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        慈菇消脂丸含藥血清對HepG2細胞脂性凋亡的影響

        2021-08-23 03:31:44毛舒婷尹碩霍瑞琦馬燕花
        中成藥 2021年8期
        關(guān)鍵詞:血清

        毛舒婷尹 碩霍瑞琦馬燕花

        (甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州730000)

        流行病學(xué)調(diào)查顯示,近20年來,伴隨肥胖流行及生活方式改變,世界范圍內(nèi)非酒精性脂肪性肝病(Non?Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)的平均患病率已為24%。亞洲地區(qū)NAFLD 總患病率也呈明顯上升趨勢,高達27.4%[1]。NAFLD 發(fā)生及發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果,其中脂毒性引起的肝細胞損傷對非酒精性脂肪性肝炎(Non?Alcoholic Steatohepatitis,NASH)進展發(fā)揮重要作用,這種凋亡類型也稱為脂性凋亡[2?3]。脂肪酸可上調(diào)細胞死亡受體,NASH 患者死亡受體Fas 的表達較單純性脂肪變性患者更明顯。Fas 表達上調(diào)可激活外源性肝細胞凋亡通路[4]。過多脂肪酸堆積也可導(dǎo)致線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活c?Jun 氨基末端激酶(c?Jun N?terminal Kinase,JNK)信號通路,啟動內(nèi)源性凋亡途徑[5],脂性凋亡與相關(guān)因素共同作用引起肝細胞壞死。當(dāng)細胞發(fā)生損傷時,肝細胞內(nèi)豐富的酶蛋白釋放,如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨 酶(Aspartate Transaminase,AST)。也有學(xué)者提出ALT 和AST 升高是細胞內(nèi)脂肪酸氧化產(chǎn)物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的作用[6],因此超氧 化物歧化 酶(Superoxide Dismutase,SOD)抗氧化作用也至關(guān)重要[7]。單純性脂肪變性在肝細胞損傷與免疫因素交互作用下發(fā)展為NASH[8],最終進展為臨床終末期肝病如肝硬化及肝癌。

        2016年第28 屆脾胃病學(xué)術(shù)年會中,中華中醫(yī)藥學(xué)會就NAFLD 中醫(yī)診療達成專家共識意見,提出NAFLD 辨證分型為濕濁內(nèi)停,肝郁脾虛等證型,主要病機為肝體用失調(diào),濕濁痰瘀內(nèi)生[9]。課題組自擬處方慈菇消脂丸以山慈菇為君藥,用以清熱解毒、消癰散結(jié),配伍法半夏化痰祛濕,茯苓、薏苡仁健脾滲濕,柴胡疏肝解郁,丹參活血化瘀,土鱉蟲散結(jié)消癥,加用黃芩清熱解毒,澤瀉利水滲濕,佐以枸杞、生首烏、決明子補益肝腎以固本,生山楂健脾兼消瘀,合用炙甘草調(diào)和諸藥,同時顧護中焦脾胃。諸藥合用,共奏解毒化痰、消降濁脂之功效。本實驗用慈菇消脂丸含藥學(xué)清干預(yù)HepG2細胞脂肪變性模型,通過免疫熒光技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase?8、Fas?L、p?JNK 表達,ELISA 技術(shù)檢測SOD、MDA、ALT、AST 水平,并結(jié)合電鏡觀察細胞微觀形態(tài)學(xué)變化,以期為慈菇消脂丸改善脂性凋亡提供細胞形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)證據(jù)。

        1 材料

        1.1 細胞 HepG2(貨號HYC3112)購自上海和元生物技術(shù)股份有限公司。

        1.2 動物 8 周齡SPF 級雄性健康SD 大鼠50 只,體質(zhì)量180~220 g,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2015?0002。飼養(yǎng)室溫度控制在20~22 ℃,相對濕度50%~60%,12 h/12 h 明暗交替照明。本實驗遵循甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心實驗動物使用管理規(guī)定,并通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(編號2015?036)。

        1.3 藥物 慈菇消脂丸組方由山慈菇、法半夏、茯苓、柴胡、丹參、土鱉蟲、薏苡仁、黃芩、澤瀉、枸杞、生山楂、生首烏、決明子、炙甘草各味中藥材組成,藥材均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心,委托甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心王曉莉主任藥師鑒定為正品。油酸(OA,貨號O1008)、棕桐酸(PA,貨號P0500)、JNK 抑制劑(SP600125,貨號S5567)、二甲基亞砜(DMSO,貨號D2650)、4′,6?二脒基?2?苯基吲哚(DAPI,貨號DUO82040)均購自美國Sigma 公司;人天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST,貨號C010?2)、谷丙轉(zhuǎn)氨 酶(ALT,貨號C009?2)、超氧化物歧化酶(SOD,貨號A001?3)、丙二醛(MDA,貨號A003?1)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;p?JNK 抗體(批號ab47337)、caspase?8 抗體(批號ab25901)、Fas?L 抗體(批號ab15285)均購自英國Abcam 公司;FITC 標記山羊抗兔IgG(批號A0562)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;油紅O 工作液(貨號G1262)購自北京索萊寶科技有限公司。

