ID：5GS4）、ESR2（PDB ID：5AAU）、PPARG（PDB ID：5U41）、PTGS2（PDB ID：4OTY）分別與40種核心成分進行分子對接。其中，Total Score 表示配體分子與蛋白質活性位點的結合作用分數(shù)，分值越高，配體分子與蛋白質的結合作用越好；Crash 為碰撞分數(shù)，值越高表示配體與蛋白質活性位點空腔形成的能量匹配情況越好；Polar值表示配體分子與活性位點氨基酸殘基間的氫鍵鍵合能力，分數(shù)越高，鍵能越強［19］。40種核心成分與4個靶點的主要對接結果（Total Score ≥5）見 表 2。結果顯示，6?姜辣素（MOL002467）、甘草黃酮C（MM0002）等12種成分與ESR1 有較強相互作用；刺果甘草查爾酮（MOL004835）、甘草皂苷A3（MM0005）等21種成分與ESR2 存在較強的相互作用；10?姜辣素（MOL002459）、甘草黃酮 C（MM0002）等37種成分與PPARG 存在較強的相互作用；6?姜辣素（MOL002467）、異甘草黃酮醇（MOL004949）等24種成分與PTGS2 有較強相互作用。其中，與ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2 對接結果最強的化合物分別為甘草黃酮C（MM0002）、6?姜辣素（MOL002467）、10?姜辣素（MOL002459）和6?姜辣素。通過DrugBank 和文獻等查閱得到作用于ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2 的臨床常用藥分別為己烯雌酚、雷洛昔芬、孟魯斯特和奧沙普嗪。甘草黃酮C（MM0002）、6?姜辣素（MOL002467）、10?姜辣素（MOL002459）和6?姜辣素及臨床常用藥己烯雌酚、雷洛昔芬、孟魯斯特和奧沙普嗪與ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2的對接結果見表3 和圖6。結果顯示，甘草干姜湯中成分與ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2 靶標的對接結果不弱于現(xiàn)有臨床常用藥物的結合作用。

圖6 ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2分子對接模型

表2 甘草干姜湯活性成分與靶點分子對接結果

表3 ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2分子對接結果

4 討論

通過比較甘草干姜湯正離子和負離子2種檢測模式，發(fā)現(xiàn)負離子模式下峰容量和響應強度均優(yōu)于正離子模式［20］，故本研究僅采用負離子模式進行分析，共鑒定得到116個化合物，包括黃酮類、生物堿類、皂苷類等多種成分。進一步通過網絡藥理學方法構建甘草干姜湯“核心成分?靶標?疾病”網絡，根據(jù)degree值篩選得到柚皮素、甘草素、6?姜辣素、光甘草寧、毛蕊異黃酮、姜酮等40種關鍵成分，ESR2、PPARG、PTGS2、ESR1 等36個核心靶標，癌癥通路（Pathways in cancer）、PI3K?Akt 信號通路、神經活性配體?受體相互作用（Neuroactive ligand?receptor interaction）、乙型肝炎（Hepatitis B）等83 條信號通路。分子對接驗證結果顯示，甘草黃酮C（MM0002）、甘草皂苷A3（MM0005）、短葉松素（MM0006）、10?姜辣素（MOL002459）、6?姜辣素（MOL002467）、姜 酮（MOL002516）、異甘草黃酮醇（MOL004949）與核心靶點ESR2、PPARG、PTGS2、ESR1 均具有較強相互作用，顯示了甘草干姜湯多成分?多靶點的特點。分子對接驗證選擇度值較高靶標分別與甘草干姜湯中核心成分及能夠作用于關鍵靶標的臨床常用藥物分別進行分子對接進行比較，結果顯示，甘草干姜湯中活性成分（甘草黃酮C、6?姜辣素、10?姜辣素和6?姜辣素）與ESR1、ESR2、PPARG 和PTGS2的結合能力均強于臨床藥物己烯雌酚、雷洛昔芬、孟魯斯特和奧沙普嗪，提示網絡藥理學預測結果的可靠性。

ESR1 和ESR2 是雌激素受體，雌激素受體在大鼠、小鼠以及人的肺組織中均有表達，且參與肺泡分化及保證肺正常彈性收縮［21］，此外有研究表明雌激素受體可加重膿毒癥大鼠的炎癥反應，對肺組織造成破壞［22］。PPARG 是肺成纖維細胞活化的重要調節(jié)因子，在控制細胞分化中有較強作用，可調節(jié)炎癥和纖維化反應［23］。在慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）發(fā)病過程中，PPARG 表達下調減弱了其抗炎、抗氧化作用，激活了氧化應激反應活性并引起氣道炎癥［24］。而PTGS2 活性的增加則會引起支氣管黏膜水腫，增加氣道炎癥，從而加重患者的氣流阻塞［25］。

李曉紅等［26］研究發(fā)現(xiàn)，甘草皂苷類可通過抑制環(huán)氧合酶?2 的表達而降低前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）合成，從而具有顯著的抗炎作用。有實驗表明異甘草黃酮醇能夠顯著誘導Nrf2 及其反向基因GR、GPX和NQO1，從而具有對百草枯引起的急性肺損傷的抗氧化和解毒作用，減輕肺水腫和纖維化［27］。6?姜辣素（MOL002467）的體外實驗顯示，該成分能夠抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）誘導的人內皮細胞增殖，并導致G1 期細胞周期停滯，并且阻斷血管內皮細胞對VEGF 的反應形成毛細血管樣管，強烈抑制大鼠主動脈內皮細胞的萌發(fā)和小鼠角膜對VEGF 的反應形成新血管，表明6?姜辣素能夠抑制血管生成，可能在腫瘤和其他血管生成依賴性疾病的治療中起作用［28］。在氨基甲酸誘導的肺癌模型中，6?姜辣素也可以作為精氨酸酶抑制劑，對支持腫瘤 的巨噬細 胞有重編程作用［29］。姜 酮（MOL002516）具有抗氧化和抗炎作用，有研究表明，姜酮在體內外均能顯著抑制LPS 誘導的促炎細胞因子的產生，阻斷ERK、p38／MAPK 和IκBα、NF?κB／P65 的磷酸化，減弱絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子kappa B（NF?κB）信號通路，這些結果提示姜酮對LPS 誘導的急性肺損傷具有保護作用［30］。

PI3K?Akt 通路是肺纖維化過程中一個重要的信號調控系統(tǒng)，主要參與細胞的生長、分化、凋亡及血管生成，能通過調控下游中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、缺氧誘導因子?1α（hypoxia inducible factor?1，HIF?1α）及活性氧類（Reactive oxygen species，ROS）系 統(tǒng)等參與肺纖維化［31］，且與NF?κB 信號通路、MAPK 信號通路等關系密切。神經活性配體?受體相互作用通路信號的改變可能引發(fā)肺部癌癥、炎癥性疾病［32］。呼吸系統(tǒng)疾病患者常伴隨有肝損害，如小兒支原體感染性肺炎常合并肝損傷［33］，甘草干姜湯對乙型肝炎通路的作用可能對肝損傷的治療起到一定的治療效果。

綜上，本實驗采用UPLC?Q?TOF／MS 技術，快速、準確地從整體系統(tǒng)闡釋甘草干姜湯中的化學成分，從中鑒定得到116個化合物，以期為其質量標志物的篩選奠定前期基礎。進一步結合分子對接技術對甘草干姜湯治療呼吸系統(tǒng)疾病的化學成分、作用靶點、代謝通路方面進行研究，初步探討了甘草干姜湯治療呼吸系統(tǒng)疾病的作用機制，為今后對甘草干姜湯進一步開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。