劉旭

(沈陽市紅十字會(huì)醫(yī)院，遼寧 沈陽 110013)

大蒜素衍生物烯丙基半胱氨酸(SAC)是一種含硫氨基酸，YEH等[1]認(rèn)為SAC能抑制肝細(xì)胞中膽固醇的合成而具有降低血漿膽固醇的作用。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明SAC具有抗腫瘤的作用[2]。此外，SAC具有清除自由基和抗氧化的作用[3]。殼聚糖(chitosan，CS)由于具有良好的生物相容性、生物降解性廣泛用作藥物載體[4]，用于藥物的緩釋或控釋，促進(jìn)藥物的吸收[5-6]，但其分子量大，只能溶解于酸性水溶液，在生理pH下無法溶解[7-8]。消化道內(nèi)水解糖苷的殼聚糖酶[9]缺乏，也導(dǎo)致其在體內(nèi)吸收困難。殼寡糖又名殼聚寡糖，學(xué)名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺，是殼聚糖經(jīng)特殊的生物酶技術(shù)處理得到的全新產(chǎn)品，具有水溶性好、生物活性高、分子量低的特點(diǎn),在一定程度上提高了其在生理?xiàng)l件下的溶解度[10-11]。殼寡糖因含有游離氨基，能結(jié)合氫離子帶正電荷，其氨基亦能與芳香醛或脂肪醛反應(yīng)生成希夫堿，交聯(lián)產(chǎn)物不易溶解，溶脹小，性質(zhì)穩(wěn)定。殼寡糖具有生物粘附性，可完全吸收，生物相容性好，被多種酶類降解，降解產(chǎn)物安全無毒。烯丙基半胱氨酸由于極性較大，水溶性較大，在體內(nèi)溶出快、吸收快、消除快，療效維持時(shí)間較短，須多次給藥維持體內(nèi)有效血藥濃度。本文利用無不良反應(yīng)的三聚磷酸鈉(TPP)對(duì)殼寡糖進(jìn)行離子誘導(dǎo)凝膠化形成納米粒[12]。在室溫?cái)嚢柘?，將TPP溶液滴加到殼寡糖水溶液中，通過帶負(fù)電的磷酸根離子與殼寡糖分子鏈上帶正電的質(zhì)子化氨基發(fā)生分子內(nèi)、間交聯(lián)凝膠化，可迅速生成納米粒。離子凝膠化法反應(yīng)條件溫和，易于調(diào)控反應(yīng)結(jié)果，具有較高的包封率并能很好保持藥物的生物活性[13]。

1 SAC殼寡糖亞微球的制備

1.1溶液的配置 將殼寡糖分散于蒸餾水溶液中，隔夜溶脹，5000 r/min離心除去不溶物質(zhì)，配成10.0 mg/mL的殼寡糖貯備溶液。TPP溶于蒸餾水配成1.0 mg/mL的TPP貯備液溶液，分別經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過備用。

1.2亞微球制備過程 取2.5 mg/mL的殼寡糖溶液2 mL，置10 mL的西林瓶中。以1 mL注射器精密吸取適量體積的TPP含藥溶液。在高速磁力攪拌下，以一定速度用注射器緩慢加入殼寡糖溶液中，攪拌30 min，即得SAC殼寡糖亞微球溶液。

2SAC殼寡糖亞微球處方研究 選擇以殼寡糖(CS)濃度、SAC濃度、CS與TPP的質(zhì)量比，反應(yīng)溶液的pH值作為考察對(duì)象，以包封率和粒徑為考察指標(biāo)，篩選合適的處方。

2.1CS與TPP質(zhì)量比的影響 固定CS濃度為2.5mg·mL-1，TPP濃度增加，成球越來越容易，TPP濃度增加到一定程度即生成沉淀，殼寡糖與TPP交聯(lián)到一起形成較大直徑的顆粒。用硫酸鈉絡(luò)合法和用戊二醛共價(jià)交聯(lián)法制備殼寡糖亞微球(CS-SM)，均是在特定濃度范圍內(nèi)，一定的質(zhì)量比才生成亞微球[14-15]。

