萬順巧 吳瓊麗 康雙朋 楊濱燕 吳長有（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，廣州510080）

膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是十大常見腫瘤之一，其發(fā)病率居全球第九位，病死率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤前列。膀胱癌是一個巨大的社會負擔(dān)，男性發(fā)病率為女性的3～4倍，其中女性患者確診后預(yù)后更差，多數(shù)患者在出現(xiàn)肉眼血尿后經(jīng)尿道膀胱鏡檢查才被確診［1-2］。盡管有放療、化療、經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)、BCG灌注治療和免疫檢查點抑制劑等多種治療方式相結(jié)合，但膀胱癌的5年生存率和治療效果并未得到很大的改善［3-4］。近年來在不同組織器官中發(fā)現(xiàn)組織駐留記憶T細胞（TRM），并在實體瘤中發(fā)揮著重要作用，腫瘤中的TRM與癌癥患者的疾病進展相關(guān)［5-7］。此外有研究報道γδT細胞在炎癥早期免疫應(yīng)答早于Th17，在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用［8］。有文獻表示IL-17與炎癥細胞變化有關(guān)，而膀胱癌的發(fā)生發(fā)展一直伴隨著炎癥［9］。因此本研究著重研究小鼠膀胱T細胞的表型、細胞因子及作用，為膀胱癌更進一步的免疫治療研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞 6～8周齡C57BL/6雌性小鼠，購自中山大學(xué)實驗動物中心（SYXK2015-0107）；MB49膀胱癌細胞由孫逸仙紀念醫(yī)院生物島十號實驗室提供。

1.1.2 實驗試劑 流式抗體：PE-CF549抗鼠CD3（145-2C11）、APC-CyTM7（OX-35）、FITC抗鼠CD4（GK1.500）、Percp-CyTM5.5抗鼠CD8（53-6.7）、Percp-CyTM5.5抗鼠CD44（IM7）、PE抗鼠γδT（V65）、FITC抗 鼠CD45（OX-1）、PE-CyTM7抗 鼠CD69（H1.2F3）、PE抗鼠CD103（M290）、PE-CyTM7抗鼠IFN-γ（XMG1.2）、PE抗鼠IL-17A（TC11-18H10），APC-CyTM7抗鼠TNF-α（MP6-XT22）、PE抗鼠CXCR3（CXCR3-173）和PE-CyTM7抗鼠CXCR5（2G8）均購自BD公司；免疫組化與熒光抗體：CD3一抗、γδT一抗和二抗均購自abcam公司；二抗CD3購自碧云天公司；小鼠外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；Percoll購自上海碩欣生物科技公司。Ⅰ型膠原酶、離子霉素（Ionomycin）、佛波酯（PMA）、布雷非德菌素A（BFA）均購自Sigma公司；0.25%胰蛋白酶、不完全RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺及青霉素、鏈霉素均購自Gibco公司；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（×50）購自solarbio；牛血清白蛋白（BSA）和二甲基亞砜（DMSO）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司。

1.1.3 實驗儀器 流式細胞儀（BD AiralⅡ）購自BD公司；熒光顯微鏡（OLYMPUS-BX53）購自O(shè)lympus公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（Galaxy170-300）購自Galaxy公司；臺式冷凍離心機（Eppendorf-5810R）購自Eppendorf公司；26 G無菌靜脈留置針購自平民藥業(yè)官方旗艦店。

1.2 方法

1.2.1 小鼠外周血和膀胱組織單個核細胞制備小鼠外周血單個核細胞的分離：眼球取血，肝素抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心后Hank's液洗滌，細胞計數(shù)后用完全RPMI1640重懸為2×106個/ml用于后續(xù)實驗。膀胱組織單個核細胞制備：腹腔注射4%水合氯醛，眼眶取血后進行心臟灌注，用剪刀和鑷子分離膀胱組織，Hank's液洗滌，剪刀充分剪碎組織，0.02 g/ml膠原酶Ⅰ型消化2 h，100μm濾網(wǎng)過濾，隨后配制70%和40%Percoll溶液進行密度梯度離心，Hank's液洗滌，用完全RPMI1640培養(yǎng)基重懸為2×106個/ml用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將MB49細胞培養(yǎng)于T-75培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中每2～3 d換液，當(dāng)細胞長至培養(yǎng)瓶90%以上時，使用0.25%胰蛋白酶消化3 min，臺盼藍計數(shù)后將細胞用無菌1×PBS重懸為1×107個/ml備用。

