郭 勇 李 波 蒲邦明 方 超 李春桃（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽外科，瀘州646000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大最常見的腫瘤，居全球腫瘤相關(guān)死亡原因的第三位［1］。HCC在原發(fā)性肝癌患者中占90%以上。其預(yù)后較差，5年生存率僅為17%～53%［2-3］。目前，HCC的根治性手術(shù)治療僅在疾病早期階段有效，但大多數(shù)患者在診斷時就已處于晚期，失去了手術(shù)機會。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高是導(dǎo)致HCC患者預(yù)后不良的主要因素。因此，迫切需要對HCC機制的新見解，以確定新的預(yù)后分子標(biāo)志物和潛在的有效治療靶點，從而提高患者的存活率［4-5］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，LncRNA）是一類長度超過200個堿基對的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，表現(xiàn)出有限的蛋白質(zhì)編碼能力。許多LncRNA在分化的組織或特定的癌癥類型中特異性表達［6-7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA通過與其他細(xì)胞大分子相互作用驅(qū)動許多重要的癌癥表型，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)［8］。也有研究發(fā)現(xiàn)，異常的LncRNA表達在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［9-10］。有研究者發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4參與調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展，然而關(guān)于LncRNA AC010145.4在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達及意義的研究卻十分有限［11］。本研究擬分析HCC癌組織中LncRNA AC010145.4的表達，并觀察其對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞活力和侵襲能力的影響，以期為HCC的機制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2014年1月至2016年1月于我院接受手術(shù)切除術(shù)的HCC患者131例作為研究對象，收集患者相關(guān)病例資料、愈后情況。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理證實為HCC；②術(shù)前未接受抗腫瘤治療；③接受完全腫瘤切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①院內(nèi)死亡；②合并其他惡性腫瘤者；③病例資料不全者。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象在參與本研究前均已簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞來源 HCC細(xì)胞系SMMC-7721和HCCLM3均購自于美國菌種保藏中心。SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞系均在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)于RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自北京友康恒業(yè)生物科技有限公司；慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成；Trizol試劑盒、Prime Script RT試劑盒、SYBR premix ex TaqtmⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。Stratagene MX3005P實時熒光定量PCR儀購自美國安捷倫。

1.2 方法

1.2.1 LncRNA AC010145.4相對表達量測量 分別取50 mg癌組織和癌旁組織樣本進行超聲勻漿，Trizol試劑盒提取HCC癌組織和癌旁組中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR premix ex TaqtmⅡ試劑盒說明書進行qRT-PCR實驗檢測LncRNA AC010145.4表達。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min；（95℃15 s、60℃30 s、72℃30 s）×40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA AC010145.4的相對表達水平。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染LncRNA AC010145.4 siRNA SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞系消化和傳代時間為48 h，實驗采用對數(shù)生長相細(xì)胞。將SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞接種于6孔板，并培養(yǎng)直至達60%融合。去除6孔板中的血清，Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染經(jīng)慢病毒包裝的siRNA（沉默表達組，siRNA組）和空載體（陰性對照組，Ctrl組）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行相關(guān)研究。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力測定 將siRNA組和Ctrl組對數(shù)生長期的SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞系接種于96孔板（3 000個/孔），分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。在添加CCK-8之前，改變培養(yǎng)基。每孔加入90μl培養(yǎng)基和10μl CCK-8。使用微孔板讀數(shù)器測定450 nm處的OD值。并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 細(xì)胞侵襲能力測定 取siRNA組和Ctrl組對數(shù)生長期的SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞進行細(xì)胞懸浮。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個/ml，并將100μl細(xì)胞懸浮液添加至Transwell室。然后將800μl培養(yǎng)基（帶有轉(zhuǎn)染復(fù)合物或NC）加入下室的24孔板。培養(yǎng)24 h后，移除Transwell室，PBS沖洗后，福爾馬林固定細(xì)胞。用棉簽擦拭微孔膜上細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下，將圖像放大200倍以計算每個區(qū)域的侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，首先進行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢測，數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布。計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。采用受試者工作特征曲線（ROC）計算LncRNA AC010145.4對HCC患者術(shù)后生存的預(yù)測價值。采用Kaplan-Meier并Log-rank檢驗比較LncRNA AC010145.4表達對HCC患者術(shù)后總體生存時間的影響。COX回歸模型分析影響HCC患者術(shù)后生存的危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC癌組織中LncRNA AC010145.4表達 通過RT-qPCR檢測HCC患者的癌旁組織和癌組織中LncRNA AC010145.4的相對表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，HCC癌組織中的LncRNA AC010145.4表達顯著升高（9.13±2.43 vs 1.33±0.40），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1 HCC患者癌組織和癌旁組織中LncRNA AC010145.4的表達差異Fig.1 Different expression of LncRNA AC010145.4 in cancer and paracancerous tissuesof HCC patients