Fig.1 Influence of CS and TPP ratios on the EE(%)of CS-SM

Fig.2 Influence of CS and TPP ratios on the mean particle size(nm)of CS-SM

由結(jié)果可知，當(dāng)CS∶TPP在5∶1至7∶1時(shí)，可以形成粒徑較小及包封率較高的殼寡糖亞微球，7∶1時(shí)包封率達(dá)到75%以上。包封率與CS與TPP的比值有顯著的相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)，隨著比值的增大而增大，達(dá)到一定值時(shí)包封率下降。粒徑隨著CS與TPP的比值減小而增大，當(dāng)增大至一定程度時(shí)，會(huì)形成沉淀。根據(jù)溶液的粒徑分布情況以及包封率，確定CS∶TPP的質(zhì)量比為7∶1。

2.2CS與TPP濃度的影響 CS濃度對(duì)亞微球的包封率與粒徑影響較大。固定CS和TPP二者的質(zhì)量比為7∶1，改變CS和TPP的濃度，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)亞微球只在特定的CS和TPP濃度范圍內(nèi)形成[16]。兩者濃度過低時(shí)，溶液呈清亮而無膠粒生成；兩者濃度過高時(shí)，會(huì)生成較大粒徑的聚集體，經(jīng)放置后易沉淀。最終確定CS的濃度為2.5 mg·mL-1，此時(shí)包封率可達(dá)75%以上，粒徑為149 nm。

Fig.3 The effect of different concentration of CS on particle size(nm)of SPRC SM

Fig.4 The effect of different concentration of CS on EE(%)of SPRC SM

2.3pH值的影響 配制濃度為2.5 mg·mL-1的殼寡糖溶液，CS/TPP質(zhì)量比為7∶1，反應(yīng)結(jié)束后以10%乙酸或NaOH調(diào)節(jié)體系pH值為3.0，4.0，5.0，6.0，結(jié)果見圖5。隨著pH值的增大，粒徑略增加，使用蒸餾水作為溶劑即可得到較高的包封率，并達(dá)到較理想的粒徑范圍，所以選擇蒸餾水作為溶劑。

Fig.5 The influence of PH value on the EE(%)of CS-SM

2.4藥物濃度對(duì)包封率的影響 由于亞微球的形成是利用殼寡糖的游離氨基與TPP陰離子發(fā)生分子間或分子內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)，所以當(dāng)殼寡糖和TPP的用量一定時(shí)，包裹的藥物量是有限的。藥物的濃度考察結(jié)果見圖6，當(dāng)藥物的投藥量較小時(shí)，具有較好的包封率，隨著投藥量增加，包封率下降，最終選定藥物濃度為2.5 mg·mL-1。

Fig.6 The effect of the concentration of SAC(mg?mL-1)on EE(%)of CS-SM

2.5攪拌速度的影響 TPP溶液在攪拌條件下緩慢滴加到殼寡糖溶液中，攪拌的目的是迅速分散滴加到殼寡糖溶液中的TPP，避免出現(xiàn)局部TPP濃度過高，與大量殼寡糖分子產(chǎn)生凝聚，導(dǎo)致亞微球粒徑過大。攪拌速度過快，容易使液體飛濺，造成藥液的損失，因此確定攪拌速度為500 r·min-1。

2.6溫度的影響 在制備殼寡糖亞微球的過程中，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃以上時(shí)，溶液出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，溫度越高，越不利于殼寡糖亞微球的形成，因此實(shí)驗(yàn)應(yīng)于室溫下進(jìn)行。

