郜靚 梁丹妮 楊紅霞肖遠燦魏立新杜玉枝*

（1.中國科學院西北高原生物研究所，青海省藏藥藥理學與安全性評價研究重點實驗室，青海 西寧810008； 2.中國科學院藏藥重點實驗室，青海 西寧810008； 3.中國科學院大學，北京100049）

骨質疏松癥是由于雌激素不足、增齡衰老、內分泌功能紊亂等多種病因導致的以骨量丟失、結構改變、生物力學性能減退、易發(fā)生骨折為特點的全身性骨代謝疾病，影響了全世界大多數老年人的生活。近幾年流行病學調查結果顯示，我國約有老齡人口1.3 億，而骨質疏松癥患者就達8 400 萬，預計到2050年老齡人口將達到2.5 億，其中25%～70%可能患有該疾?。?］。全球每年因骨質疏松引起的骨折約有900 萬例［2］，目前已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為十大最嚴重疾病之一［3］。本實驗采用維甲酸制備骨質疏松癥模型，它是繼發(fā)性骨質疏松癥最常見的病因之一［4］，模型大鼠在發(fā)病癥狀、組織學表現、對雌激素的反應方面與人類有較高的相似性［5］。

牦牛主要分布于喜馬拉雅山脈和青藏高原，藏醫(yī)常用其骨、髓入藥，《四部醫(yī)典》 中有用骨汁藥浴和三味骨精湯治療各種骨質增生、骨質疏松、骨性關節(jié)病等骨疾病的記載［6］。已有研究表明，牦牛骨粉不僅可顯著增加骨密度，而且與相應劑量的碳酸鈣比較具有較高的鈣表觀吸收率［7?8］，并且含有大量K、Na、Ca、Mg、Mn、Fe、Zn 等人體必需元素［9］，鈣磷比例為2∶1，可作為良好的補鈣劑［10］。因此，本實驗考察復方牦牛骨粉對維甲酸誘導骨質疏松癥的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 8～10 周齡的SPF 級SD 大鼠72 只，體質量（200±20）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK（甘）2015?0002。動物實驗操作過程依照中國科學院西北高原生物研究所動物實驗倫理委員會的要求執(zhí)行。

1.2 試劑與藥物 維甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水合氯醛（天津市大茂化學試劑廠）。朗迪碳酸鈣D3片（Ⅱ）（北京振東康遠制藥有限公司，批號20181074）；復方牦牛骨粉（牦牛骨粉、脫脂牦牛骨髓、牦牛皮膠、牦牛奶粉按12∶1∶4∶3 比例混合均勻，添加50 mL 純水，水浴37 ℃ 加熱攪拌至完全溶解，專利號ZL201610061603.1）。Co60輻照鈣缺乏繁殖型純化鼠飼料（北京華博德億生物技術有限公司）。大鼠BGP、TRAP 酶聯免疫檢測試劑盒，血清ALP、Ca2＋、P 生化檢測試劑盒（江萊生物科技有限公司）。

1.3 儀器 直接數字化雙能X 線骨密度檢測儀（美國GE Healthcare 公司）；多排定量小型動物CT、多功能酶標儀（美國PerkinElmer 公司）；臺式高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 72 只大鼠按體質量隨機分為6組，即空白組、模型組、陽性對照組（碳酸鈣D3片）及復方牦牛骨粉低、中、高劑量組，除空白組外，其余各組大鼠連續(xù)灌胃給予維甲酸（70 mg／kg）14 d［11］。模型成立后，空白組、模型組大鼠以純水灌胃（0.1 mL／10 g），其余各組大鼠分別灌胃給予陽性藥碳酸鈣D3片（74.74 mg／kg，臨床等效劑量）［12］、低劑量復方牦牛骨粉（4.67 mg／kg，臨床等效劑量的1／16）、中劑量復方牦牛骨粉（18.69 mg／kg，臨床等效劑量的1／4）、高劑量復方牦牛骨粉（37.37 mg／kg，臨床等效劑量的1／2），每天1 次，連續(xù)4 周。

