程 玨 辛鵬飛 程 琳 莊潤(rùn)濤 劉志榮 （北京交通大學(xué)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京100044）

口腔頜面鱗狀細(xì)胞癌（oral cavity squamous cell carcinoma，OSCC），被簡(jiǎn)稱口腔鱗癌，多發(fā)生于40~60 歲中老年人群，是一種最為常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤，占口腔癌的90%［1-2］。世界范圍內(nèi)口腔癌發(fā)病率相對(duì)較高的地域包括巴西、巴基斯坦和法國(guó)等。雖然醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷提高，但統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者五年生存率在過(guò)去的幾十年里并沒(méi)有得到明顯改善［3］。因此，研究口腔癌的治療方法對(duì)于口腔鱗癌的臨床治療具有重要意義。

人TWIST相關(guān)蛋白（twist-related protein，TWIST）最早發(fā)現(xiàn)于果蠅中，主要包括TWIST1 和TWIST2兩種不同蛋白結(jié)構(gòu)［4］。在不同物種之間，TWIST1 是高度保守的，研究發(fā)現(xiàn)TWIST1 異常表達(dá)，與肺癌、胃癌、三陰性乳腺癌、直腸腺癌等發(fā)生有密切關(guān)系，有文獻(xiàn)證實(shí)TWIST1 可能調(diào)節(jié)下游因子的轉(zhuǎn)錄，或者調(diào)節(jié)蛋白的修飾，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖和凋亡等生物學(xué)過(guò)程，但是TWIST1 如何影響口腔頜面鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程以及具體機(jī)制尚不明確。

大量文獻(xiàn)證實(shí)，細(xì)胞自噬在維持細(xì)胞存活、分化和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，最近研究發(fā)現(xiàn)自噬與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、惡性轉(zhuǎn)化均密切相關(guān)［5-6］。參與自噬過(guò)程中的兩個(gè)重要調(diào)控因子分別為Beclin1和LC3。自噬相關(guān)基因Beclin1 是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵基因，也是自噬通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器［7］。同樣，在自噬過(guò)程中還有一個(gè)重要的調(diào)控因子，即微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3），它也是哺乳動(dòng)物中了解最為透徹的一種蛋白［8］。文獻(xiàn)證實(shí) Beclin1 和 LC3 的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，若能有效調(diào)控自噬反應(yīng)，則是治療腫瘤的一種新途徑。

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamy?cin，mTOR）信號(hào)通路是研究最多的一種致癌途徑，該信號(hào)通路的異常激活與許多癌癥的發(fā)生有關(guān)［9］。目前研究顯示，mTOR 信號(hào)通路的過(guò)度激活與肺癌、膀胱癌、食道癌等的發(fā)生相關(guān)，但是關(guān)于TWIST1 是否可以通過(guò)mTOR 信號(hào)通路對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡發(fā)揮調(diào)控作用的研究少有報(bào)道［10-11］。因此，本研究探討TWIST1對(duì)口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及其可能的調(diào)控機(jī)制，為口腔鱗癌的發(fā)病和治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；CCK-8 試劑購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；TWIST1 shRNA、陰性對(duì)照序列購(gòu)自漢恒生物科技（上海）有限公司；Edu、TUNEL 染色試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Beclin1 和LC3 ELISA 試劑盒購(gòu)自上海邦奕商貿(mào)有限公司；SYBR Primer Ex Taq 熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó) TaKaRa 公司；TWIST1、U6 引物購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；p-mTOR（#2971）、p-P70S6K（#9204）、GAPDH（#5174）和兔抗二抗（#14708）購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.1.2 儀器 超純水系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek 公司；CO2培養(yǎng)箱、低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；熒光定量PCR 儀、電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；電子天平購(gòu)自北京海天友誠(chéng)科技有限公司；高溫滅菌鍋購(gòu)自上海吉盛醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.1.3 細(xì)胞 人口腔鱗癌細(xì)胞系（Tca8113）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，完全培養(yǎng)基為1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 Tca8113 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Tca8113 細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基內(nèi)，2~3 d 后傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以 1×106個(gè)/ml 密度接種于 6 孔板內(nèi)，利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將sh-TWIST1 和陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染至Tca8113 細(xì)胞，以只加入Lipo?fectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑的Tca8113 細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.2 QRT-PCR 法檢測(cè)Tca8113 細(xì)胞中TWIST1 mRNA 水平 收集3組Tca8113細(xì)胞，向含有細(xì)胞沉淀的EP 管內(nèi)加入Trizol，將細(xì)胞裂解。根據(jù)第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，向管內(nèi)加入上、下游引物，以 U6 作為內(nèi)標(biāo)，用 2?ΔΔCt計(jì)算TWIST1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 CCK-8 法測(cè)定Tca8113 細(xì)胞存活率 以5×103個(gè)/孔密度接種于 96 板，在 3 組細(xì)胞培養(yǎng) 24 h、48 h 后，重復(fù)3 孔，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，孵育4 h后，在490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光度（A）。細(xì)胞活力百分比（%）=（A樣品?A空白）/（A標(biāo)準(zhǔn)品?A空白）×100%。

