王國臻 王玉格 蘭春陽 李 翔 李明成 付桂蓮（北華大學醫(yī)學技術學院，吉林132013）

細菌性痢疾主要流行于衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國家，全世界每年的病例總數高達1.647億，死亡人數超過了60萬人［1］，在發(fā)展中國家大多數細菌性痢疾由福氏志賀菌（占60%）引起，在我國最為流行的是福氏和宋內志賀菌［2］，主要檢測方法有分離培養(yǎng)法、免疫學及分子生物學等方法。這些方法存在靈敏度低、成本高、耗時長、操作繁瑣等缺點。因此建立一種快速、穩(wěn)定、高效、特異性高、價格低的檢測技術，對痢疾防治和臨床用藥都具有十分重要的意義［3］。

適配體是一種新型的分子識別元件，原理是基于指數富集技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從隨機寡核苷酸文庫中篩選對靶物質具有高親和性與高特異性的寡核苷酸序列單鏈DNA（ssDNA）或RNA［4］。與傳統(tǒng)抗體相比，適配體優(yōu)點是識別的靶分子范圍廣，可以與各種腫瘤細胞、細菌、蛋白質多肽、金屬離子和病理切片等進行結合識別；有較高的特異性和親和性；識別精細的抗原結構，也可鑒別交叉抗原；易于修飾，可大量和快速在體外合成。篩選周期短、成本低，比起抗體的制備，尤其是單克隆抗體的制備，整體制備周期縮短了60%以上的時間［5］。全細菌消減SELEX技術（whole-bacteria SELEX）是一種以完整細菌為靶標的篩選方法，經過12～15輪的篩選，中間采用消減菌篩選技術，即用與其種屬相近、致病性相似的菌進行反向篩選，增強其特異性。目前，全細菌SELEX技術已經成功篩選出多種適配體，包括腸炎沙門氏菌、化膿性鏈球菌等適配體，實驗證明適配體可顯著抑制細菌侵入宿主細胞，發(fā)揮抗微生物感染的功效［6］。

本研究采用whole-bacteria SELEX技術制備福氏志賀菌2a特異性核酸適配體，在制備適配體過程中，首次應用Lambda外切酶切割dsDNA獲得ssDNA，應用Sephacryl凝膠層析技術將dsDNA、ssDNA和酶切碎片進行分離，極大縮短適配體的制備時間，同時可有效提高核酸適配體的特異性。本研究建立的核酸適配體制備技術，為適配體的廣泛應用起到示范推廣作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 福氏志賀菌2a（CICC：21534）由吉林市疾控中心提供；腸炎沙門氏菌（CICC：21482）、大腸埃希菌（ATCC：25922）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞、質粒GUPXT19-TVector購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 1×結合緩沖液（Banding Buffer，BB；主要成分：Tris-base、酵母tRNA、牛血清白蛋白）購自北京天根生化科技有限公司；基因擴增儀購自蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司；LB液體培養(yǎng)基購自Sigma公司；高速冷凍離心機、分析天平購自德國Sartorius公司；流式細胞儀購自北京艾格斯生物科技有限公司；微量核酸分析儀購自美國Quwell公司。

1.2 方法

1.2.1 核酸適配體初級文庫（ssDNA）的制備 福氏志賀菌2a核酸適配體初級文庫參考文獻設計，由Gene公司采用隨機引物合成法合成［7］。隨機ssDNA文庫全長為76 nt，其兩端為固定引物序列，上游引物序列為5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'，下游引物為5'-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'，中間為35個堿基的隨機序列。用BB稀釋至10 nmol/μl，配制成貯存液，使用時用雙蒸水進行10倍稀釋?；靹蚝蠓湃隕P管中，95℃加熱5 min，置于冰上備用。

1.2.2 靶標菌與消減菌的制備 分別挑取福氏志賀菌、大腸埃希菌、沙門菌接種到30 ml LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、50 r/min，振蕩培養(yǎng)至對數生長期（A600=0.3），收集菌液，6 000 r/min離心5 min，棄上清，用1×BB洗滌沉淀3次，重懸于500μl BB中。