1.2.3 原位膀胱癌模型的建立 4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，26 G靜脈留置針外涂液體石蠟油后無菌經(jīng)尿道插入膀胱，PBS沖洗膀胱1次，0.1 ml胰蛋白酶灌注入膀胱并保留20 min，隨后用PBS沖洗2次，注入0.1 ml MB49細胞懸液并使小鼠仰臥。

1.2.4 小鼠體內(nèi)標記CD45熒光抗體 固定小鼠，將配好的200μl CD45熒光抗體（抗體∶PBS=1∶50）通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，5 min后進行眼球取血、心臟灌注等操作。

1.2.5 流式細胞術(shù) 表面分子染色：將小鼠外周血和膀胱細胞用含0.1%BSA的1×PBS洗滌2次后加入熒光標記的表面分子染色抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌2遍，等待上機檢測。細胞因子染色：表面分子染色結(jié)束后，洗滌1次，加入4%PFA室溫避光固定8 min，再洗滌2次，加入含0.1%的BSA和Saponin的1×PBS 4℃過夜，洗滌1次，加入相應(yīng)的胞內(nèi)染色抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌2次，重懸，流式細胞術(shù)檢測并分析。

1.2.6 HE、免疫組化和免疫熒光染色 小鼠膀胱使用中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，脫蠟和水化，隨后用蘇木素，伊紅染色。免疫組化和免疫熒光染色用pH6.0檸檬酸鈉抗原修復(fù)液微波修復(fù)30 min，滴加10%山羊血清封閉，滴加一抗4℃過夜，滴加二抗，37℃反應(yīng)30 min，組化滴加DAB顯色液后顯微鏡下觀察出現(xiàn)棕黃色顆粒時終止，中性干膠封片。免疫熒光滴加抗熒光猝滅液封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0以及GraphPad Prism8軟件進行制圖與統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素t檢驗分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠膀胱組織中非循環(huán)T細胞的分布 小鼠尾靜脈注射抗CD45的熒光抗體，5 min后進行心臟灌注，然后分離膀胱，脾和外周血中的細胞，流式細胞術(shù)分析非循環(huán)T細胞（CD45-CD3+）和循環(huán)T細胞（CD45+CD3+）的比例（圖1A）。外周血中99.6%的T細胞是CD45+CD3+細胞，小鼠膀胱和脾中CD45-CD3+的非循環(huán)T細胞占99%以上（圖1B）。表明小鼠膀胱組織中的T細胞是非循環(huán)的T細胞。

圖1 非循環(huán)和循環(huán)T細胞在正常小鼠膀胱、脾和血液中的比較Fig.1 Comparisons of non-circulating and circulating T cells in bladder，spleen and blood of normal mice

2.2 小鼠膀胱組織與外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T和γδT細胞的表達差異 分離小鼠膀胱和外周血單個核細胞，流式染色后分析CD3+T、CD4+T、CD8+T和γδT細胞的比例。去除黏連體和死細胞干擾后結(jié)果顯示，外周血中的CD3+T細胞比例為48.30%［（48.18±1.90）%］，顯著高于膀胱組織中CD3+T細胞比例38.30%［（34.48±4.22）%］，同時外周血中的CD4+T細胞比例為65.10%［（65.46±1.76）%］，顯著高于膀胱組織中的CD4+T細胞比例30.90%［（29.04±1.16）%］，外周血中的CD8+T細胞比例為32.30%［（32.20±0.83）%］，明顯高于膀胱組織中CD8+T細胞比例20.10%［（20.04±0.25）%］，而膀胱組織中的γδT細胞比例為35.50%［（33.56±3.38）%］，顯著高于外周血中γδT細胞比例1.85%［（1.51±0.37）%］（圖2A、B），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 小鼠膀胱組織和外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T和γδT細胞百分比Fig.2 Percentages of CD3+T，CD4+T，CD8+T andγδT cells in murine bladders and blood

