胡 揚(yáng)高佳雪綦 崢徐蓓蕾曲中原梁 偉宋 輝孫向明丁振鐸 李文蘭

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150076）

肉蓯蓉作為補(bǔ)益中藥，可補(bǔ)腎虛、壯腎陽、益精血，在我國用藥歷史悠久，臨床常用于治療女子宮寒不孕、男子腎虛陽痿等癥，同時具有保肝護(hù)肝、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤作用，有“沙漠人參”的美譽(yù)［1?2］。中藥藥代動力學(xué)是以遵循中醫(yī)藥理論為前提，對藥物進(jìn)入機(jī)體后的時量?時效關(guān)系及其動態(tài)變化規(guī)律，通過數(shù)學(xué)函數(shù)進(jìn)行定量描述的一門學(xué)科［3］，隨著中藥現(xiàn)代化的不斷推進(jìn)、中醫(yī)藥理論的蓬勃發(fā)展，當(dāng)前中藥藥代動力學(xué)的研究對象已逐漸由傳統(tǒng)的單體成分轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻黠@藥效作用的活性成分群［4?5］，由于中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、整合調(diào)節(jié)的特點(diǎn)［6?7］，這種轉(zhuǎn)變可使得相關(guān)研究更透徹，更具有科學(xué)意義。

近年來，課題組對肉蓯蓉雌激素作用進(jìn)行了大量研究，證實(shí)其有效部位為總苷［8］，并通過構(gòu)建“固有成分?體內(nèi)成分?雌激素活性”譜效研究模型，確定松果菊苷、丁香苷、紅景天苷、毛蕊花糖苷等13種成分是相關(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［9］。為進(jìn)一步揭示上述成分的體內(nèi)過程，本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜?串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（UPLC?MS／MS）對松果菊苷、丁香苷、紅景天苷、毛蕊花糖苷進(jìn)行藥動學(xué)研究，以期將肉蓯蓉深度開發(fā)為植物雌激素5 類新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 肉蓯蓉總苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.5%，以毛蕊花糖苷計(jì)），按照文獻(xiàn)［10］報道的方法自制。綠原酸、紅景天苷、毛蕊花糖苷、松果菊苷、丁香苷對照品（純度＞98%，批號分別為110753?201716、110818?201206、111530?201411、111670?201304、11574?200201）均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純（德國默克公司，批號分別為20170410、20170311）；甲酸為色譜純（河南科銳化工有限公司，批號20160509）；正丁醇為分析純（批號20140210）、乙酸乙酯（批號20150308）為分析純（天津福晨化學(xué)試劑有限公司）；水為純凈水［屈臣氏集團(tuán)（香港）有限公司，批號20171205］。

1.2 儀器 ACQUITY UPLC 色譜儀、Xevo TQD 質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；AR1140 電子分析天平（美國奧豪斯公司）；超聲波清洗器、Neofuge 高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；GENIUS N118LA 氮?dú)獍l(fā)生器（英國Peak 公司）。

1.3 動物 Wistar 雌性大鼠，體質(zhì)量（210±20）g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（黑）2013?001，自由飲水飲食，在室溫（23±2）℃、相對濕度50%～60%下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取松果菊苷、丁香苷、紅景天苷、毛蕊花糖苷對照品適量，50% 乙腈稀釋，即得（質(zhì)量濃度為250 μg／mL）。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取綠原酸對照品適量，50%乙腈稀釋，即得（質(zhì)量濃度為500 ng／mL）。

2.1.3 灌胃液 取肉蓯蓉總苷適量，蒸餾水稀釋至75 mg／mL（含松果菊苷1.346 mg／mL、丁香苷1.195 mg／mL、紅景天苷0.631 mg／mL、毛蕊花糖苷1.487 mg／mL），即得。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜 Waters BEH C18色譜柱（1.7 μm，

2.1 mm×100 mm）；流動相乙腈?水（含0.1%甲酸），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.2 mL／min；柱溫25.4 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；錐孔電 壓50 V；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔氣體積流量50 L／h；霧化氣體積流量650 L／h，溫度350 ℃；源溫度150 ℃。定量離子對、參數(shù)見表2。

表2 各成分定量離子對、參數(shù)Tab.2 Quantitative ion pairs and parameters for various constituents