1.2.3 ssDNA文庫與福氏志賀菌2a細胞淘選 將制備好的適配體初級文庫與靶標菌結合，設定反應總體系為500μl，ssDNA文庫為2 nmol，細菌總量為107cfu/ml，37℃、180 r/min孵育1 h，3 500 r/min離心5 min，棄上清，用BB洗兩次。95℃熱變性10 min，立即冰浴10 min，4℃、8 000 r/min離心7 min，獲得的上清即為該輪篩選的產物。

1.2.4 PCR大量擴增及條件優(yōu)化 通過梯度PCR擴增上清液中的ssDNA，制備高純度dsDNA。設定PCR體系為12.5 ml（2×Taqmix 6.25 ml，上游引物0.5 ml，下游引物0.5 ml，去離子雙蒸水2.25 ml，模板3 ml），分別將模板進行5×、10×、20×稀釋，循環(huán)數設定為6 cycle、8 cycle、10 cycle、12 cycle。最后放大PCR體系至100 ml，挑選在無污跡、無非特異性擴增的優(yōu)化條件下產生的dsDNA，并在下游引物進行磷酸標記，用于外切酶的識別。

1.2.5 Lambda外切酶酶切及葡聚糖凝膠（Sephacryl）純化 利用Lambda外切酶可以識別下游引物5′端帶磷酸的dsDNA，將dsDNA切割成ssDNA。反應體系及條件：Lambda外切酶2μl，去離子雙蒸水18μl，pH=9.4，37℃，10 min。制備葡聚糖凝膠層析柱，提前1 d用雙蒸水泡發(fā)好Sephacryl凝膠，按照長度L與直徑D的比值（L/D=10），裝入層析柱中鋪勻，長度L達到20 cm左右，用于PCR產物和酶切產物的純化。酶切產物上樣量200μl，間斷用去離子雙蒸水沖柱，加入上樣量2倍體積，2～3 s 1滴，1滴約為22μl，用96孔板收集，微量紫外分析儀檢測，繪制回收曲線。

1.2.6 次級ssDNAs文庫的制備 取12μg回收的ssDNA，醇沉，重懸于500μl BB中，置于95℃水浴10 min后，迅速置于冰上10 min，在4℃的條件下恢復其空間結構，作為下一輪篩選的次級文庫。

1.2.7 消減菌的使用 分別在3、4、5輪加入腸炎沙門菌進行反向篩選，6、7、8輪加入大埃希菌進行反向篩選，消減菌保證了福氏志賀菌適配體的特異性。

1.2.8 克隆測序 將40μl X-gal和16μl IPTG 20 ml均勻的鋪在LB固體培養(yǎng)基上，將適配體連接到GU PXT19-T Vector上，轉化感受態(tài)細胞DH5α，藍白篩選，挑去白色菌落，送到上海生工工程股份有限公司進行測序。

1.2.9 志賀菌適配體親和性的檢測 將上游引物5′端標記磷酸，通過PCR擴增產生帶熒光dsDNA，避光條件下，通過Lambda外切酶進行酶切，酶切產物用Sephcryl凝膠層析純化后。取40μl 107cfu/ml福氏志賀菌，與10μl 100 ng/μl選取的自由能較小的幾條適配體進行孵育，用流式細胞儀檢測適配體結合熒光強度，從而篩選出親緣性高、特異性強、結合熒光能力強的適配體。

2 結果

2.1 PCR擴增ssDNA的篩選條件優(yōu)化 將模板進行梯度稀釋，選擇5倍、10倍及20倍稀釋，同時分別進行6 cycle、8 cycle、10 cycle、12 cycle循環(huán)，共設定16組條件，找到最適宜的擴增條件。結果當模板10倍稀釋時，10個循環(huán)的條件下能夠擴增出單一目的條帶，將這一輪篩選出來的ssDNA全部擴增（圖1）。

圖1 PCR大量擴增ssDNA優(yōu)化條件瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of largely amplifying ssDNA by PCR in optimized conditions