1.4.2 體質量測定 每周稱定大鼠體質量，并根據體其變化調整給藥量。于造模前后及給藥4 周后3個時間點，對大鼠體質量進行增長率比較。

1.4.3 骨密度（BMD）測定 給藥4 周后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，采用雙能X 射線骨密度儀進行全身掃描，檢測股骨、脊椎、全身骨密度。

1.4.4 血液指標檢測 于造模前后及給藥4 周后大鼠眼球采血，采用試劑盒對血清鈣（Ca2＋）、磷（P）、骨鈣素（BGP）水平及堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸性磷酸酶（TRAP）活性，分析其變化趨勢。

1.4.5 Micro?CT 掃描 給藥4 周后，取大鼠右側股骨及腰椎L1?L4段，除去筋膜，4% 多聚甲醛固定，將大鼠股骨及腰椎標本固定在Micro?CT 動物床上，上下掃描200 層，掃描電壓90 kV，電流88 μA，視野36 mm。采用Caliper Analyze 軟件，對大鼠股骨及腰椎組織體積（TV）、骨體積分數（BV／TV）、骨表面積組織體積比（BS／TV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）進行分析。

1.5 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，數據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析或非參數檢驗，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體質量增長率 與造模前比較，空白對照組大鼠體質量增長幅度最顯著，其余各組基本相同；給藥4 周后，模型組大鼠體質量增長幅度最小，而各給藥組均有所增加，其中復方牦牛骨粉組其漲幅與給藥劑量成正比。見圖1。

圖1 各組大鼠體質量變化Fig.1 Weight changes of rats in various groups

2.2 BMD 與空白組比較，模型組大鼠股骨、脊椎及全身BMD 降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和各給藥組大鼠股骨、脊椎及全身BMD 升高，而且除復方牦牛骨粉低劑量組外，其余各組均升高（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠BMD（， n＝12）Tab.1 BMDs of rats in various groups（， n＝12）

表1 各組大鼠BMD（， n＝12）Tab.1 BMDs of rats in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 血液指標 與空白組比較，模型組大鼠血清Ca2＋、ALP、BGP、TRAP 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），血清P 水平無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，陽性對照組、各給藥組大鼠血清ALP水平降低（P＜0.01），復方牦牛骨粉中、高劑量組大鼠血清Ca2＋水平降低（P＜0.05，P＜0.01），P、TRAP 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），見表2、圖2。

圖2 各組大鼠血液指標變化（， n＝12）Fig.2 Changes of blood indices in rats in various groups（， n＝12）

表2 各組大鼠血液指標（， n＝12）Tab.2 Blood indices in rats in various groups（， n＝12）

表2 各組大鼠血液指標（， n＝12）Tab.2 Blood indices in rats in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 Micro?CT 與其他各組比較，模型組TV 更低，BV／TV 無明顯變化（P＞0.05）；BS／TV 高于空白組及復方牦牛骨粉中、高劑量組（P＜0.05，P＜0.01）；除陽性對照組外，模型組Tb.N 與其他各組比較無明顯變化（P＞0.05）；模型組Tb.Sp高于空白組及復方牦牛骨粉低劑量組（P＜0.05），Tb.Th 低于空白組及復方牦牛骨粉中、高劑量組（P＜0.05，P＜0.01），見圖3、表3。

圖3 各組大鼠股骨Micro?CT圖Fig.3 Micro?CT images for the femurs of rats in various groups

表3 各組大鼠股骨CT 參數（， n＝12）Tab.3 CT parameters of the femurs of rats in various groups（， n＝12）

表3 各組大鼠股骨CT 參數（， n＝12）Tab.3 CT parameters of the femurs of rats in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

