徐閃閃 王 龍 李雪軍 高 敏 張 霞 丁 櫻（河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生處，鄭州450000）

紫癜性腎炎（henoch-sch?nlein purpura nephritis，HSPN）是繼發(fā)于過敏性紫癜的腎小球疾病，多發(fā)于兒童時期，其中90%的患兒年齡在10歲以下，臨床表現(xiàn)主要以血尿和（或）蛋白尿為特征［1］。過敏性紫癜（henoch-sch?nlein purpura，HSP）的發(fā)病率為（3～27例）/10萬［2-3］，且逐年呈升高的趨勢，其中約30%～50%的患兒發(fā)展為HSPN［4］，大部分患兒預(yù)后良好，但仍有20%的患兒出現(xiàn)腎功能不全甚至發(fā)展為終末期腎衰竭，威脅患兒生命健康［5］。腎臟受累的嚴(yán)重程度影響著遠(yuǎn)期預(yù)后，故及時評估腎臟的病理變化情況，對采取規(guī)范的治療及改善遠(yuǎn)期預(yù)后至關(guān)重要。目前，腎臟穿刺是評估腎臟病變的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，但其是一項創(chuàng)傷性操作，有潛在風(fēng)險，多數(shù)情況下不能被患者家屬接受，腎臟穿刺技能要求嚴(yán)格，基層醫(yī)院鮮有具備腎臟穿刺操作的條件，因此尋找安全、無創(chuàng)及便捷的方法評估HSPN的病情變化是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點及難點。

HSPN的發(fā)生、發(fā)展與免疫、環(huán)境、遺傳及細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等多種因素有關(guān)，其中補(bǔ)體系統(tǒng)活化是非常重要的因素。補(bǔ)體系統(tǒng)是人體固有免疫不可或缺的成分，除參與機(jī)體防御反應(yīng)和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定外，也是介導(dǎo)組織損傷和細(xì)胞免疫的橋梁，與多種腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者血漿中C3a的水平高于健康人，且與IgAN的活動及嚴(yán)重程度相關(guān)［8］，在HSPN患者的腎臟及血清中同樣檢測到C3a、C5b-9、B因子等補(bǔ)體因子［9-10］，而C3a、C5a作為補(bǔ)體系統(tǒng)激活釋放的小分子產(chǎn)物，是促炎的主要介質(zhì)，需要與特應(yīng)性受體C3aR及C5aR結(jié)合而發(fā)揮作用，但其在HSPN診斷價值中的研究較少。

本研究擬比較HSPN患兒急性期與恢復(fù)期血清中C3a及C5a的水平，并分析與24 h尿蛋白定量、肌酐及腎臟病理的相關(guān)性，以探討C3a及C5a在HSPN診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究為單中心前瞻性臨床對照研究，選擇2018年5月至2018年12月河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科腎臟病區(qū)住院的45例HSPN患兒、15例HSP患兒及同期體檢的15例健康兒童作為研究對象，本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。健康兒童15例，男孩9例，女孩7例，平均年齡（8.59±2.60）歲，平均體重（32.40±9.43）kg；HSP患兒15例，男孩8例，女孩7例，平均年齡（8.35±2.34）歲，平均體重（32.00±11.96）kg；HSPN患兒45例，男孩30例，女孩15例，平均年齡（9.00±2.35）歲，平均體重（34.47±14.01）kg，3組兒童在性別、年齡、體重上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。HSPN患兒中有22例行腎臟穿刺術(shù)，其中病理類型Ⅱa級4例，Ⅱb級2例，Ⅲa級13例，Ⅲb級3例。

1.2 方法

1.2.1 納排標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有的HSPN患兒及HSP患兒均符合歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡在2～18歲；③尿常規(guī)異常出現(xiàn)1周以上，病程不超過2個月；④針對尿檢異常未使用過激素及雷公藤多苷片、CTX等免疫抑制劑；⑤患兒的監(jiān)護(hù)人已同意并簽署參與試驗的知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷中發(fā)現(xiàn)除腎臟損傷以外的其他臨床表現(xiàn)；②雖符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，但其監(jiān)護(hù)人未同意參與本次試驗的患兒。