2.2 LncRNA AC010145.4表達對HCC患者的診斷價值 如圖2所示，LncRNA AC010145.4對預(yù)測HCC患者術(shù)后死亡的最佳臨界值為5.98，靈敏度為94.2%，特異度為67.7%，AUC為0.775，95%CI：0.69～0.84（P＜0.05）。

圖2 LncRNA AC010145.4預(yù)測HCC患者術(shù)后死亡的ROC曲線Fig.2 ROC curve of LncRNA AC010145.4 to predict postoperative mortality in HCC patients

2.3 LncRNA AC010145.4表達與臨床病理特征關(guān)系 根據(jù)ROC曲線結(jié)果，將LncRNA AC010145.4表達水平高于5.98者定義為高表達組（n=73），將LncRNA AC010145.4表達水平低于5.98者定義為低表達組（n=58），分析LncRNAAC010145.4相對表達量與HCC患者的臨床病理特征關(guān)系，結(jié)果如表1。LncRNA AC0 10145.4表達與患者的性別、年齡、門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶無顯著相關(guān)性（P＞0.05），而與谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甲胎蛋白、Child-Pugh分級、是否感染肝炎病毒、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.05）。

表1 HCC患者LncRNA AC010145.4相對表達量與臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］Tab.1 Relationship between relative expression of LncRNA AC010145.4 and clinicopathological characteristicsin HCC patients［n（%）］

2.4 HCC患者單因素生存分析結(jié)果 如圖3、表2，單因素生存分析顯示，較高甲胎蛋白水平、Child-Pugh分級B級、較大腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高TNM分期、LncRNA AC010145.4高是經(jīng)手術(shù)治療HCC患者死亡的獨立危險因素。

圖3 LncRNA AC010145.4相對表達量與HCC患者術(shù)后生存率相關(guān)性Fig.3 Correlation between relative expression of LncRNA AC010145.4 and postoperative survival rate of HCC patients

表2 HCC患者術(shù)后生存率單因素及多因素回歸分析Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression analysis for HCC patients

2.5 HCC患者Cox回歸分析結(jié)果 將單因素生存分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入Cox回歸模型進行分析得出：較高甲胎蛋白水平、Child-Pugh分級B級、較大腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高TNM分期、LncRNA AC010145.4高是經(jīng)手術(shù)治療HCC患者死亡的獨立危險因素。見表2。

2.6 沉默LncRNA AC010145.4表達抑制肝細(xì)胞癌增殖 由圖4可知，siRNA組細(xì)胞增殖活力較Ctrl組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明沉默LncRNA AC010145.4表達能抑制SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞的增殖能力。

圖4 Ctrl組與siRNA組的細(xì)胞增殖曲線比較Fig.4 Comparison of cell proliferation curve between Ctrl and siRNA group

2.7 沉默LncRNA AC010145.4表達抑制肝細(xì)胞癌侵襲 Transwell實驗表明，在×200的視野下，SMMC7721細(xì)胞siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)為（33±6）×103個，Ctrl組侵襲細(xì)胞數(shù)為（98±23）×103個；HCCLM3細(xì)胞siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)為（30±5）×103個，Ctrl組侵襲細(xì)胞數(shù)為（90±20）×103個；兩種細(xì)胞siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于Ctrl組（均P＜0.05）。結(jié)果見圖5。