3 殼寡糖亞微球的表征

3.1粒徑及粒度分布測(cè)定 根據(jù)優(yōu)化得到的最優(yōu)處方制備5份SAC亞微球樣品，水化后，采用激光粒度測(cè)定儀分別測(cè)定粒徑大小和分布情況，測(cè)得粒徑(149.00±15.1)nm。圖7表明水化后亞微球的粒徑分布情況。

Fig.7 Particle size distribution of SAC chitosan sub microspheres

3.2SAC殼寡糖亞微球ξ-電位的測(cè)定 測(cè)定結(jié)果表明，本研究制得的亞微球帶正電荷，測(cè)定值為31.5±0.23mV(mean±SD)，體系相對(duì)穩(wěn)定。

Fig.8 Zeta potential of SAC Chitosan sub microspheres

3.3SAC亞微球的在不同pH下的體外釋放 分別考察pH1.2、pH5.5、pH7.4與蒸餾水中的釋放曲線。結(jié)果表明在酸性條件下藥物很快釋放，在堿性條件下藥物帶負(fù)電，與帶正電的殼寡糖產(chǎn)生較強(qiáng)烈的吸附作用，所以釋放較慢，在pH接近pI時(shí)，釋放較慢，24 h累積釋放度為60%。蒸餾水中亞微球表現(xiàn)出一定的緩釋效果，18 h的累積釋放達(dá)85 %。

Fig.9 Release Profiles of SAC from SAC chitosan sub microspheres in PBS(pH7.4)at 37℃.

3.4釋放曲線模型擬合 分別用零級(jí)、一級(jí)和Higuchi方程對(duì)釋放曲線進(jìn)行擬合，SAC亞微球體外釋放模型擬合程度為Higuchi模型>First-order模型> Hixson-Crowell模型> Zero-order模型，所以殼寡糖亞微球釋放符合擴(kuò)散與溶蝕相結(jié)合的機(jī)制，以擴(kuò)散為主。亞微球外釋放近似于Higuchi模型，采用Ritger-peppas模型進(jìn)一步分析。0.43

Tab.1 Models for drug release fitting and correlation coefficients of SAC liposomes

4 SAC殼寡糖亞微球的凍干

亞微球在儲(chǔ)存過程中存在物理化學(xué)穩(wěn)定性的問題，聚結(jié)而發(fā)生沉降[17]。為了提高亞微球物理及化學(xué)穩(wěn)定性，可以采用冷凍干燥技術(shù)，將亞微球制成凍干粉末。

4.1預(yù)凍溫度的考察 預(yù)凍溫度采用-55～-70℃，采用超低溫冰箱-70℃急凍。

4.2干燥時(shí)間的考察 對(duì)干燥時(shí)間進(jìn)行考察，由結(jié)果可知，干燥時(shí)間16 h與24 h對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大，為縮短試驗(yàn)周期，最終確定以16 h作為總的干燥時(shí)間。

4.3凍干處方的篩選

4.3.1凍干保護(hù)劑的篩選 試驗(yàn)研究了葡萄糖、甘露醇、右旋糖苷的保護(hù)效果。凍干保護(hù)劑的濃度分別為3%、5%、8%、10%，同時(shí)以不加凍干支持劑的外觀作為對(duì)照。以外觀、再分散性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察各種支持劑的保護(hù)作用。

4.3.1.1外觀 凍干品的外觀是評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，可影響再分散性、放置穩(wěn)定性、包封率等，考察結(jié)果見Tab.2。由試驗(yàn)結(jié)果可知，在無凍干保護(hù)劑與葡糖糖作支持劑時(shí)外觀不飽滿，甘露醇、右旋糖酐均能形成較好外觀。

Tab.2 The appearance of formulations containing different cryoprotectants

4.3.1.2再分散性 樣品的再分散性是保證質(zhì)量的重要考察項(xiàng)目，再分散性好的凍干產(chǎn)品具有好的流動(dòng)性，試驗(yàn)結(jié)果見Tab.3。

Tab.3 Reconstitution of the various cryoprotectant on the character of the freeze-dried product.