1.2.2 腎臟病理分級 腎臟的病理分級是根據(jù)國際腎臟疾病分類研究（ISKDC）病理學(xué)家推薦，分為6級，具體如下：Ⅰ級，微小改變；Ⅱ級，單純系膜增生；Ⅲ級，系膜增生伴新月形/節(jié)段性病變（硬化、黏連、血栓形成）＜50%的腎小球；Ⅳ級，50%～75%的腎小球系膜增生伴新月形/節(jié)段性病變（與Ⅲ相同）；Ⅴ級，75%以上的腎小球系膜增生伴新月形/節(jié)段性病變（與Ⅲ相同）；Ⅵ級，膜增生樣病變。

1.2.3 數(shù)據(jù)采集 HSPN患兒急性期為入院后進(jìn)行治療前即0周，恢復(fù)期為進(jìn)行治療12周后停藥。采集所有入組兒童的年齡、性別、體重及HSPN患兒尿常規(guī)、24 h尿蛋白定量、腎臟病理類型等臨床數(shù)據(jù)。尿常規(guī)及尿蛋白定量由醫(yī)院兒科實驗室進(jìn)行檢測，腎臟病理由兒科腎臟病理室進(jìn)行檢測。收集健康兒童、HSP患兒及HSPN患兒0周與12周的空腹靜脈血，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，提取血清，標(biāo)記后在-80℃冰箱里冷藏備用，使用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特公司）檢測血清中C3a及C5a的濃度，其中酶聯(lián)免疫檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書中的操作進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（最小值～最大值）表示，組間比較采用秩和檢驗。使用ROC曲線評價診斷指標(biāo)的敏感度和特異度。計數(shù)資料采用χ2檢驗比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Pearson分析血清中C3a及C5a的水平與24 h尿蛋白定量的相關(guān)性，采用Spearman分析血清中C3a及C5a的水平與腎臟病理的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 3組兒童血清中的C3a和C5a水平比較 與健康兒童及HSP患兒相比，HSPN患兒血清中C3a水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），健康兒童與HSP患兒血清中C3a水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與健康兒童及HSP患兒相比，HSPN患兒血清中C5a水平差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），健康兒童與HSP患兒血清中C5a水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明HSPN患兒體內(nèi)存在著補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，且血清中的C3a與C5a與腎臟損傷有關(guān)，具體見表1。

表1 3組兒童血清中C3a及C5a水平的比較（±s）Tab.1 Comparison of serum C3a and C5a levels among threegroups of children（±s）

表1 3組兒童血清中C3a及C5a水平的比較（±s）Tab.1 Comparison of serum C3a and C5a levels among threegroups of children（±s）

Note：Compared with healthy and HSP，1）P＜0.01；compared with healthy，2）P＜0.001；compared with healthy，3）P＜0.05.

Index C3a（pg/ml）C5a（ng/ml）Healthy 3 862.63±586.67 34 495.59±18 630.28 HSP 7 258.59±2 234.442）60 581.93±33 608.233）HSPN 9 590.87±2 742.581）89 244.82±33 254.491）

2.2 HSPN患兒急性期與恢復(fù)期血清中C3a和C5a水平的比較 本實驗檢測了HSPN患兒急性期及恢復(fù)期血清中C3a及C5a水平，在急性期（治療前）血清中C3a及C5a的水平顯著高于恢復(fù)期（治療12周后），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），說明血清中的C3a及C5a的水平與疾病的活動性相關(guān)，具體見表2。

表2 HSPN患兒急性期與恢復(fù)期血清中C3a與C5a水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of serum C3a and C5a levels in children with HSPN during acute phase and recovery phase（±s）

表2 HSPN患兒急性期與恢復(fù)期血清中C3a與C5a水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of serum C3a and C5a levels in children with HSPN during acute phase and recovery phase（±s）

Index C3a（pg/ml）C5a（ng/ml）Acutephase 9 590.87±2 742.58 89 244.82±33 254.49 Recovery phase 3 427.34±981.12 27 010.25±18 276.64 T 15.65 10.13 P 0.000 1 0.000 1

2.3 HSPN患兒急性期血清中C3a和C5a與24 h尿蛋白定量的相關(guān)性 HSPN患兒急性期血清中C3a的水平與24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.37，且P＜0.05，C5a的水平與24 h尿蛋白定量不相關(guān)，表明HSPN患兒血清中C3a的水平與尿蛋白排泄有關(guān)，具體見圖1、2。

圖1 血清中C3a與24 h尿蛋白定量散點圖Fig.1 Quantitative scatter plot of serum C3a and 24 h urine protein

