陸 娜，宋吉玲，周小華，沈漢斌，袁衛(wèi)東*

(1. 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024；2. 桐廬縣農(nóng)林技術(shù)推廣中心，浙江 桐廬 311599；3. 嘉善縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,浙江 嘉善 314100)

【研究背景】雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)又稱白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇[1]，它是世界性栽培和消費(fèi)的菇類，是世界上生產(chǎn)量最大的食用菌[2]，有“世界菇”之稱。浙江省作為全國(guó)雙孢蘑菇主產(chǎn)區(qū)之一，工廠化栽培逐漸成為主要栽培方式，產(chǎn)量高，質(zhì)量?jī)?yōu)，且能周年生產(chǎn)。雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)與農(nóng)法栽培一樣整個(gè)生長(zhǎng)過程中伴隨著土壤，覆土層微生物的生長(zhǎng)繁殖變化與雙孢蘑菇原基形成有著密不可分的關(guān)系[3-4]。而覆土層中對(duì)雙孢蘑菇生長(zhǎng)有益的微生物細(xì)菌，其產(chǎn)生的不耐熱代謝物能夠刺激子實(shí)體原基的形成[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Visscher[6]、Rainey[7]等人研究得出致腐假單胞桿菌會(huì)促進(jìn)雙孢蘑菇從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化，John報(bào)道在雙孢蘑菇子實(shí)體形成機(jī)制的調(diào)節(jié)時(shí)發(fā)現(xiàn)有40種細(xì)菌，大多數(shù)為假單胞菌，在無菌培養(yǎng)料中能誘導(dǎo)子實(shí)體的形成，并提出這些細(xì)菌能消除菌絲體生長(zhǎng)期產(chǎn)生的一些自抑物質(zhì)，促進(jìn)菌絲從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的假說[8]。其中，假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、固氮菌屬、鏈霉菌屬對(duì)菌絲長(zhǎng)勢(shì)、長(zhǎng)速和子實(shí)體發(fā)育均有明顯促進(jìn)作用[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】“冷卻—降溫”是工廠化栽培雙孢蘑菇催蕾的重要階段，目的就是模擬自然界中夏季到秋季的轉(zhuǎn)變過程刺激雙孢蘑菇由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)(菌絲體生長(zhǎng))轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)(子實(shí)體生長(zhǎng))，對(duì)降溫時(shí)機(jī)的把控和溫度的精確控制，與后期出菇的產(chǎn)量和質(zhì)量關(guān)系密切[11]。微生物是雙孢蘑菇覆土層的重要組成部分[12],采用不同的“冷卻—降溫”處理會(huì)讓雙孢蘑菇覆土層微生物多樣性產(chǎn)生更替，使其微生物構(gòu)成發(fā)生變化，而這些變化都會(huì)不同程度的影響到雙孢蘑菇的生長(zhǎng)發(fā)育。微生物多樣性是基于 Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。通過對(duì) Reads 拼接過濾，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品的物種構(gòu)成；進(jìn)一步進(jìn)行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析和顯著物種差異分析等，可以挖掘樣品之間的差異。目前，微生物多樣性研究主要是在編碼核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)進(jìn)行的，細(xì)菌主要是基于16S區(qū)。目前，浙江地區(qū)工廠化雙孢蘑菇栽培中降溫催蕾時(shí)長(zhǎng)以6 d左右為主，但并無文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)機(jī)理研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，本試驗(yàn)在雙孢蘑菇生長(zhǎng)催蕾期選取4、6和8 d 3種時(shí)長(zhǎng)，將培養(yǎng)溫度由25 ℃勻速降至17.5 ℃對(duì)雙孢蘑菇進(jìn)行變溫培養(yǎng)，刺激催蕾，對(duì)其覆土層的細(xì)菌群落進(jìn)行生物多樣性分析，揭示不同變溫時(shí)長(zhǎng)下雙孢蘑菇覆土層的物種構(gòu)成， 挖掘采用不同變溫措施之間的差異，以期為雙孢蘑菇“冷卻-降溫”過程中選用最佳變溫催蕾時(shí)長(zhǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雙孢蘑菇催蕾期不同變溫時(shí)長(zhǎng)的處理

雙孢蘑菇培養(yǎng)料取自浙江省嘉善寧遠(yuǎn)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，栽培品種為W192，培養(yǎng)料配方：麥草53%、雞糞40%、石膏4.4%、花生粕2.5%，尿素0.1%，覆土材料為純草炭土。培養(yǎng)料處理方法一致，選取堆料、發(fā)酵、上架及播種時(shí)間一致的3個(gè)蘑菇出菇房，在催蕾過程中分別以降溫時(shí)長(zhǎng)為4、6、8 d 3個(gè)時(shí)間段從25 ℃勻速降到17.5 ℃進(jìn)行處理。