2.3 小鼠膀胱組織與外周血中組織記憶T細胞的分布情況 為了明確膀胱組織中非循環(huán)T細胞和外周血循環(huán)T細胞的表型差異，流式細胞術(shù)分析記憶細胞標志分子CD44的表達。流式結(jié)果顯示，小鼠膀胱組織中CD44+T的比例為93.50%［（92.48±1.20）%］，顯著高于外周血CD44+細胞的比例22.50%［（22.68±1.67）%］（圖3A、B）。進一步分析小鼠膀胱組織與外周血中T細胞表達組織駐留分子CD69和CD103的情況，發(fā)現(xiàn)小鼠膀胱組織CD3+CD44+、CD4+CD44+、CD8+CD44+和γδT+CD44+細胞均高表達CD69+CD103+和CD69+CD103-的TRM亞群，外周血CD3+CD44+、CD4+CD44+、CD8+CD44+和γδT+CD44+細胞均高表達CD69-CD103+的TRM亞群。而膀胱組織中CD3+CD44-、CD4+CD44-、CD8+CD44-和γδT+CD44-細胞與外周血相比，也均高表達CD69+CD103+和CD69+CD103-的TRM亞群。綜上說明小鼠膀胱組織中無論是記憶還是非記憶的T細胞均表達組織駐留分子CD69和CD103（圖3C、D），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 膀胱組織和外周血中T細胞CD69和CD103的表達Fig.3 Expressions of CD69 and CD103 on T cells from bladders and blood

2.4 小鼠膀胱組織和外周血中T細胞亞群表達CXCR3和CXCR5的分析 與外周血相比，膀胱組織中CD3+T、CD4+T、CD8+T和γδT細胞顯著高表達趨化因子受體CXCR3和CXCR5（圖4A、B），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 CXCR3和CXCR5在外周血和膀胱組織T細胞亞群中的表達分析Fig.4 Expressions of CXCR3 and CXCR5 on T cell subsets in blood and bladder tissues

2.5 小鼠膀胱組織和外周血T細胞產(chǎn)生細胞因子IL-17、IFN-γ和TNF-α的差異比較 流式結(jié)果顯示，經(jīng)PMA和ionomycin刺激后，與外周血相比，小鼠膀胱組織中的CD3+T、CD4+T、CD8+T和γδT細胞均顯著高表達IL-17和TNF-α，此外CD4+T還高表達IFN-γ（圖5A、B），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 小鼠血液和膀胱組織中T細胞表達細胞因子IL-17、IFN-γ和TNF-α的差異Fig.5 Differencesin expressionsof cytokines IL-17，IFN-γ and TNF-αin T cell subsets from bladder tissues and blood

2.6 MB49原位膀胱癌小鼠和對照小鼠膀胱體積、形態(tài)和小鼠體重的比較 正常對照小鼠膀胱與MB49小鼠原位膀胱癌小鼠膀胱平均體積分別為（12.30±2.45）mm3和（138.80±25.08）mm3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖6A）。正常小鼠體重逐漸上升，MB49原位膀胱癌小鼠的體重第6天開始逐漸下降（圖6B）。兩組膀胱組織分別石蠟包埋，切片，HE染色觀察，結(jié)果顯示，MB49原位膀胱癌小鼠膀胱結(jié)構(gòu)破壞，膀胱腔隙血供豐富，腫瘤占位，有核細胞明顯增多（圖6C）。

圖6 MB49原位膀胱癌小鼠和正常小鼠的體重和膀胱體積、形態(tài)的比較Fig.6 Comparison of bladder volume，morphology，and body weight between MB49 bladder carcinoma in situ mice and control mice

2.7 正常小鼠和MB49原位膀胱癌小鼠膀胱組織中CD3+T和γδT細胞的組織學(xué)分布 免疫組化提示，正常小鼠膀胱組織CD3+T主要分布在膀胱肌層和膀胱黏膜上皮層。MB49原位膀胱癌小鼠的膀胱腫瘤區(qū)域CD3+T表達比較集中，免疫熒光染色觀察到MB49原位膀胱癌小鼠的膀胱腫瘤區(qū)域CD3+T和γδT細胞的表達（圖7）。