        1.4 儀器 熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss 公司);微孔板分光光度計(美國Bio?Rad 公司);透射電鏡(HS500,日本日立公司)。

        2 方法

        2.1 含藥血清制備 煎鍋中混勻各味中藥材,加8 倍量自來水浸泡5 h,電磁爐加熱煮沸,開始用強火,沸騰后文火保持微沸40 min,紗布濾出藥液,藥渣繼續(xù)加藥物干重6倍量自來水煮沸重復(fù)上述操作。合并2 次所得到濾液放置過夜,棄去沉淀,電磁爐上中火根據(jù)比例濃縮至適量,濃縮后的藥液裝在滅菌容器中,最終制備的慈菇消脂丸藥液濃度為0.225 g/mL,于?4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。SD 大鼠隨機分為慈菇消脂丸含藥血清組(20 只)和空白組(10只)。給藥劑量=臨床常用量×動物等效面積系數(shù)×5。慈菇消脂丸含藥血清組給予慈菇消脂丸藥液(2 mL/100 g)灌胃,空白組給予等劑量生理鹽水,2 次/d,早晚各1 次,持續(xù)1 周,末次給藥1 h 后心臟取全血。全血于4 ℃靜置2 h,低溫離心機3 500 r/min 離心15 min,分離血清。分離的血清同組混合,經(jīng)56 ℃水浴滅活30 min,超凈臺上用0.22 μm 微孔濾膜過濾,配制慈菇消脂丸含藥血清低劑量(2%含藥血清)和慈菇消脂丸含藥血清高劑量(6%含藥血清)培養(yǎng)液各10 mL,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2 HepG2細胞培養(yǎng) 用含10% 胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)液,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細胞。細胞生長至80 %時制備細胞懸液,用細胞計數(shù)板在細胞計數(shù)儀下計數(shù),調(diào)整細胞濃度為1×105/ mL,接種至24 孔培養(yǎng)板,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        2.3 分組細胞于24 孔培養(yǎng)板貼壁生長至80%左右,隨機分為空白對照組;模型組,添加油酸?棕櫚酸(2∶1)配制的濃度為500 μmol/L 游離脂肪酸(Free Fatty Acid,F(xiàn)FA)培養(yǎng)液;慈菇消脂丸含藥血清組,添加500 μmol/L FFA 和不同濃度的慈菇消脂丸含藥血清;JNK 抑制劑組,以20 μmol/L SP600125(JNK 抑制劑)預(yù)先干預(yù)1 h,再加500 μmol/L FFA 培養(yǎng)液。24 h 后收集細胞培養(yǎng)液檢測SOD、MDA、ALT、AST,并做細胞免疫熒光化學(xué)染色和電鏡觀察。

        2.4 電鏡觀察細胞內(nèi)脂滴 待24 孔板細胞生長至80%左右,分組誘導(dǎo)干預(yù)24 h,細胞刮刮下細胞,收集于離心管中,1 000 r/min,離心5 min,棄上清,彈指法混勻細胞。沿管壁加入2.5%電鏡用冷戊二醛500 μL 固定,切勿吹懸,置于室溫1 h,4 ℃冰箱3 h 后,去除戊二醛加滿PBS 送檢。

        2.5 檢測各組細胞培養(yǎng)液中SOD、MDA、ALT、AST 水平 用收集到的細胞培養(yǎng)上清液,按照試劑盒說明書,ELISA 法檢測ALT、AST,黃嘌呤氧化酶法測定SOD,硫代巴比妥酸法測定MDA。

        2.6 免疫熒光 染色檢測caspase?8、Fas?L、p?JNK 的 表達 將分組干預(yù)后生長狀態(tài)良好的HepG2細胞接種于細胞爬片上,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,將爬片置于4%多聚甲醛中固定30 min,0.5% PBST 緩沖液室溫孵育20 min,0.05% PBST 洗3 次,5 min/次,滴加5% BSA 封閉液置于室溫下20 min,甩去多余液體,滴加一抗50 μL(1∶200),37 ℃孵育1 h,4 ℃過夜。次日,0.05% PBST洗3 次,5 min/次,滴加Alexa Flour 488 標記的山羊抗兔二抗40~50 μL(1∶400),37 ℃孵育1 h,用0.05% PBST 洗3 次,5 min/次,滴入1 滴DAPI 染液(藍色)染色15 min使細胞核著色,PBS 清洗3 次,熒光顯微鏡下觀察拍照。