圖5 沉默LncRNA AC010145.4抑制HCC侵襲（×200）Fig.5 Silence of LncRNA AC010145.4 inhibit HCC invasion（×200）

3 討論

HCC是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)生發(fā)展機制十分復(fù)雜，臨床上尚未發(fā)現(xiàn)可靠的HCC治療靶點。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致HCC患者預(yù)后不良的主要原因。有研究者認(rèn)為，單純DNA突變并不能完全解釋HCC發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜進程［12］。目前，基因不同水平表達調(diào)控機制研究是診斷和治療HCC的熱點。LncRNA是一類長度超過200個堿基對但不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA。人類基因組中LncRNA的確切數(shù)目仍存在爭議，但有研究者認(rèn)為人類基因組中有超過60 000個LncRNA。最近研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA是多種生物學(xué)過程中的重要分子，包括發(fā)育、表觀遺傳學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)、激素反應(yīng)、癌癥和腦功能等。

既往研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在HCC患者的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［8，13］。DING等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA PVT1在肝癌組織中表達升高，且其表達升高可增加肝癌復(fù)發(fā)的發(fā)生風(fēng)險。LncRNA CCAT1在肝癌組織中高表達，且與臨床分期和腫瘤大小相關(guān)，是影響肝癌患者預(yù)后的獨立危險因子［15］。ZHANG等［16］發(fā)現(xiàn)，LncRNA SNHG15在肝癌組織中表達上調(diào)，且LncRNA SNHG15表達與肝癌分級、血管侵犯、TNM分期及預(yù)后相關(guān)。劉浩等［17］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4在直腸癌組織中相對表達量升高，可能是評估直腸癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)LncRNA AC010145.4表達對HCC患者的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4在HCC癌組織中的相對表達量顯著高于癌旁組織，提示LncRNA AC010145.4可能在HCC中高表達。進一步研究LncRNA AC010145.4表達與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4表達與HCC患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甲胎蛋白、Child-Pugh分級、是否感染肝炎病毒、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，與既往研究結(jié)果類似。

既往研究發(fā)現(xiàn)LncRNA CCAT1是影響肝癌患者預(yù)后的獨立危險因子［15］。劉浩等［17］報道，LncRNA AC010145.4是評估直腸癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。趙沖等［11］發(fā)現(xiàn)，LncRNA AC010145.4高表達小細(xì)胞肺癌患者的總體生存時間和無進展生存時間均短于低表達者。本研究以ROC曲線得出臨界值，證實LncRNA AC010145.4低表達組總體生存率顯著高于LncRNA AC010145.4高表達組。提示LncRNA AC010145.4可能與疾病進展有關(guān)，是HCC患者預(yù)后的影響因素之一。

細(xì)胞惡性增殖、侵襲及遷移是腫瘤發(fā)展過程中的主要特征之一［18-19］。HUANG等［18］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CDKN2B-AS1可通過靶向let-7c-5p/NAP1L1軸促進肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。YAN等［20］發(fā)現(xiàn)LncRNAmiR31HG可通過靶向miR-575抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究通過CCK-8和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞系上LncRNA AC010145.4沉默表達組OD450nm值顯著低于Ctrl組，且侵襲細(xì)胞數(shù)顯著少于Ctrl組，這與HCC癌組織內(nèi)的結(jié)果一致，提示LncRNA AC010145.4沉默表達可能具有抑癌作用。進一步證實了LncRNA AC010145.4可能與HCC病理生理機制相關(guān)。

綜上所述，本研究首次報道了LncRNA AC010145.4在HCC癌組織中表達升高，且與不良臨床病理特征相關(guān)。體外試驗發(fā)現(xiàn)，沉默LncRNA AC010145.4表達可抑制HCC細(xì)胞系增殖和侵襲，提示LncRNA AC010145.4在HCC中可能起到促癌基因的作用。然而，影響HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制復(fù)雜，LncRNA AC010145.4調(diào)節(jié)HCC患者發(fā)生發(fā)展的具體作用機制及參與的信號通路尚需進一步研究。