2.3 分組、給藥及樣品采集 10 只大鼠隨機(jī)分為給藥組、空白組，每組5 只，灌胃給藥，劑量為1.35 g／（kg·d－1）（以肉蓯蓉總苷計(jì)），空白組給予等體積蒸餾水，共6 次，每次間隔12 h，取血前12 h 禁食，自由飲水。于末次給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 眼眶靜脈叢取血約500 μL 至肝素化EP 管中，靜置0.5 h 后12 000 r／min 離心10 min，吸取上層血漿，－20 ℃下保存。同法制備空白血漿。

2.4 血漿樣品預(yù)處理 將“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液稀釋至500 ng／mL，取3 份，每份20 μL，置于EP 管中，40 ℃氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 空白血漿、20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋30 s 混合均勻，加入乙酸乙酯、甲醇、水飽和正丁醇各660 μL，渦旋混合3 min，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，40 ℃氮?dú)獯蹈桑?00 μL 60%甲醇復(fù)溶，渦旋1 min，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。待測成分與綠原酸峰面積之比記為A；取200 μL 空白血漿3 份，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋30 s 混勻，加入乙酸乙酯、甲醇、水飽和正丁醇各660 μL，渦旋混合3 min，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，40 ℃氮?dú)獯蹈?，加?00 ng／mL對照品溶液20 μL，渦旋1 min，40 ℃氮?dú)獯蹈桑?00 μL 60%甲醇復(fù)溶，渦旋1 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。待測成分與綠原酸峰面積之比記為B，以A／B計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表3，可知方法2 中各成分提取回收率均較高，故選擇甲醇沉淀蛋白法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理。

表3 不同預(yù)處理方法下提取回收率（n＝3）Tab.3 Extract recoveries under different pretreatment methods（n＝3）

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 按“2.4”項(xiàng)下最優(yōu)方法制備空白血漿供試品溶液（不加對照品、內(nèi)標(biāo)溶液）、模擬血漿供試品溶液（空白血漿中加入500 ng／mL 對照品、內(nèi)標(biāo)溶液）、給藥60 min 后血漿供試品溶液（加內(nèi)標(biāo)溶液），在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，質(zhì)譜圖見圖1～2，可知正離子模式下丁香苷m／z395.10 峰的保留時間為2.300 min，綠原酸m／z355.10 峰的保留時間為2.471 min；負(fù)離子模式下紅景天苷m／z299.10 峰的保留時間為2.191 min，綠原酸的m／z353.00 峰的保留時間為2.476 min，毛蕊花糖苷m／z623.20 峰的保留時間為3.210 min，松果菊苷m／z785.30 峰的保留時間為2.640 min。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子色譜圖見圖3～4，可知血漿中內(nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物對成分測定無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分質(zhì)譜圖（正離子模式）Fig.1 Mass spectrograms of various constituents（positive ion mode）

圖2 各成分質(zhì)譜圖（負(fù)離子模式）Fig.2 Mass spectrograms of various constituents（negative ion mode）

圖3 各成分MRM 色譜圖（正離子模式）Fig.3 MRM chromatograms of various constituents（positive ion mode）

2.5.2 線性關(guān)系考察 將“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液稀釋至1、10、100、200、500、1 000、2 500 ng／mL，各取20 μL，40 ℃氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 空白血漿、20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，分別制備成質(zhì)量濃度為0.1、1、10、20、50、100、250 ng／mL的溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，平行3 次。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），待測成分、綠原酸峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，以S／N ＝10 時的樣品質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果見表4，可知在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 各成分線性關(guān)系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備0.5、20、200 ng／mL 模擬血漿供試品溶液作為質(zhì)控樣品，平行6 份，每天繪制1 次標(biāo)準(zhǔn)曲線，完成1個批次測定，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度，連續(xù)6 d，結(jié)果見表5。由此可知，各成分日內(nèi)、日間精密度RSD 為1.62%～6.38%，RE 為－6%～19.7%，滿足生物樣品定量分析要求。

表5 各成分精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.5 Results of precision and accuracy tests for various constituents（n＝6）

