蘇永健 劉紅娜 杜鑫 張小華 張仙娟

(1.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043；2.陜西創(chuàng)新醫(yī)藥研究中試工程中心有限公司,陜西 西安 710043)

熱炎寧合劑由清華德人西安幸福制藥有限公司獨(dú)家生產(chǎn)，是《中國(guó)藥典》2015年版(一部)收錄品種。熱炎寧合劑由蒲公英、虎杖、北敗醬、半枝蓮4味藥組成。功能為清熱解毒，用于外感風(fēng)熱、內(nèi)郁化火所致的風(fēng)熱感冒、發(fā)熱、咽喉腫痛、口苦咽干、咳嗽痰黃、尿黃便結(jié)、化膿性扁桃體炎、急性咽炎、急性支氣管炎、單純性肺炎見(jiàn)上述證候者[1]?，F(xiàn)代研究證明熱炎寧合劑在治療小兒急性上呼吸道感染及扁桃體發(fā)炎時(shí)療效顯著[2]。最新研究證明熱炎寧合劑能改善新型冠狀病毒肺炎患者臨床癥狀，促進(jìn)胸部CT好轉(zhuǎn)，縮短患者發(fā)熱時(shí)間，提高核酸轉(zhuǎn)陰率[3]。

目前關(guān)于熱炎寧合劑質(zhì)量控制研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要以虎杖、蒲公英、北敗醬、半枝蓮中化學(xué)成分含量檢測(cè)為主。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：虎杖中主要含蒽醌類(lèi)、二苯乙烯類(lèi)、黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)以及一些脂肪酸類(lèi)化合物[4-5]，蒲公英中主要含黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、色素類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)[6-9]，北敗醬中主要含黃酮類(lèi)化合物及酯類(lèi)和烷烴類(lèi)成分、三萜類(lèi)、甾體類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)和有機(jī)酸等[10-13]，半枝蓮中主要含黃酮類(lèi)、二萜類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)及多糖等化學(xué)成分[14-15]。指紋圖譜技術(shù)是近年逐漸發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)質(zhì)量控制技術(shù)，它具有信息量大，特征性強(qiáng)，能整體控制多種組分[16-17]。本實(shí)驗(yàn)參照2015年版《中國(guó)藥典》(一部)及相關(guān)文獻(xiàn)[18-25]，建立了以蒲公英、虎杖、北敗醬、半枝蓮中化學(xué)成分為主要指標(biāo)的HPLC指紋圖譜，通過(guò)共有峰歸屬和指認(rèn)來(lái)控制熱炎寧合劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1260 infinityII型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；AG285型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；L-500型離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司)。

1.2試劑與試藥 虎杖苷(批號(hào)111575-201603，純度87.3%)，大黃素(批號(hào)110756-201512，純度98.7%)，木犀草素(批號(hào)111520-201605，純度99.6%)，咖啡酸(批號(hào)110885-201703，純度99.7%)，綠原酸(批號(hào)110753-201817，純度96.8%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；熱炎寧合劑(清華德人西安幸福制藥有限公司)；色譜乙腈、色譜甲醇(美國(guó)Fisher公司)；磷酸(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；甲醇(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150mm×4.6mm，4μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)；梯度洗脫程序(0-35min，10%-35%A，90%-65%B；35-40min，35%-85%A，65%-15%B；40-45min，85%-100%A，15%-0%B；45-50min，100%-10%A，0%-90%B；50-60min，10%-10%A，90%-90%B)；體積流量0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：305nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備 取大黃素對(duì)照品、虎杖苷對(duì)照品、木犀草素對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品、咖啡酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 1mL含大黃素80μg、虎杖苷350μg、木犀草素60μg、綠原酸90μg、咖啡酸80μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液 量取熱炎寧合劑10mL于離心管中，離心(4000轉(zhuǎn)/min)5分鐘，精密量取2mL上清液，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇90 mL，超聲30min，至室溫后再加甲醇至刻度，搖勻，用0.22μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。10批熱炎寧合劑為清華德人西安幸福制藥有限公司生產(chǎn)，樣品批號(hào)見(jiàn)表1