1.2.4 Edu 法測(cè)定Tca8113 細(xì)胞增殖能力 使用4%多聚甲醛固定各組細(xì)胞，加入0.3%Triton X-100溶液透化15 min，加入100 μl× Click-iT EdU 染色液至每個(gè)孔，簡(jiǎn)短搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)物可以均勻覆蓋細(xì)胞，避光孵育30 min，除去洗滌液，在顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞數(shù)目。

表1 TWIST1和U6引物序列信息Tab.1 TWIST1 and U6 primer sequence information

1.2.5 TUNEL 染色法檢測(cè)Tca8113 細(xì)胞凋亡情況 將細(xì)胞涂片浸入4%多聚甲醛固定液的染缸中，室溫固定 20 min，用 PBS 清洗 3 次，每次 5 min。每孔內(nèi)滴加100μl Proteinase K工作液，反應(yīng)15 min，再滴加 100 μl DNaseⅠ Buffer，處理 30 min，滴加50 μl TdT 反應(yīng)液，避光孵育60 min，再加入DAPI 染色液復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光10 min。在熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)Tca8113細(xì)胞中Beclin1、LC3、p-mTOR和p-P70S6K蛋白表達(dá)水平 收集3組細(xì)胞，加入蛋白裂解液將細(xì)胞冰上裂解，收集蛋白上清液。加入5 倍SDS 上樣緩沖液，煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%BSA 液封閉 1.5 h，洗膜，加入 Beclin1、LC3、p-mTOR 和 p-P70S6K一抗，4℃孵育過(guò)夜，加入二抗，孵育1 h。向PVDF膜滴加發(fā)光液，分析條帶光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以表示，并用Prism 6.0 軟件作圖，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TWIST1 在 sh-TWIST1 組表達(dá) 下 降 qRT-PCR和Western blot 的結(jié)果如圖1A、B 所示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，TWIST1 mRNA 和蛋白在sh-TWIST1 組Tca8113 細(xì)胞中的表達(dá)水平下降（P<0.05），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組無(wú)差異。

圖1 TWIST1 mRNA的表達(dá)水平Fig.1 Expression of TWIST1 mRNA

2.2 TWIST1 沉默后提高Tca8113 細(xì)胞的活力 CCK-8 法檢測(cè)了 TWIST1 對(duì) Tca8113 細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，24 h、48 h 后 sh-TWIST1 組的 Tca8113 細(xì)胞活力均明顯升高（P<0.05），且空白對(duì)照組與陰性組無(wú)差異（圖2）。

圖2 Tca8113細(xì)胞活力的比較Fig.2 Comparison of cell viability in Tca8113 cells

2.3 TWIST1 沉默后提高Tca8113 細(xì)胞的增殖能力 Edu 染色結(jié)果如圖3A 所示，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組和陰性序列對(duì)照組相比，sh-TWIST1組的Tca8113細(xì)胞增殖能力明顯提高（P<0.05），且空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組無(wú)差異（圖3B）。

圖3 Tca8113細(xì)胞增殖能力的比較（×20）Fig.3 Comparison of cell proliferation ability of Tca8113 cells（×20）

2.4 TWIST1 沉默后抑制Tca8113 細(xì)胞的凋亡 TUNEL 染色結(jié)果如圖4A 所示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，sh-TWIST1組的Tca8113細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯降低（P<0.05），且空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組無(wú)差異（圖4B）。

圖4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況（×20）Fig.4 Apoptotic rate was detected by TUNEL staining（×20）

2.5 TWIST1 沉默后 Tca8113 細(xì)胞中 Beclin1 和 LC3水平變化情況 Western blot 結(jié)果如圖5A、B 所示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，sh-TWIST1 組的Tca8113 細(xì)胞中 Beclin1 水平下降（P<0.05），LC3 水平明顯提高（P<0.05），且空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組無(wú)差異。

圖5 Beclin1和LC3表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of Beclin1 and LC3

2.6 TWIST1 沉默后促進(jìn)Tca8113 細(xì)胞中p-mTOR和p-P70S6K 蛋白的表達(dá) Western blot 結(jié)果如圖6A所示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，sh-TWIST1組的 Tca8113 細(xì)胞中 p-mTOR 和 p-P70S6K 蛋白水平升高（P<0.05），給予 mTOR 信 號(hào)通路 激 動(dòng)劑（MHY1485、MCE、HY-B0795）后，Tca8113 細(xì)胞中p-mTOR 和p-P70S6K 蛋白水平升高更為顯著（P<0.05），且空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組無(wú)差異（圖6B）。