除復方牦牛骨粉低劑量組外，模型組TV 與其他各組比較無明顯變化（P＞0.05）；模型組BV／TV 低于空白組及復方牦牛骨粉中、高劑量組（P＜0.05）；除復方牦牛骨粉低劑量組外，模型組BS／TV 高于其他各組（P＜0.01）；模型組Tb.N 小于復方牦牛骨粉低劑量組（P＜0.05）；各組Tb.Th、Tb.Sp 無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖4、表4。

圖4 各組大鼠腰椎Micro?CT圖Fig.4 Micro?CT images for the lumbar spines of rats in various groups

表4 給藥干預后各組大鼠腰椎CT 參數（， n＝12）Tab.4 CT parameters of the lumbar spine of rats in various groups after drug intervention（， n＝12）

表4 給藥干預后各組大鼠腰椎CT 參數（， n＝12）Tab.4 CT parameters of the lumbar spine of rats in various groups after drug intervention（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

骨質疏松癥的定義為“以骨量減少、骨顯微結構退化為特征，導致骨強度降低而易發(fā)生骨折的全身性骨代謝疾病［13］。”因此，任何能夠防治骨質疏松癥的藥物必須是能阻止骨量減少，改善骨顯微結構退化和保持骨代謝平衡的藥物。骨量、骨代謝生化標志物和骨顯微結構的變化因此成為檢測骨質疏松癥治療或預防藥物的實驗指標。而骨密度作為診斷骨質疏松和骨折危險程度的重要指標，目前被認為是反映骨質疏松的黃金標準［14］，也是判斷藥物是否有效的關鍵指標，其檢測結果目前已被廣泛應用于臨床治療及動物實驗的研究中。

牦牛骨含有多種人體必需元素以及多糖、氨基酸、磷蛋白、軟骨素和骨膠原等營養(yǎng)成分，既可直接服用也可以作為補充鈣源的添加劑使用，而且牦牛骨中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例接近1∶1，與膳食營養(yǎng)素參考攝入量（DRIs）推薦人體攝入脂肪酸的組成比例相符［15］，其促進骨骼發(fā)育和骨傷愈合的成分含量遠高于一般食草動物的骨骼［16］。

本實驗中，血清骨代謝指標的檢測結果顯示，維甲酸誘導提高了血清中ALP 的活性，增加了血清Ca2＋、BGP 含量，證實維甲酸誘導后骨轉化增強，與相關的研究相符［17?19］，也證明本研究中大鼠高轉換型骨質疏松模型造模成功。但給藥組TRAP 活性高于模型組，可能提示復方牦牛骨粉對維甲酸誘導的骨質疏松大鼠骨吸收無明顯抑制作用［20］。在給予不同劑量的復方牦牛骨粉后血清中ALP 活性和BGP 的含量有所下降，同時隨給藥劑量的增加，血清中的Ca2＋含量顯著降低，提示骨形成明顯增強［21?22］。

腰椎和股骨是BMD 以及骨微結構常用的檢測部位［23］，骨小梁結構是影響骨強度的關鍵因素［24］。目前有研究表明，BS／TV、BV／TV、Tb.N和Tb.Sp 可能是早期檢測骨小梁結構改變的敏感變量，可預示骨質疏松癥的發(fā)展［25］。也有研究報道BMD 檢測與骨微結構檢測有一定的相關性［26］。本研究中對大鼠股骨及腰椎進行了BMD 以及骨微結構檢測，結果顯示，維甲酸誘導可降低大鼠股骨、脊椎以及全身骨密度，并且會導致大鼠股骨及腰椎不同程度的骨量減少。使用復方牦牛骨粉干預治療后，大鼠BMD 及骨量丟失狀況有明顯的改善，并且隨劑量增高改善程度增強。同時骨量丟失的情況，在給藥后也有所好轉。

綜上所述，本研究表明，復方牦牛骨粉可通過增加骨形成、改善骨代謝的途徑防治維甲酸誘導的高轉換型骨質疏松癥。但是對于復方牦牛骨粉改善骨質疏松癥的優(yōu)勢尚不明確。本實驗以期為復方牦牛骨粉補鈣機制的進一步研究和產品工藝及復方優(yōu)化提供參考。