1.2 樣品采集

分別對(duì)搔菌前(A)、降溫前(B)、降溫4 d(C)、6 d(D)、8 d(E)和采收期(F)6個(gè)時(shí)間段的雙孢蘑菇覆土層進(jìn)行采集，在菇房?jī)?nèi)不同出菇層架取樣，每層取3個(gè)點(diǎn)，約200 g，將所有樣品均勻混合后從中取50 g，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。采收后的樣品立即存入液氮速凍轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA提取及測(cè)序處理

提取和純化各處理土樣總基因組DNA后，對(duì)16S V3+V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R(5’-GGACTACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)[13]。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min， 95 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，包含測(cè)序序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息的結(jié)果以FASTQ文件格式保存。

1.4 生物信息分析流程

根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，使用 FLASH v1.2.7軟件將測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列Tags，使用 Trimmomatic v0.33軟件，對(duì)拼接得到的 Raw Tags進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)，同時(shí)使用 UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。按照97%相似性進(jìn)行OTU聚類，通過對(duì)SILVA、UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU的代表物種[14]?；贠TU的分析結(jié)果，采用對(duì)樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽取的方法，進(jìn)行Alpha多樣性分析[15-16]，并作出相應(yīng)的稀釋曲線[17]。采用非度量多維標(biāo)定法(NMDS)通過QIIME軟件進(jìn)行 Beta 多樣性分析[18]，比較不同變溫處理在物種多樣性方面存在的相似程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢蘑菇覆土層細(xì)菌群落OTU劃分

通過對(duì)雙孢蘑菇所有階段土壤樣品測(cè)序共獲得 3009 758對(duì)高質(zhì)量測(cè)試序列，雙端測(cè)試序列拼接、過濾后共產(chǎn)生2753 152條優(yōu)化序列數(shù)，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生48 594條優(yōu)化序列數(shù)，平均產(chǎn)生65 551條優(yōu)化序列數(shù)。數(shù)據(jù)表明在所有樣本中共產(chǎn)生572個(gè)OTUS(圖1)，其中變溫期間C、D、E分別獲得了567、569、566個(gè)OTUs。從種群來看(圖2)，變溫期間C、D、E單獨(dú)比對(duì)，有288個(gè)共有種群，在8 d降溫和6 d降溫2個(gè)處理中分別有1個(gè)和2個(gè)獨(dú)有種群。

2.2 不同變溫處理下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

將所有OTU代表序列與參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)可知，從搔菌到第一潮菇采收的過程中細(xì)菌分屬于14門、31綱、72目、117科、217屬、290種。按照不同變溫處理下的樣本細(xì)菌種群在屬水平的分類中，物種數(shù)量排在前10位的分別是假單胞菌屬Pseudomonas、蛭弧菌屬Bdellovibrio、根瘤菌屬Allorhizobium-Neorhizobium-Parahizobium-Rhizobium、黃桿菌屬Flavobacterium、短波單胞菌屬Brevundimonas、裂桿菌Pedobacter、腐敗桿菌屬Peredibacter、諾維赫巴螺菌屬Noviherbaspirillum、德沃西亞菌屬Devosia和噬氫菌屬Hydrogenophaga。其中采用4 d變溫處理中假單胞菌屬所占的比例最高，為21.2%，且隨著變溫時(shí)長(zhǎng)的增加呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)；蛭弧菌屬情況相反，8 d變溫時(shí)長(zhǎng)下的比例最高，為15.2%，且呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)；根瘤菌屬4和8 d比例均為5.8%，高于6 d的5.14%，后續(xù)排名的細(xì)菌種群比例相差不大(圖3)。

將前50位的細(xì)菌屬進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從圖4中可見,進(jìn)化樹中每條樹枝代表一個(gè)物種，樹枝長(zhǎng)度為兩個(gè)物種間的進(jìn)化距離，即物種的差異程度，相同顏色的代表屬于同一種屬門，結(jié)果表明其中30種屬于變形菌門Proteobacteria， 14種屬于擬桿菌門Bacteroidetes，其余6種屬于厚壁菌門Firmicutes和放線菌門Actinobacteria。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，包括許多病原菌，擬桿菌門生活在動(dòng)物腸道類，是糞便的主要微生物種類，主要來源是雙孢蘑菇生產(chǎn)中原料是雞糞、牛糞。

2.3 不同變溫處理下細(xì)菌的Alpha多樣性分析

稀釋曲線反映了采用不同變溫處理持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率，如圖5所示，在0～40 000條數(shù)范圍內(nèi)，OTU數(shù)目呈上升趨勢(shì)，測(cè)序數(shù)目在0～10 000條數(shù)時(shí)，曲線表現(xiàn)為急劇上升，表示此階段群落中有大量新物種被檢測(cè)到，當(dāng)大于10 000條數(shù)后曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨測(cè)序數(shù)量的增加而顯著增多，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，說明本次實(shí)驗(yàn)的測(cè)序量反映出了樣品中絕大部分的物種信息。