圖6 p-mTOR和p-P70S6K蛋白表達(dá)情況Fig.6 Expressions of p-mTOR and p-P70S6K proteins

3 討論

鱗狀細(xì)胞癌多發(fā)生在鱗狀上皮覆蓋的部位，如皮膚、口腔和食管等?？谇击[癌占口腔頜面部惡性腫瘤90%以上，世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)在未來(lái)十幾年口腔鱗癌的發(fā)病率會(huì)持續(xù)上升，已然成為世界公共衛(wèi)生問(wèn)題［12］。盡管手術(shù)方式在臨床上已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但對(duì)于晚期失去手術(shù)機(jī)會(huì)的口腔鱗癌患者來(lái)說(shuō)，目前尚無(wú)安全有效的治療藥物［13］。所以，為了提高口腔鱗癌的治療效果，大量研究應(yīng)該關(guān)注新藥的開(kāi)發(fā)和新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，以便于發(fā)現(xiàn)和尋找更有潛在治療價(jià)值的方案或者手段。

研究發(fā)現(xiàn)人TWIST1 在口腔鱗癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，它位于7p21.2，隨著對(duì)其生物學(xué)功能的深入研究，TWIST1 是近些年來(lái)備受關(guān)注的原癌基因之一［14］。DUAN 等［15］發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下可以促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移，其機(jī)制可能與調(diào)控Bcl-2/TWIST1信號(hào)通路有關(guān)。另外，KONG 等［16］發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)TWIST1 和ZEB2 復(fù)合物對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的存活具有重要作用。但是TWIST1 對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控作用卻尚不明確。所以，本研究首先利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將sh-TWIST1和陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染至Tca8113 細(xì)胞，然后利用QRTPCR 法檢測(cè) 48 h 后 TWIST1 mRNA 的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1 所示，sh-TWIST1 組細(xì)胞中TWIST1 mRNA表達(dá)水平明顯下降。接下來(lái)通過(guò)CCK-8和Edu染色法檢測(cè)TWIST 基因?qū)谇击[癌細(xì)胞增殖和活力的影響，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，sh-TWIST1 組細(xì)胞的活力和增殖能力明顯提高。隨后，利用TUNEL 染色方法檢測(cè)了TWIST1 基因?qū)ca8113 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖4 所示，sh-TWIST1 組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯下降，說(shuō)明TWIST1 沉默后，顯著抑制了Tca8113細(xì)胞的凋亡。

已有大量文獻(xiàn)表明細(xì)胞的自噬反應(yīng)在增殖、凋亡和分化等生物過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用，自噬是一種細(xì)胞降解受損細(xì)胞器和異常胞內(nèi)蛋白的生理過(guò)程，也是一種高度保守的細(xì)胞行為，即細(xì)胞質(zhì)蛋白通過(guò)自噬作用被包裹進(jìn)入囊泡中，與溶酶體形成自噬溶酶體［17］。自噬相關(guān)基因?qū)ι矬w的存在十分重要，自噬相關(guān)基因的缺失不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的快速死亡，研究還發(fā)現(xiàn)自噬功能缺失的小鼠會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)、肝臟的損傷。其中Beclin1 和LC3 是兩個(gè)重要的調(diào)控因子，研究顯示Beclin1 位于人染色體17q21 上，可以形成復(fù)合體調(diào)節(jié)自噬活性；而LC3 與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成復(fù)合物，且其含量與自噬的發(fā)生呈現(xiàn)正相關(guān)［18-19］。本研究利用ELISA 試劑盒檢測(cè)了TWIST1 基因?qū)eclin1 和LC3 表達(dá)的影響，結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)TWIST1沉默后，Tca8113細(xì)胞中Beclin1 水平降低，LC3 水平升高，說(shuō)明此時(shí)伴有異常激活的自噬反應(yīng)發(fā)生。為了探究TWIST1 基因的調(diào)控機(jī)制，本研究鎖定了mTOR 信號(hào)通路。人mTOR 位于1p36.2，編碼蛋白由2 549 個(gè)氨基酸組成 ，mTOR 包 括 mTORC1 和 mTORC2 兩 種 蛋 白 。mTOR 可刺激下游靶點(diǎn)核糖體40S小亞基S6蛋白激酶（p-P70S6K），p-P70S6K 含有一個(gè)高度保守的氨基端，它本身不具有生物功能活性，但被mTOR磷酸化激活后進(jìn)而磷酸化S6 蛋白，導(dǎo)致P-P70S6K 蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成［20］。因此，本研究利用 Western blot 法檢測(cè)了 p-mTOR 和 p-P70S6K 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示當(dāng)TWIST1 沉默后，p-mTOR和p-P70S6K 的表達(dá)水平均顯著提高，說(shuō)明mTOR 信號(hào)通路被激活。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)TWIST1 基因沉默后，可促進(jìn)口腔鱗癌Tca8113 細(xì)胞的存活和增殖，并抑制其凋亡，說(shuō)明TWIST1基因可能是通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)而發(fā)揮作用。今后，本課題組可能通過(guò)構(gòu)建TWIST1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)一步探究TWIST1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖凋亡的調(diào)控機(jī)制。