        2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22 統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)以()表示,W 檢驗和矩法檢驗判斷正態(tài)分布性,Levene 檢驗判斷方差齊性,組間采用 單因素方差分析(one?way ANOVA),多重比較采用最小二乘法(LSD 檢驗),以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 電鏡下細胞微觀結(jié)構(gòu) 空白對照組HepG2細胞大小均一,核型如常,核漿比例正常,核仁清晰,胞漿內(nèi)未見到脂滴。FFA 刺激后細胞胞漿內(nèi)可見大量的大小不一的卵圓形或圓形脂滴沉積,并可見細胞核受擠壓而變形,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器受損,并且清晰可見許多含有內(nèi)容物的自噬小體,偶見凋亡體。慈菇消脂丸含藥血清組細胞內(nèi)脂滴、自噬小體均減少,其中高劑量藥物血清組脂滴、自噬小體減少更明顯。JNK 抑制劑組細胞內(nèi)脂滴亦減少,自噬小體明顯減少。見圖1。

        圖1 各組電鏡下細胞微觀結(jié)構(gòu)(×10 000)

        3.2 細胞培養(yǎng)液中SOD、MDA、ALT、AST 水平 與空白對照組比較,模型組SOD 水平降低,MDA、ALT、AST 水平增高(P<0.05);與模型組比較,慈菇消脂丸含藥血清各劑量組及JNK 抑制劑組SOD 水平升高,MDA、ALT、AST 水平降低(P<0.05);與JNK 抑制劑組比較,慈菇消脂丸含藥血清組SOD 水平升高(P<0.05)。見表1。

        表1 各組細胞培養(yǎng)液酶學(xué)指標(, n=10)

        表1 各組細胞培養(yǎng)液酶學(xué)指標(, n=10)

        注:與空白對照組比較,※P<0.05,※※P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與JNK 抑制劑組比較,▲▲P<0.01。

        3.3 細胞膜及胞漿內(nèi)caspase?8、Fas?L、p?JNK 表 達caspase?8分布在細胞的胞質(zhì)和細胞核中。與空白對照組比較,模型組caspase?8 表達增高(P<0.01),慈菇消脂丸含藥血清組caspase?8 表達較模型組降低(P<0.01),但沒有恢復(fù)到正常組水平,見圖2。Fas?L 蛋白主要分布于細胞膜、胞漿和細胞核。與空白對照組比較,單純經(jīng)游離脂肪酸處理后Fas?L 表達增加(P<0.01),慈菇消脂丸含藥血清組Fas?L 表達較模型組下降(P<0.01),且較JNK 抑制劑組降低更明顯(P<0.01),見圖3。p?JNK 主要分布在胞漿,也分布于細胞。p?JNK 在正常對照組中表達很低,在模型組表達量增高(P<0.01),JNK 抑制劑組較模型組明顯降低(P<0.01),中藥各劑量組較模型組沒有明顯變化,見圖4。各組蛋白的表達量如表2 所示。

        圖3 Fas?L 熒光染色(×200, 綠色熒光為Fas?L 蛋白,藍色熒光為細胞核)

        圖4 p?JNK 熒光染色(×200, 綠色熒光為p?JNK 蛋白,藍色熒光為細胞核)

        表2 各組細胞中caspase?8, FasL, p?JNK 表達(, n=10)

        表2 各組細胞中caspase?8, FasL, p?JNK 表達(, n=10)

        注:與空白對照組相比,※※P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與JNK 抑制劑組比較,▲▲P<0.01。

        圖2 caspase?8 熒光染色(×200, 綠色熒光為caspase?8 蛋白, 藍色熒光為細胞核)

        4 討論

        盡管大多數(shù)NAFLD 患者僅表現(xiàn)為單純性脂肪變性,但近1/3 患者會進展為NASH,這種壞死性炎癥性疾病增加了患者患肝纖維化、肝硬化、肝癌的危險因素[10]。雖然NAFLD 發(fā)病重在預(yù)防,對于已經(jīng)患有單純性脂肪變性的患者來說,為防治其進展為NASH,研究游離脂肪酸堆積引起的肝細胞損傷至關(guān)重要。