本次測(cè)序樣品的OTU覆蓋率均在99.8%以上，說明樣品文庫(kù)的覆蓋率極高，樣品中序列沒有被檢測(cè)出的概率極低，反映本次測(cè)序結(jié)果可以代表樣本中微生物的真實(shí)情況。Alpha多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，有多種衡量指標(biāo)，試驗(yàn)根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標(biāo)的Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)對(duì)不同變溫處理的微生物物種的豐富度和多樣性進(jìn)行了評(píng)估。由表2可以看出，Chao1和Ace指數(shù)在4 d變溫處理下數(shù)值最高，分別為522.58和519.05，并且隨著變溫處理時(shí)長(zhǎng)的增加而遞減，說明在4 d變溫處理下細(xì)菌物種豐度即物種數(shù)量是最多的；Shannon指數(shù)剛好相反，4 d最小，隨著變溫時(shí)長(zhǎng)增加而遞增，在8 d達(dá)到4.37，而Simpson指數(shù)規(guī)律不明顯，6 d最高；Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高[10]，所以8 d變溫處理下樣品的物種多樣性是最高的。

2.4 不同變溫處理下細(xì)菌的Beta多樣性分析

使用QIIME軟件進(jìn)行 Beta 多樣性分析，比較不同變溫處理在物種多樣性方面存在的相似程度，實(shí)驗(yàn)主要采用binary jaccard算法計(jì)算樣品間的距離從而獲得樣本間的β值。非度量多維標(biāo)定法[11](NMDS)是一種適用于生態(tài)學(xué)研究的排序方法，主要是將多維空間的研究對(duì)象(樣本或變量)簡(jiǎn)化到低維空間進(jìn)行定位、分析和歸類，同時(shí)又保留對(duì)象間原始關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法。通過不同變溫處理樣品的分布可以看出它們之間的差異。NMDS分析結(jié)果如圖6所示，圖中點(diǎn)分別表示各樣品，不同顏色代表不同不同變溫處理，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離表示差異程度，Stress數(shù)值為0.1671，表明NMDS分析具有一定的可靠性，從圖中可以看出3種變溫處理下的樣品多樣性相似度較高，但4和8 d變溫處理在坐標(biāo)圖上距離更近，相似性更為一致。

表1 Alpha多樣性指數(shù)

3 討 論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)雙孢蘑菇催蕾期不同變溫時(shí)長(zhǎng)處理樣本中的細(xì)菌核酸序列保守區(qū)(16S：V3+V4)進(jìn)行測(cè)序，得到優(yōu)化序列并進(jìn)行聚類，劃分OTU，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類。基于OTU分析結(jié)果，共獲得 3 009 758 對(duì)高質(zhì)量測(cè)試序列，共產(chǎn)生572個(gè)OTUS、290個(gè)細(xì)菌種群，涵蓋了14門、31綱、72目、117科、217屬、290種。雙孢蘑菇催蕾期間，采用不同的降溫時(shí)長(zhǎng)會(huì)影響細(xì)菌群落在雙孢蘑菇覆土層的生長(zhǎng)速度導(dǎo)致細(xì)菌的含量不同，但不會(huì)影響覆土層細(xì)菌種類的變化。

假單胞菌屬是雙孢蘑菇覆土層中檢測(cè)出含量最高的種群，Reddy[19]等研究表明覆土中假單胞菌的數(shù)量越高雙孢蘑菇產(chǎn)量也越高。惡臭假單胞菌可顯著提高雙孢蘑菇菌絲的生長(zhǎng)速度及誘導(dǎo)并促進(jìn)子實(shí)體的形成和發(fā)育[20]；熒光假單胞菌對(duì)雞腿菇、平菇、雙孢蘑菇等有促生作用，可能是通過其 1-氨基環(huán)丙烷 -1-羧酸 (ACC)脫氨酶降解食用菌產(chǎn)生的 ACC、減少食用菌乙烯的合成及乙烯對(duì)菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體發(fā)育的抑制作用[21-22]。具有固氮作用的根瘤菌屬對(duì)食用菌產(chǎn)量有重要作用[23]。蛭弧菌對(duì)環(huán)境細(xì)菌數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響主要取決于蛭弧菌裂解特性[24]，能夠裂解一些革蘭氏陰性菌，而覆土層中的細(xì)菌群落大部分是革蘭氏陰性菌。OTU聚類結(jié)果顯示隨著催蕾降溫時(shí)長(zhǎng)的增加，假單胞菌屬含量逐漸降低，蛭弧菌屬含量逐漸增加，根瘤菌屬含量在4和8 d時(shí)最高，加之Alpha、Beta多樣性分析結(jié)果反映4 d變溫處理下細(xì)菌物種豐度最多，其假單胞菌屬所占的比例最高，說明降溫時(shí)長(zhǎng)為4 d時(shí)覆土層中的細(xì)菌種群在3個(gè)處理中最適宜雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體形成，但形成的子實(shí)體的數(shù)量個(gè)數(shù)、產(chǎn)量及層次等與降溫時(shí)長(zhǎng)的關(guān)系有待進(jìn)一步的研究。