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        顯微鏡下多血管炎患者血漿外泌體中差異表達(dá)的miRNAs及其功能分析①

        2021-08-23 01:52:40閆秋爽魏鑫岳天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院天津300203
        中國(guó)免疫學(xué)雜志 2021年10期
        關(guān)鍵詞:血漿差異分析

        閆秋爽 王 陽(yáng) 魏鑫岳 魏 蔚 馬 駿 鄭 芳(天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,天津300203)

        顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis,MPA)是一類主要表現(xiàn)為小血管損傷的系統(tǒng)性自身免疫疾病。MPA是抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)相關(guān)性血管炎(ANCA associated vasculitis,AAV)的亞型,主要特征為血清中存在髓過(guò)氧化物酶自身抗體(myeloperoxidase-ANCA,MPO-ANCA)[1]。外泌體是由脂質(zhì)雙分子層包裹的微小囊泡,直徑約為30~100 nm,可裝載DNA、RNA、蛋白和脂質(zhì)等重要生物分子,可介導(dǎo)相鄰及遠(yuǎn)距離細(xì)胞信息傳遞[2]。外泌體具有特殊的分子標(biāo)志物,如CD9、CD63、CD81、TSG101和HSP27等[3]。研究表明,外泌體可能在部分自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[4-6]。MicroRNAs(miRNAs)是一類序列長(zhǎng)度為19~25個(gè)核苷酸的非編碼RNA,可調(diào)節(jié)約90%編碼蛋白的基因,在多種生物學(xué)過(guò)程中(如分化、增殖、凋亡和免疫穩(wěn)態(tài)維持等)發(fā)揮重要作用[7-9]。研究表明,外泌體來(lái)源的miRNAs參與部分疾病病理過(guò)程[10],但血漿外泌體來(lái)源的miRNAs在MPA中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)MPA患者及健康志愿者血漿外泌體miRNAs表達(dá)譜,并分析2組研究對(duì)象差異表達(dá)的miRNAs(DF-miRNAs)及其功能,為進(jìn)一步揭示外泌體miRNAs與MPA發(fā)病機(jī)制的內(nèi)在聯(lián)系提供依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 資料

        1.1.1 研究對(duì)象 選取2018年1月至2019年8月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的MPA患者46例,男性14例,女性32例,平均年齡(67.8±11.2)歲。選取同期性別和年齡相匹配的健康志愿者54例,男性16例,女性38例,平均年齡(65.7±16.2)歲,臨床資料見(jiàn)表1。MPA患者根據(jù)2009年ACR分類標(biāo)準(zhǔn)和2012年Chapel-Hill共識(shí)會(huì)議分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷,排除患有嚴(yán)重感染和并發(fā)癥的患者。所有血清學(xué)特征以MPO升高為主的AAV患者均符合MPA型血管炎臨床適應(yīng)癥的綜合判斷,包括病史、體格檢查、血清學(xué)檢查、活檢和血管造影。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IRB2019-KY-147),患者知情同意。

        表1 一般臨床資料[±s,例(%)]Tab.1 Clinical characteristics[±s,n(%)]

        表1 一般臨床資料[±s,例(%)]Tab.1 Clinical characteristics[±s,n(%)]

        Note:WBC.White blood cell;CRP.C-reactive protein;ESR.Sedimentation rate;BVAS.Birmingham Vasculitis Activity;ENT.Ear,nose and throat.

        Items Number Age(year)Sex Female Male Hemoglobin(g/L)WBC(109 L-1)CRP(mg/L)ESR(mm/L)Creatinine(μmol/L)Ureaprotein(mg/24 h)MPO-ANCA(RU/ml)BVAS Organ involvement ENT Kidney Lung Central nervous system MPA 46 67.8±11.2 32 14 111.8±14.8 11.0±3.5 43.3±37.9 52.9±22.7 242.1±103.0 462.7±387.6 166.6±79.4 19.1±4.4 9(19.6)44(95.7)42(91.3)6(13.0)NC 54 65.7±16.2 38 16 134.2±4.6 6.3±2.9- - - - - - - - - -