        當(dāng)大量脂肪酸涌入肝細胞,超過細胞自身降解脂肪酸能力,會堆積引起脂毒性,進而導(dǎo)致反應(yīng)氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)產(chǎn)生,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肝細胞功能障礙[11]。ROS 中的超氧自由基(O2-)在SOD 作用下才能正常降解[12]。所以SOD 是細胞內(nèi)重要的抗氧化物。但當(dāng)ROS 產(chǎn)生超過細胞正??寡趸瘷C制時,會導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激在NASH 始動階段發(fā)揮重要作用。堆積的脂質(zhì)進一步發(fā)生β?氧化和ω?氧化,多不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)生的毒性物質(zhì)包括MDA 和羥基壬烯酸(Hydroxynonenal,HNE),也可促進細胞凋亡[13]。所以MDA 增多是肝細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化的標志。脂肪酸還可上調(diào)位于肝細胞膜上的死亡受體Fas、腫瘤壞死因 子(Tumor Necrosis Factor,TNF)和TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF Related Apoptosis Inducing Ligand,TRAIL)。Fas 可與Fas?L 結(jié)合,通過肝細胞內(nèi)反應(yīng)蛋白Fas 相關(guān)死亡域蛋白(Fas?Associated Protein with Death Domain,F(xiàn)ADD)[14]激活caspase?8[15],caspase?8執(zhí)行細胞凋亡命令,這一過程稱為外源性細胞凋亡通路。所以在肝細胞發(fā)生損傷時,F(xiàn)as 和caspase?8 表達都會上調(diào)。脂肪酸堆積也可導(dǎo)致線粒體障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,感受態(tài)JNK 被激活,磷酸化c?Jun 調(diào)控內(nèi)源性相關(guān)凋亡基因表達,如c?Jun 會上調(diào)Bax 和Bak 表達[16],導(dǎo)致線粒體通透性增加,細胞色素?c 釋放入細胞質(zhì),與凋亡酶激活因子(Apoptotic Protease Activating Factor?1,APAF?1)和caspase?9 形成凋亡體。因此,p?JNK 表達上調(diào)是內(nèi)源性細胞凋亡通路激活的重要標志。凋亡作為一種程序性細胞死亡形式,產(chǎn)生的凋亡小體在沒有吞噬細胞存在時,內(nèi)容物會釋放入細胞外液,所以本實驗中代表肝細胞膜損傷的酶蛋白AST和ALT 水平也會上升。然而,AST 也大量存在于腦、胰腺、心臟、骨骼肌等組織中,這些組織損傷后也會導(dǎo)致血液中AST 水平上升,因此在實際臨床應(yīng)用中AST 并不能作為肝組織損傷的特征性標志。相反,ALT 主要存在于肝臟中,其水平在血液中的升高是肝組織損傷的直接證據(jù)。

        本細胞水平的實驗研究將血清藥理學(xué)研究方法和細胞生物學(xué)實驗技術(shù)相結(jié)合,旨在證明內(nèi)外源性凋亡通路在NAFLD細胞模型中的作用,闡明慈菇消脂丸治療NAFLD機制。本實驗中,模型組中凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)caspase?8,F(xiàn)as?L,p?JNK 表達顯著上調(diào)及肝細胞酶學(xué)指標ALT、AST分泌增加為肝細胞損傷提供了佐證;脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA增加及抗氧化產(chǎn)物SOD 降低為細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化提供了佐證。不同濃度中藥劑量組中上述相關(guān)指標均有不同程度減輕,證實慈菇消脂丸可以抑制脂毒性引起的肝細胞凋亡。之前的實驗證明慈菇消脂丸可通過調(diào)控JNK?Jun 內(nèi)源性凋亡通路抑制肝細胞凋亡,通過本實驗,可發(fā)現(xiàn)其對外源性凋亡通路FasL?Fas 也會產(chǎn)生影響。因兩條凋亡通路最終發(fā)生交聯(lián),對于慈菇消脂丸是通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡通路進一步調(diào)節(jié)外源性凋亡通路,還是直接影響外源性凋亡通路有待進一步研究。自噬小體是細胞在極端環(huán)境下的一種保護性機制,通過電鏡觀察到模型組細胞中自噬小體含量明顯較藥物干預(yù)組多,說明藥物在抑制細胞凋亡同時也抑制了細胞自噬。JNK 可以感知細胞內(nèi)外環(huán)境的變化,肝細胞中

        主要有JNK1 和JNK2 兩種亞型,查閱文獻發(fā)現(xiàn)JNK1 主要通過影響B(tài)eclin1 表達促進自噬[15]。進一步說明游離脂肪酸可通過JNK2 促進肝細胞凋亡,而游離脂肪酸是否通過JNK1 通路誘導(dǎo)肝細胞自噬則需更充分的實驗研究證實。

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