2.2 Lambda外切酶切割dsDNA反應條件 重復酶切試驗證明最適宜反應體系為20μl體系。分別選擇酶切底物濃度為700 ng/μl、600 ng/μl、500 ng/μl；Lambda外切酶為2μl，10×緩沖液2μl，去離子雙蒸水補齊。將實驗分為兩組：1倍酶量和2倍酶量（20μl反應體系中，外切酶量4μl），時間設定15 min和30 min。結果顯示底物為700 ng/μl、600 ng/μl，2倍酶量進行酶切，反應時間為30 min時，可獲得單一目的條帶。隨著酶切時間過長，也會緩慢降解ssDNA，產生非磷酸化底物（圖2）。

圖2 不同濃度、不同酶量PCR產物酶切效果的變性聚丙烯凝膠電泳圖Fig.2 Denaturing polypropylene gel electrophoresis of PCR products with different concentration and enzyme activity

2.3 Sephacryl凝膠層析純化及Lambda外切酶酶切產物回收曲線 設計實驗模仿酶切混合物，將100 ng/μl dsDNA和100 ng/μl ssDNA以2∶1比例混合共300μl，繪制回收曲線（圖3）。按照公式計算：回收率=實際回收ssDNA量/加入ssDNA估計的量×100%，結果ssDNA回收率高達84.40%，說明Sephacryl凝膠層析柱可以回收純化ssDNA產物。按此方法，回收600 ng/μl酶切混合物150μl，平均回收率高達72.33%（圖4）。

圖3 微量紫外分析儀檢測實驗模仿酶切混合物ssDNA回收曲線Fig.3 Recovery curve of ssDNA detected from mimic mixtures after enzyme digestion by micro UV analyzer

圖4 微量紫外分析儀檢測600 ng/μl酶切混合物ssDNA回收曲線Fig.4 Recovery curve of ssDNA detected from 600 ng/μl mixtures after enzyme digestion by micro UV analyzer

2.4 適配體一級結構 福氏志賀菌2a的ssDNA經過10輪正向篩選和6輪消減菌篩選，最終得到第九輪與第十輪熒光強度基本完全相同，通過熒光分光光度計最終確認完成富集。將得到特異適配體與T載體連接，轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，藍白斑篩選，挑去60個白色菌落進行測序。應用MEGA 5.0對測序回來的隨機序列進行同源性分析，將適配體分為3大族，選取3個家族同源性較高的有代表性的3個序列，分別命名為ZH-17、ZH-21、ZH-28（圖5）。

圖5 福氏志賀菌2a適配體同源性分析Fig.5 Homology analysisof aptamersof Shigellaflexneri2a

2.5 核酸適配體的親和性 選取3條結合特異性好的適配體，分別與福氏志賀菌2a進行孵育，經過流式細胞儀分析，適配體ZH-21與志賀菌結合親和性最好，熒光強度最高，而與種屬相近的兩種消減菌腸炎沙門菌和大腸埃希菌結合能力弱（圖6、7）。

圖6 福氏志賀菌3條親和性高適配體流式細胞儀熒光強度比對Fig.6 Comparison of fluorescence intensity of three highly compatible ligands of Shigella flexneri by flow cytometry

2.6 適配體的二級結構 將3個代表序列輸入預測DNA和RNA的二級結構在線工具mfold（http：//unafold.rna.albany.edu/？q=mfold），得到了ZH-17、ZH-21和ZH-28三個適配體的空間結構和自由能，根據流式細胞儀實驗結果，ZH-21結合特異性最高，測序其一級結構為ATCCAGAGTGACGCAGCACGCACACACCTTCTTTCTTTCTGTCCCCTTCTTTCTTTCCTGGACACGGTGGCTTAGT，其二級結構自由能小且有發(fā)卡、莖環(huán)和凸環(huán)等結構（圖8）。

圖7 ZH-21適配體與志賀菌、腸炎沙門菌、大腸埃希菌的結合比對Fig.7 Comparison of bingding ratio for aptamer ZH-21 to Shigella，Samonella enteritidis and Escherichia coli