        1.1.2 主要試劑與儀器 BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司;PVDF膜購(gòu)自Millipore公司;鼠抗CD63購(gòu)自Santa Cruz公司;兔抗TSG101購(gòu)自Abcam公司;血漿外泌體總RNA提取試劑盒miRNeasy Micro Kit購(gòu)自Qiagen公司;超速離心機(jī)購(gòu)自Beckman公司;透射電子顯微鏡購(gòu)自日立公司;在illumina HiSeqTM2500/MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

        1.2 方法

        1.2.1 標(biāo)本采集 所有血漿樣品均取自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院,采用含抗凝血?jiǎng)〦DTA的真空采血管收集全血,4℃靜置4 h,5 000 g離心5 min,-80℃儲(chǔ)存。

        1.2.2 外泌體分離和純化 血漿依次離心(4℃),3 000 g離心15 min,6 000 g離心15 min,10 000 g離心30 min(重復(fù)1次),去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和聚集體。上清經(jīng)0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾,PBS稀釋,100 000 g、4℃超速離心70 min(重復(fù)1次),得到的沉淀即為外泌體,PBS重懸,-80℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 透射電鏡進(jìn)行外泌體形態(tài)超微鑒定 外泌體懸浮液固定于銅網(wǎng)格上,4%多聚甲醛固定,PBS洗滌,4%乙酸鈾酰固定,透射電子顯微鏡觀察。

        1.2.4 Western blot法檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物CD63和TSG101表達(dá) 提取血漿外泌體總蛋白,BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,12%SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h。加入一抗鼠抗CD63、兔抗TSG101,4℃孵育過(guò)夜,加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h,檢測(cè)蛋白表達(dá)。

        1.2.5 外泌體miRNAs表達(dá)及差異分析 從外泌體懸浮液中提取總RNA,按照miRNeasy Micro Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,對(duì)提取樣本進(jìn)行RNA質(zhì)檢及高通量測(cè)序,并進(jìn)行定性和定量分析,統(tǒng)計(jì)各樣本中miRNAs表 達(dá),采 用TPM(transcripts per million reads,TPM)進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理[11]。檢驗(yàn)樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性。采用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2分析2組中表達(dá)水平顯著差異的miRNAs,當(dāng)差異倍數(shù)(FC)絕對(duì)值>2且P<0.05時(shí)為差異顯著[12]。

        1.2.6 DF-miRNAs靶基因預(yù)測(cè)及功能分析 為提高靶基因預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性,采用miRanda、PITA和RNAhybrid軟件對(duì)DF-miRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,并將3個(gè)軟件分析結(jié)果中均存在的靶基因定義為相應(yīng)miRNA的潛在靶基因。進(jìn)一步對(duì)獲得的DF-miRNAs靶基因進(jìn)行GO(Gene ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析[13-14]。

        2 結(jié)果

        2.1 血漿外泌體鑒定 電鏡觀察顯示,超速離心分離獲得的血漿微囊泡為直徑30~100 nm的不規(guī)則球體,具有相對(duì)完整的脂質(zhì)雙分子膜(圖1A)。Western blot結(jié)果顯示,患者和健康志愿者血漿微囊泡均表達(dá)CD63和TSG101(圖1B)。提示超速離心法從血漿中獲得的微囊泡為外泌體。

        圖1 血漿外泌體鑒定Fig.1 Identification of plasma exosomes

        2.2 血漿外泌體來(lái)源RNA高通量測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 采用illumina HiSeqTM2500/MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,得到的原始數(shù)據(jù)文件分析轉(zhuǎn)化為測(cè)序序列(Raw reads),并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估(圖2)。測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查用于分析目的測(cè)序范圍(1~40個(gè)堿基)測(cè)序錯(cuò)誤率異常的堿基位置。每個(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率低于0.5%為測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。結(jié)果顯示目的測(cè)序范圍內(nèi),6個(gè)測(cè)序樣本測(cè)序錯(cuò)誤率低于0.5%,表明測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