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率試驗(yàn) 取20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，40 ℃氮?dú)獯蹈?，加?00、20、0.5 ng／mL對照品溶液各200 μL，濾過，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，待測成分、綠原酸峰面積之比計(jì)為Al；取200 μL 空白血漿，加入660 μL 甲醇，渦旋混合3 min 后12 000 r／min 離心10 min，取上清液，40 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?0 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，40 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?個質(zhì)量濃度對照品溶液各200 μL，渦旋1 min，濾過，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，待測成分、綠原酸峰面積之比計(jì)為A2；取3個質(zhì)量濃度對照品溶液各200 μL，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，40 ℃氮?dú)獯蹈?，再加入空白血漿200 μL、甲醇660 μL，渦旋混合3 min，12 000 r／min 離 心10 min，取上清液，40 ℃氮?dú)獯蹈桑?00 μL 60%甲醇復(fù)溶，渦旋1 min，濾過，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，待測成分、綠原酸峰面積之比計(jì)為A3，平行6 次，以A2／A1計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，A3／A2計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表6。由此可知，該方法無明顯基質(zhì)效應(yīng)，提取回收率較高，符合生物樣品分析要求。

表6 各成分基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.6 Results of matrix effect and extraction recovery tests for various constituents（n＝6）

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.5.1 室溫穩(wěn)定性 取“2.5.3”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，室溫下放置6 h，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。

2.5.5.2 冷凍穩(wěn)定性 取“2.5.3”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，－20 ℃下凍存7 d，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。

圖4 各成分MRM 色譜圖（負(fù)離子模式）Fig.4 MRM chromatograms of various constituents（negative ion mode）

2.5.5.3 凍融穩(wěn)定性 取“2.5.3”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，－20 ℃下凍存24 h 后取出，室溫下完全自然解凍，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，再放回－20 ℃下凍存24 h 以上，重復(fù)3 次。

2.5.5.4 結(jié)果分析 上述3種試驗(yàn)平行6 次，結(jié)果見表7。由此可知，不同條件下各成分含量RSD均小于10%，表明樣品穩(wěn)定性良好，但仍應(yīng)盡量減少凍融次數(shù)。

表7 各成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.7 Results of stability tests for various constituents（n＝6）

2.6 藥動學(xué)研究 將“2.3”項(xiàng)下血漿樣品按“2.4”項(xiàng)下最優(yōu)方法處理后，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，通過PK Solver 2.0 軟件的非房室模型繪制血藥濃度?時間曲線，計(jì)算主要藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見圖5、表8。

圖5 各成分血藥濃度?時間曲線Fig.5 Plasma concentration?time curves for various constituents

表8 各成分主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝5）Tab.8 Main pharmacokinetic parameters for various constituents（， n＝5）

表8 各成分主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝5）Tab.8 Main pharmacokinetic parameters for various constituents（， n＝5）

3 討論與結(jié)論

肉蓯蓉雌激素作用是現(xiàn)代藥理研究成果［11?13］，課題組前期發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉總苷中松果菊苷、丁香苷、紅景天苷、毛蕊花糖苷等13種成分是關(guān)鍵物質(zhì)［9］，其中毛蕊花糖苷、松果菊苷是2020年版《中國藥典》 肉蓯蓉含量測定項(xiàng)下指標(biāo)成分［14］。以此為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)選擇松果菊苷、丁香苷、紅景天苷、毛蕊花糖苷進(jìn)行大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究，以期揭示肉蓯蓉雌激素作用活性物質(zhì)在體內(nèi)的動態(tài)變化過程，整體實(shí)驗(yàn)思路與中藥作用特點(diǎn)相契合，對傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論賦予了更現(xiàn)代、更科學(xué)的詮釋，不僅有助于中藥質(zhì)量控制和評價方法的完善，而且對臨床合理用藥、新藥研發(fā)具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC?MS／MS 法檢測松果菊苷、丁香苷、紅景天苷、毛蕊花糖苷血藥濃度，其超低檢測限更符合體內(nèi)樣品含量較低的實(shí)際檢測需求。儀器靈敏度往往也是影響藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素之一［15］，與傳統(tǒng)的HPLC 法相比，UPLC?MS／MS 法優(yōu)勢不僅體現(xiàn)在靈敏、快速、高效、節(jié)約成本，最重要的是數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確，更能真實(shí)反映雌激素活性成分血藥濃度的動態(tài)變化過程。結(jié)果顯示，給藥后各成分在30～90 min 之間均達(dá)到最大血藥濃度，其中丁香苷、松果菊苷下降迅速，半衰期在2 h左右，而毛蕊花糖苷、紅景天苷相對較慢，半衰期在4～5 h，整體表現(xiàn)為吸收、消除速度均較快，以期為肉蓯蓉雌激素作用的深入研究提供依據(jù)。