圖8 福氏志賀菌親和性最高適配體ZH-21二級結構Fig.8 Secondary structure of the highest affinity ligand ZH-21 of Shigella flexneri

3 討論

志賀菌常規(guī)檢驗技術包括有增菌培養(yǎng)、分離純化、生化檢驗和血清型分型鑒定等，為了得到最好的分離效果，定性檢測實驗中同時采用低敏感性麥康凱培養(yǎng)基、強選擇性木糖賴氨酸去氧膽酸鈉培養(yǎng)基或HE培養(yǎng)基來提高檢出率，且應該對沙門菌-志賀菌分離培養(yǎng)基（SS）謹慎使用，因其會抑制某一些志賀菌1型的生長，對其檢測結果造成誤差。ELISA法特異性強、靈敏度高、重復性強、準確度好且易于自動化操作，但試劑專一性強，無法同時檢測出多種成分，且會出現與結構類似化合物結合交叉反應，此外，特異抗體還受制備、保存、溫度、時間、環(huán)境和保存方法的影響，故限制了其應用［8］。PCR技術包括常規(guī)PCR、多重PCR、熒光定量PCR等，縮短了相應的檢測時間，且可以對多種菌同時進行檢測，但其操作易產生污染，出現假陽性，且DNA和RNA易被降解，從而影響實驗結果［9］。對志賀菌的常規(guī)檢測技術存在著操作繁瑣且特異性低，難以滿足公眾對大批量人體健康體檢和突發(fā)性公眾衛(wèi)生事件的需求［10］。

傳統(tǒng)制備適配體過程中，主要采用離心沉淀法或使用Streptavidin Sepharose堿變性親和層析柱將與靶標結合和未結合的寡核苷酸序列分離，這種適配體制備時間需要5～6 d，層析柱分離法成本高，存在著提高特異性和大規(guī)模制備的技術障礙［11］。在整個適配體篩選過程中，ssDNA文庫的產量與特異性對適配體篩選至關重要。本實驗利用Lambda核酸外切酶可以作用于雙鏈DNA，聯合Sephacryl凝膠層析獲得ssDNA和非磷酸化底物。凝膠層析又被稱為分子篩過濾、排阻層析等，它突出優(yōu)點是層析所用的凝膠屬于惰性載體、不帶電荷、吸附力弱、操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，凝膠層析技術多用于蛋白質等大分子有機物的分離。Sephacryl是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺（N，N'-methylenebisacrylamide）交聯而形成的，是一種新型葡聚糖凝膠，分離范圍極大，機械穩(wěn)定性高［12］。本實驗引入Sephacryl凝膠層析技術純化ssDNA混合物，摸索了小劑量和大劑量制備適配體Lambda酶與dsDNA最佳工作條件。進行大規(guī)模制備時，回收效率高達70%以上，而傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠切膠回收效率只有10%左右［13］。

實驗首次將Lambda外切酶和Sephacryl凝膠層析技術應用于適配體ssDNA和酶切碎片篩選，極大縮短了適配體的制備時間，同時可有效提高核酸適配體的特異性。提高了適配體的制備效率，增加了適配體的結合特異性，將整個制備周期縮短至3～4 d，且尤其適用于工廠、公司大規(guī)模制備適配體，該技術極大地推廣了適配體的大規(guī)模使用。

福氏志賀菌2a是中國地區(qū)常致感染性腹瀉的病原菌，因此快速、有效的應用適配體檢測志賀菌技術，也對疾病防治和臨床選擇用藥具有十分重要的意義［14］。但本研究尚不能為該適配體的其他3種志賀菌進行特異性檢測。為了優(yōu)化適配體的制備，保證其特異性，下一步我們計劃利用生物信息技術比對靶標菌的特異性蛋白質，通過蛋白質工程技術和蛋白質空間結構來反向設計適配體的一級結構和二級結構，將其命名為限制性指數富集技術，意為將設計好的若干種適配體與靶標菌進行結合，極大地提高其特異性和篩選效率。