2.4 HSPN患兒血清中C3a和C5a與肌酐的相關(guān)性 HSPN患兒急性期血清中C3a和C5a的水平與血肌酐不相關(guān)，表明HSPN患兒體內(nèi)存在補(bǔ)體系統(tǒng)的整體激活和局部激活，且局部激活占主要作用，具體見圖3、4。

圖2 血清C5a與24 h尿蛋白定量散點圖Fig.2 Quantitative scatter plot of serum C5a and 24 h urine protein

圖4 血清C5a與血肌酐散點圖Fig.4 Scatter plot of serum C5a and serum creatinine

2.5 HSPN患兒血清中C3a和C5a與腎臟病理的相關(guān)性 45例HSPN患兒有22例行腎臟穿刺術(shù)，經(jīng)Sperman檢驗?zāi)I臟穿刺患兒的血清中C3a和C5a的水平與腎臟病理等級呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.858及0.502，且P＜0.05，說明血清中C3a及C5a的水平可能與腎臟病理相關(guān)。

2.6 C3a和C5a檢測HSPN的敏感性及特異性C3a診斷HSPN的敏感性為0.822，特異性為0.722，ROC曲線下面積為0.897，截點為7 621.94 ng/ml；C5a診斷HSPN的敏感性為0.756，特異性為0.611，ROC曲線下面積為0.835，截點為73 423 pg/ml，C3a聯(lián)合C5a診斷HSPN的敏感性為0.822，特異性為0.867，ROC曲線下面積為0.909。見圖5。

圖5 C3a、C5a診斷HSPN的特異性及敏感性Fig.5 Specificity and sensitivity of C3a and C5a in diagnosis of HSPN

3 討論

HSPN又稱IgAVN，病理表現(xiàn)為IgA為主免疫復(fù)合物在系膜區(qū)沉積，伴有補(bǔ)體因子及大量中性粒細(xì)胞的浸潤，臨床表現(xiàn)為血尿和（或）蛋白尿，伴有腎外小血管炎性病變?yōu)橹鳌SPN的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但補(bǔ)體系統(tǒng)激活參與了HSPN的發(fā)病及發(fā)展。補(bǔ)體系統(tǒng)作為先天免疫的一部分而發(fā)揮作用，補(bǔ)體激活后產(chǎn)生炎癥因子、趨化因子，促使中性粒細(xì)胞趨化和單核細(xì)胞產(chǎn)生蛋白酶、氧自由基和花生四烯酸代謝產(chǎn)物，而單核細(xì)胞的吞噬功能使得腎小球基膜降解、細(xì)胞受損以及腎小球濾過率降低，從而導(dǎo)致腎臟損傷［11-12］。在腎臟疾病患者的血液、尿液及腎組織中能檢測到各類補(bǔ)體成分［13-14］。

補(bǔ)體系統(tǒng)的激活有3條途徑，即經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑［15-16］。經(jīng)典途徑由與抗原結(jié)合的IgM或IgG引發(fā)，抗原抗體復(fù)合物結(jié)合C1q，通過裂解C4和C2，形成C3轉(zhuǎn)化酶（C4b2b）；凝集素途徑是由細(xì)菌直接結(jié)合甘露聚糖凝集素（MBL）啟動，病原微生物感染機(jī)體后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生MBL并與相關(guān)絲氨酸蛋白酶1和2（MASP1和MASP2）結(jié)合，進(jìn)而裂解C4和C2，最終形成與經(jīng)典途徑相同的C3轉(zhuǎn)化酶C4b2b，這種補(bǔ)體激活機(jī)制可在凋亡或壞死組織激活補(bǔ)體中起重要作用，并加重IgA介導(dǎo)的腎臟損傷［17］；替代激活途徑既不需要抗原-抗體復(fù)合物，也不需要激活C1、C2和C4，補(bǔ)體C3自發(fā)水解后形成C3（H2O）Bb，進(jìn)而結(jié)合B因子，在D因子的酶解作用下形成C3轉(zhuǎn)化酶（C3bBb）。

C3是3條途徑的共同匯聚點，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后，以C3轉(zhuǎn)化酶為核心依次產(chǎn)生C3a、C5a及膜攻擊復(fù)合物（MAC），從而導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解。研究發(fā)現(xiàn)C3a能夠激活內(nèi)皮細(xì)胞，從而上調(diào)血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)［18］。C5a的作用比C3a更強(qiáng)烈，能夠促進(jìn)IL-1、IL-6、IL-17及TNF-α等炎癥因子的釋放，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，參與HSPN患兒急性期的炎癥反應(yīng)［19］。