        圖2 實(shí)驗(yàn)樣本測(cè)序錯(cuò)誤率分布Fig.2 Distribution of sequencing error rate of experimental samples

        2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾 Clean reads是對(duì)Raw reads進(jìn)行處理后得到的干凈數(shù)據(jù),后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析均基于此數(shù)據(jù)。對(duì)Raw reads進(jìn)行處理是由于其含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads,未經(jīng)過(guò)濾會(huì)影響信息分析質(zhì)量。miRNA長(zhǎng)度集中于21~22個(gè)核苷酸,因此在各樣品的Clean reads中篩選了長(zhǎng)度為21~22個(gè)核苷酸的小RNA(sRNA)進(jìn)行分析。經(jīng)sRNA長(zhǎng)度分析篩選后,各樣本得到的總reads數(shù)為T(mén)otal sRNA。樣本匹配到已知miRNA前體的sRNA個(gè)數(shù)為Mapped total sRNA,具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

        表2 實(shí)驗(yàn)樣本高通量測(cè)序數(shù)據(jù)匯總Tab.2 Summary of high-throughput sequencing data of experimental samples

        2.4 篩選差異表達(dá)的miRNAs 根據(jù)差異表達(dá)miRNAs的整體分布,從FC值和P值2個(gè)水平進(jìn)行評(píng)估,篩選差異表達(dá)miRNAs,結(jié)果顯示,MPA組與健康對(duì)照組相比,32個(gè)血漿外泌體來(lái)源miRNAs表達(dá)水平有顯著差異,其中12個(gè)表達(dá)顯著上調(diào),20個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)(表3)。

        表3 MPA患者血漿外泌體中差異表達(dá)的miRNAs(部分)Tab.3 Differentially expressed miRNAs in MPA-exo(part)

        2.5 差異表達(dá)的miRNAs靶基因功能分析 MPA中表達(dá)上調(diào)的miRNAs組中,GO-BP分析顯示,差異表達(dá)的miRNAs靶基因功能與樹(shù)突發(fā)育調(diào)節(jié)、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞過(guò)程的正向調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程相關(guān);GOCC分析顯示,靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等細(xì)胞組分相關(guān);GO-MF分析中靶基因功能主要與蛋白結(jié)合顯著相關(guān)(圖3A)。而在MPA中表達(dá)下調(diào)的miRNAs組中,GO-BP分析顯示,靶基因功能在單一生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分正向調(diào)控等方面富集;GO-CC分析表明靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與神經(jīng)、突觸部分相關(guān);GO-MF分析中靶基因功能與蛋白域特異性結(jié)合、蛋白結(jié)合等密切相關(guān)(圖3B)。KEGG富集分析用于預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs的靶基因影響的信號(hào)通路,上調(diào)的miRNA靶基因主要富集于Toll樣受體(Tolllike receptor,TLR)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、溶酶體和AMPK信號(hào)通路等(圖4A)。下調(diào)的miRNA靶基因主要參與代謝相關(guān)信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路及氨基酸生物合成等(圖4B)。

        圖3 差異表達(dá)的miRNAs靶基因的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis for target genes of differentially expressed miRNAs

        圖4 差異表達(dá)的miRNAs靶基因KEGG途徑分析Fig.4 KEGG pathway analysis for target genes of differentially expressed miRNAs

        3 討論

        本研究首次探究了MPA血漿中外泌體來(lái)源miRNAs的差異表達(dá)及其在病理機(jī)制中的潛在功能,通過(guò)超速離心分離得到MPA患者和健康志愿者的血漿外泌體并進(jìn)行鑒定,高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)MPA組與健康對(duì)照組相比,血漿外泌體有32個(gè)表達(dá)顯著差異miRNAs,進(jìn)一步對(duì)DF-miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及其靶基因的功能分析,結(jié)果顯示MPA中差異表達(dá)的血漿外泌體miRNA可能在疾病代謝、免疫和炎癥方面發(fā)揮作用。