表1 樣品信息表

2.2.3陰性樣品溶液 參照2015年版《中國(guó)藥典》(一部)熱炎寧合劑提取制備方法，分別制備缺4味藥材的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度考察 用批號(hào)為190318的樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針，以大黃素為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD<3%，相對(duì)保留時(shí)間RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性考察 用批號(hào)為190318的樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，以大黃素為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD<3%，相對(duì)保留時(shí)間RSD<1%，表明供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 用批號(hào)為190318的樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以大黃素為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD<3%，相對(duì)保留時(shí)間RSD<2%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4指紋圖譜建立

2.4.1共有峰標(biāo)定 選取大黃素為參照峰，色譜圖中各色譜峰保留時(shí)間與參照峰(S)保留時(shí)間的比值為相對(duì)保留時(shí)間，通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間值標(biāo)定共有峰，其中13個(gè)峰為10批樣品共有，標(biāo)定為共有峰，共有峰見(jiàn)圖1。

圖1 10批熱炎寧合劑樣品HPLC圖

2.4.2相似度評(píng)價(jià) 共有峰通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)分析，中位數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖2。10批樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均在0.980以上，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 對(duì)照指紋圖譜

表2 相似度分析結(jié)果

2.4.3專屬性考察 分別吸取4種陰性樣品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖3。通過(guò)與陰性樣比較可以得出1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)峰歸屬北敗醬及蒲公英(北敗醬及蒲公英化學(xué)成分相似)，4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、10號(hào)、11、號(hào)12號(hào)、13號(hào)歸屬虎杖，8號(hào)峰歸屬半枝蓮，9號(hào)峰屬歸北敗醬。

S1:熱炎寧合劑 S2：虎杖陰性樣 S3：半枝蓮陰性樣 S4：蒲公英陰性樣 S5：北敗醬陰性樣

2.4.4共有峰指認(rèn) 吸取2.2.1項(xiàng)對(duì)照品溶液及2.2.2供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖4。通過(guò)對(duì)照品對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)：2號(hào)峰為綠原酸, 3號(hào)峰咖啡酸, 4號(hào)峰為虎杖苷，9號(hào)峰為木犀草素，13號(hào)峰為大黃素，共指認(rèn)5個(gè)共有峰。

A對(duì)照品HPLC圖

3 討論

本試驗(yàn)采用不同濃度乙醇及甲醇分別對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理，并對(duì)超聲時(shí)間等條件進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用甲醇超聲處理30 min后，色譜基線更平穩(wěn)，峰數(shù)量較多，因此本實(shí)驗(yàn)采用甲醇超聲處理30 min進(jìn)行樣品制備。本實(shí)驗(yàn)用甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈0.4%磷酸分別做梯度洗脫考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙腈-0.1%磷酸進(jìn)行梯度洗脫，色譜基線平穩(wěn)，各峰分離度較好，因此采用乙腈-0.1%磷酸作為梯度洗脫流動(dòng)相。本研究還對(duì)流速，檢測(cè)波長(zhǎng)，柱溫等進(jìn)行了考察，最后選定流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：305nm；柱溫30℃。

《中國(guó)藥典》2015版一部中熱炎寧合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，只對(duì)虎杖進(jìn)行了薄層鑒別，含量測(cè)定項(xiàng)也只針對(duì)虎杖中的大黃素及虎杖苷進(jìn)行測(cè)定，對(duì)處方中蒲公英、北敗醬、半枝蓮沒(méi)有制定控制項(xiàng)目，不能全面控制熱炎寧合劑質(zhì)量。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)樣品處理方法，色譜條件的考察，通過(guò)10批樣品檢測(cè)建立對(duì)照指紋圖譜，確認(rèn)13個(gè)共有峰，通過(guò)陰性樣品比對(duì)，將13個(gè)共有峰分別歸屬于4種藥材，本方法較全面反映了熱炎寧合劑中各種成分的分布和比例關(guān)系，對(duì)更好控制熱炎寧合劑質(zhì)量發(fā)揮重要作用。