與未加保護(hù)劑的亞微球相比，葡萄糖作保護(hù)劑可達(dá)到較好復(fù)溶效果。葡萄糖作為保護(hù)劑，隨著濃度的增加再分散性提高。綜上選擇合用葡萄糖與甘露醇作為凍干保護(hù)劑。對(duì)用量進(jìn)行考察，結(jié)果見表4，確定為3%的葡萄糖與3%的甘露醇。

Tab.4 Research on the dosage of conbined cryoprotectants

5 SAC殼寡糖亞微球初步穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性試驗(yàn)的目的是考察藥物制劑在溫度、濕度、光線、空氣的影響下隨時(shí)間變化的規(guī)律，為藥品的生產(chǎn)、包裝、貯存、運(yùn)輸條件提供科學(xué)依據(jù)。

實(shí)施影響因素試驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果，將自制SAC殼寡糖凍干產(chǎn)品置于60℃恒溫箱、光照強(qiáng)度4500±500Ix中，在相對(duì)濕度為75%，分別于第0、5、10天取樣，檢測(cè)外觀、含量、釋放度，結(jié)果見表5。

Tab.5 Stability of SAC chitosan sub microspheres exposed to high temperature

初步穩(wěn)定性考察結(jié)果表明殼寡糖亞微球?qū)Ω邷孛舾?，顏色變深。光照條件下，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均無明顯變化。本品對(duì)濕度敏感，應(yīng)低溫干燥密閉保存。

6 討論

殼寡糖(CS)是天然多糖，無毒無刺激，組織相容性好。殼寡糖亞微球的作用特點(diǎn)[18]：①藥物緩釋和控釋作用；②增加藥物的吸收作用；③增加藥物靶向性和降低藥物的副作用；④提高藥物穩(wěn)定性。殼寡糖亞微球已被證實(shí)能有效地增強(qiáng)藥物通過鼻腔和腸道粘膜上皮的吸收。殼寡糖是一種安全有效的吸收促進(jìn)劑，能夠粘附于粘膜上皮，延長藥物與上皮組織的接觸時(shí)間，并且可以打開上皮細(xì)胞之間的緊密連接，促進(jìn)藥物通過上皮組織轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高藥物的生物利用度，細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于分子量較大的殼聚糖[19]。

殼寡糖的粒徑、包封率與殼寡糖濃度、殼寡糖與TPP的質(zhì)量比有關(guān)。在一定范圍內(nèi)，隨著殼寡糖濃度的增大、殼寡糖與TPP質(zhì)量比的降低，包封率與粒徑顯著提高，達(dá)到一定值時(shí)，包封率下降。由于形成了更多的分子間氫鍵，更多的分子交聯(lián)在一起，使顆粒粒徑變大，當(dāng)兩者濃度增加到一定程度時(shí)，過大的膠粒變成了沉淀[20]。溫度也對(duì)亞微球的形成有一定的影響，溫度過高不利于亞微球的形成，在低溫狀態(tài)下較易形成亞微球。在較低pH下形成的亞微球粒徑較小，包封率也較低，本文選擇在中性pH下制備亞微球，可以以蒸餾水作為介質(zhì)。殼寡糖在蒸餾水中荷正電，對(duì)于SAC有較高的包封率，所制得的亞微球在蒸餾水中可以緩慢釋藥18h，在堿性條件下可以緩釋24h以上，在酸性條件下釋放較快。

亞微球凍干品以葡萄糖和甘露醇作為凍干保護(hù)劑，可以得到較飽滿的外觀并且再分散性良好，凍干品復(fù)溶后，粒徑變化較小。與脂質(zhì)體相比較，殼寡糖亞微球具有較高的包封率和載藥量，但其對(duì)釋放介質(zhì)的pH較敏感，在較低pH值下釋放較快，如作為口服制劑，在胃內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一定的釋放加快現(xiàn)象。