        幾乎所有細(xì)胞都可以分泌外泌體,因此各種體液中都可以檢測(cè)到外泌體[15]。本研究通過(guò)超速離心法首次分離得到MPA患者血漿外泌體,并采用透射電鏡和Western blot法對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定,超微形態(tài)學(xué)觀察和外泌體標(biāo)記蛋白CD63和TSG101檢測(cè)結(jié)果顯示,分離得到的細(xì)胞外微囊泡為外泌體。為進(jìn)一步研究MPA患者血漿外泌體miRNAs奠定了基礎(chǔ)。

        本研究通過(guò)高通量測(cè)序法檢測(cè)MPA和健康志愿者血漿外泌體miRNA表達(dá)譜并進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)2者差異顯著。MPA組有32個(gè)血漿外泌體來(lái)源miRNAs表達(dá)顯著改變,其中12個(gè)表達(dá)顯著上調(diào),20個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)。部分DF-miRNAs在多種疾病中發(fā)揮重要作用,如循環(huán)miR-103a-3p可通過(guò)SNRK/NFκB/p65調(diào)節(jié)軸促成血管緊張素II誘導(dǎo)的腎臟炎癥和纖維化;心力衰竭患者外泌體中miR-21-5p失調(diào)可影響其再生潛能;miR-150-5p通過(guò)靶向HMGA2和β-Catenin信號(hào)抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等[16-18]。但目前MPA的發(fā)病機(jī)制尚未闡明,差異表達(dá)的miRNAs在MPA疾病過(guò)程中的作用鮮有報(bào)道,且外泌體來(lái)源miRNA在MPA中尚未見(jiàn)報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。

        GO分析用于注釋和推測(cè)差異表達(dá)的外泌體miRNAs可能涉及的生理功能。當(dāng)差異表達(dá)的miRNAs的靶基因富含這些GOterms時(shí),提示靶基因的功能與之相關(guān)。GOterms有3種基本分類,分別為生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP),細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF),從不同層面解釋目標(biāo)基因的生物學(xué)功能。MPA血漿外泌體來(lái)源的差異表達(dá)miRNA靶基因GO富集分析顯示,GO-BP分析中miRNA靶基因主要富集于細(xì)胞過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程;GO-CC分析中miRNA靶基因主要富集于細(xì)胞內(nèi)和胞質(zhì)組分;GO-MF分析中miRNA靶基因主要富集于蛋白結(jié)合相關(guān)的分子功能。KEGG富集分析顯示,MPA患者血漿差異表達(dá)的miRNAs靶基因參與多個(gè)生物學(xué)途徑,其中,相關(guān)性最高的途徑為代謝途徑,且靶基因顯著富集于MAPK和TLR信號(hào)通路等。代謝、MAPK和TLR信號(hào)通路均參與MPA疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究表明,代謝綜合征發(fā)病率在MPA患者中明顯提高,并與MPA患者促炎狀態(tài)和疾病復(fù)發(fā)顯著相關(guān)[19]。研究發(fā)現(xiàn),p38 MAPK激活是MPO-ANCA抗原易位至細(xì)胞膜表面的關(guān)鍵步驟[20]。此外,AAV中,HMGB1可通過(guò)TLR增強(qiáng)MPO-ANCA誘導(dǎo)的NETs生成[21]。由此推測(cè),MPA血漿外泌體差異表達(dá)miRNAs可能在該疾病代謝、炎癥和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。

        綜上所述,本研究首次鑒定了MPA患者血漿外泌體中的差異表達(dá)miRNAs,通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)差異表達(dá)miRNAs的潛在功能進(jìn)行預(yù)測(cè),推測(cè)其可能在MPA代謝、炎癥和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用,但差異表達(dá)miRNAs在MPA中作用的分子模式需進(jìn)一步研究。本研究拓寬了MPA病理機(jī)制研究的視野,為闡明MPA發(fā)病機(jī)制和尋找潛在治療靶點(diǎn)提供新方向。

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