圖7 正常小鼠膀胱和MB49原位膀胱癌小鼠膀胱組織中CD3+T和γδT細胞的組織學(xué)分布Fig.7 Histological distribution of CD3+T andγδT cells in MB49 bladder and control bladder tissues

2.8 MB49原位膀胱癌和正常小鼠膀胱T細胞表型和細胞因子比較 如圖8所示，MB49原位膀胱癌小鼠膀胱組織中CD8+T和γδT比例升高，CD4+T比例顯著下降，MB49原位膀胱癌小鼠膀胱組織中CD3+T、CD4+T、CD8+T和γδT細胞均顯著高表達IFN-γ，其中γδT細胞還顯著高表達IL-17和TNFα、CD3+T、CD4+T則顯著高表達TNF-α，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖8 MB49小鼠膀胱和正常小鼠膀胱T細胞亞群和細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17的比較Fig.8 Comparison of T cell subsets and expression of IFN-γ，TNF-αand IL-17 on T cells in MB49 bladders and control bladders

3 討論

T細胞在抗感染和癌癥方面有著十分重要的作用，通過聯(lián)體共生實驗發(fā)現(xiàn)一群駐留在組織不參與血液循環(huán)的細胞其表達：CD44、CD69和CD103，命名為TRM。隨后相繼在皮膚，腸道，肝，腎等組織中研究功能及作用，并發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中TRM細胞與臨床預(yù)后相關(guān)，預(yù)測TRM細胞在癌癥疫苗和腫瘤免疫治療中發(fā)揮的重要作用，可能是未來免疫治療成功的關(guān)鍵［10-14］。有研究指出膀胱內(nèi)注射γδT細胞可以抑制小鼠膀胱癌的生長［15］。本課題組研究證明小鼠膀胱組織中含有αβT細胞和γδT細胞，表達記憶分子CD44，組織駐留標志分子CD69和CD103，高表達趨化因子受體CXCR3和CXCR5。此外發(fā)現(xiàn)正常小鼠膀胱中的γδT細胞顯著高于外周血，并高表達細胞因子IL-17和TNF-α，猜測膀胱組織中的TRM細胞在抗膀胱癌免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。

眾所周知膀胱癌是一種異質(zhì)性疾病，根據(jù)是否侵犯逼尿肌將其分為肌層浸潤性膀胱癌（muscleinvasive bladder cancer，MIBC）和非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）。NMIBC約占新診斷膀胱癌的70%，并且考慮到需要反復(fù)內(nèi)鏡評估和切除，其是治療護理花費最昂貴的惡性腫瘤之一［16］。NIMBC的標準治療方式是經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)，術(shù)后進行膀胱灌注治療可以顯著降低復(fù)發(fā)率。而MIBC最有效的治療是根治性膀胱癌切除術(shù)，同時需要對盆腔淋巴結(jié)清掃，尿道改道，是較為復(fù)雜的手術(shù)，盡管如此，仍然有約50%的患者最終會因為播散性微轉(zhuǎn)移而在遠處發(fā)生腫瘤［17-18］。

進一步小鼠MB49原位膀胱癌模型研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比腫瘤模型小鼠CD4+T細胞降低，CD8+T和γδT細胞明顯升高，CD8+T分泌高水平細胞因子IFN-γ，γδT細胞高分泌IFN-γ、TNF-α和IL-17，免疫熒光提示腫瘤區(qū)域集中表達γδT細胞。本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠膀胱癌發(fā)生過程中，可趨化CD8+T和γδT細胞，且其在膀胱癌內(nèi)分泌高水平細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17。

綜上所述，膀胱組織中的TRM可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在膀胱癌進展中趨化因子受體和細胞因子發(fā)揮著非常重要的作用。本實驗探究膀胱駐留T細胞的表型和細胞因子對進一步研究膀胱癌有著十分重要的意義，也為組織駐留γδT細胞在膀胱癌免疫治療中的作用提供理論基礎(chǔ)。