YANG等［20］研究發(fā)現(xiàn)30例HSP患者急性期血清中C3a及C5a的水平高于健康兒童，恢復(fù)期出現(xiàn)下降，30例HSP患者中僅有6例出現(xiàn)腎臟損害，但未對HSPN與HSP非腎臟損害患者血清中C3a與C5a的水平進(jìn)行比較。本研究首次將HSPN患兒與HSP非腎臟損傷的患兒血清中C3a及C5a的水平進(jìn)行比較，以驗證血清中C3a及C5a是否參與了腎臟的損傷，研究發(fā)現(xiàn)HSP患者存在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，且C3a及C5a的水平可能與腎臟的損傷及病情活動相關(guān)。

ABOU-RAGHEB等［21］發(fā)現(xiàn)46名IgAN/HSPN患者血清中C3a的水平升高，且C3a的水平與血肌酐的水平相關(guān)，但與24 h尿蛋白排泄無關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)MBL的沉積與尿蛋白的排泄增加、肌酐升高及嚴(yán)重的組織學(xué)病理損害相關(guān)［22］。本研究對HSPN患兒血清中C3a和C5a的水平與24 h尿蛋白、肌酐及腎臟病理均做了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSPN患者血清中C3a與尿蛋白排泄相關(guān)，但與肌酐無關(guān)，而C5a的水平與尿蛋白及肌酐均不相關(guān)，行腎臟穿刺22例HSPN患者血清中C3a和C5a的水平與腎臟病理的分級相關(guān)。我們推測補(bǔ)體系統(tǒng)在腎臟局部均存在著異常激活，且局部激活對病情進(jìn)展的誘導(dǎo)作用更大。血清中的C3a和C5a與相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮作用，但全身循環(huán)中C3a和C5a的半衰期較短，補(bǔ)體系統(tǒng)局部的激活，可能直接損害相應(yīng)的靶器官，而不是系統(tǒng)性的改變，補(bǔ)體系統(tǒng)沉積于腎臟，局部的激活從而導(dǎo)致相應(yīng)的病理改變。

本研究存在一定的局限性：首先我們納入的標(biāo)本量相對較少，尤其是腎臟穿刺的患者僅有22例，且腎臟病理以Ⅲa級為主，存在一定的選擇偏倚，且有限數(shù)量的患者限制了我們的進(jìn)一步分析，也可能導(dǎo)致目前結(jié)果的偏差，我們需要多中心及更大數(shù)量的標(biāo)本量來進(jìn)一步研究HSPN中的補(bǔ)體激活機(jī)制。其次我們未對行腎穿患兒的腎臟組織中C3a和C5a的沉積進(jìn)行檢測，僅分析了血清中C3a和C5a與腎臟病理的相關(guān)性，可能導(dǎo)致結(jié)果有一定的誤差，需要擴(kuò)大樣本量完善腎臟組織中C3a和C5a沉積的檢測，以進(jìn)一步證實C3a和C5a在HSPN診斷中的應(yīng)用價值。

目前我們的研究表明補(bǔ)體系統(tǒng)激活可能與HSPN的發(fā)病及疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，從而推測抑制補(bǔ)體激活可能有助于HSPN的治療。補(bǔ)體抑制藥的治療試驗對于確認(rèn)補(bǔ)體激活是不是參與了病情的進(jìn)展也很必要。目前補(bǔ)體抑制藥物依庫珠單抗已用于C3腎小球疾病，并取得了一定的成效［23］，但尚無使用依庫珠單抗治療HSPN的案例，后續(xù)我們可以試驗性使用依庫珠單抗治療難治性HSPN，希望能夠為HSPN患者帶來一種新的治療方案。如果補(bǔ)體激活參與HSPN的發(fā)病得到證實，補(bǔ)體激活片段可作為HSPN患者無創(chuàng)性、方便、靈活的監(jiān)測指標(biāo)，同時阻斷其受體也可作為疾病的潛在治療靶點，為HSPN患者的治療提供新思路及依據(jù)。

綜上所述，補(bǔ)體激活的炎性小片段C3a和C5a可能參與了HSPN的發(fā)病，且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為一種監(jiān)測病情的指標(biāo)。